Summary
हम करने के लिए कदम दर कदम निर्देश का वर्णन: 1) कुशलता से lenti- या retroviral transduction के लिए चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कर आंतों organoids इंजीनियर, और, 2) इंजीनियर organoids से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करते हैं. यह दृष्टिकोण बहाव प्रभाव की जांच के लिए organoids में जीन अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक बदलने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Abstract
आंत्र organoid संस्कृतियों आंतों स्टेम सेल और इन विट्रो में crypt जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं, हालांकि organoids में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए कुशल दृष्टिकोण इस क्षेत्र में सीमित प्रगति की है. जबकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी organoid पीढ़ी के लिए कोशिकाओं के सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देता है, इस रणनीति अनुक्रम विश्लेषण है, जो दोनों समय लेने वाली और महंगा है द्वारा व्यापक चयन और स्क्रीनिंग की आवश्यकता है. यहाँ, हम आंतों organoids के कुशल वायरल transduction के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण तीव्र और अत्यधिक कुशल है, इस प्रकार CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी में निहित समय और व्यय को कम करना। हम भी इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला, जो जीन अभिव्यक्ति या silencing की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ आगे विश्लेषण के लिए बरकरार organoid संस्कृतियों से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। जीन अभिव्यक्ति या silencing के लिए वायरल वैक्टर के सफल transduction के बाद हासिल की है, आंतों स्टेम सेल और crypt समारोह तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि अधिकांश organoid अध्ययन विट्रो परख में रोजगार, organoids भी विवो कार्यात्मक विश्लेषण में के लिए चूहों को दिया जा सकता है. इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण दवाओं के लिए चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए फायदेमंद हैं क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध उपचार आम तौर पर जीनोम बदलने के बजाय जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन समारोह नियमन द्वारा कार्य करते हैं.
Introduction
लंबे समय तक समय अवधि में छोटी आंतों या बृहदान्त्र से तीन आयामी (3 डी) organoids के रूप में माउस या मानव crypts कोशिकाओं संस्कृति की क्षमता एक बड़ी सफलता प्रदान की है क्योंकि इन संस्कृतियों विवो में आंतों उपकला की सुविधाओं को परिभाषित प्रदर्शन 1 , २ , 3. प्राथमिक crypts से व्युत्पन्न organoids स्वयं नवीकरण और आत्म संगठन के लिए सक्षम हैं, मूल के अपने ऊतकों के समान सेलुलर कार्यों का प्रदर्शन. वास्तव में, organoids न केवल विवो में crypts के संरचनात्मक संगठन recapitulate, लेकिन यह भी कई आणविक सुविधाओं, इस प्रकार सामान्य जीव विज्ञान और रोग राज्यों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान. उदाहरण के लिए, ऑर्गनॉइड अध्ययनों से पता चला है कि ऊतक पुनर्जनन1,2,3,4,5 के साथ-साथ ऐसी दवाएं जो कार्य को बढ़ा सकती हैं, में शामिल उपन्यास आण्विक मार्ग पैथोलॉजिकल सेटिंग्समें 6,7.
आंतों स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन विशेष रुचि का है क्योंकि आंतों की परत सबसे अधिक पुनर्योजी स्तनधारी ऊतकों में से एक है, खुद को हर 3-5 दिनों के नवीकरण बैक्टीरिया से जीव की रक्षा के लिए, विषाक्त पदार्थों, और अन्य रोगजनकों के भीतर आंत्र लुमेन्स. आंत्र स्टेम सेल (ISCs) इस उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता के लिए जिम्मेदार हैं और इस प्रकार वयस्क स्टेम सेल समारोह1,2के अध्ययन के लिए एक अद्वितीय प्रतिमान प्रदान करते हैं. चूहों में वंश-ट्रैकिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि अलग Lgr5 सकारात्मक स्टेम कोशिकाओं को 3 डी organoids या 'मिनी गट' इन विट्रो में उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, जहां वे बारीकी से अपने vivo समकक्षों में दर्पण. Organoid संस्कृतियों भी आंतों crypt सेल अलग से प्राप्त किया जा सकता है संतति के शामिल, ISCs, और Paneth कोशिकाओं, जिनमें से बाद विवो में उपकला आला कोशिकाओं का गठन. वास्तव में, प्राथमिक आंतों crypt कोशिकाओं से organoid संस्कृति एक अपेक्षाकृत नियमित तकनीक है कि व्यापक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग कर सबसे प्रयोगशालाओं में लागू करने के लिए आसान है में विकसित किया गया है. यह मॉडल आरएनए-सेक्सिंग (आरएनए-सेक) और प्रोटीन द्वारा द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या इम्यूनोफ्लोरेसेंटधुंधला 2,4,8द्वारा जीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए भी अनुकूल है। इसके अलावा, कार्यात्मक आनुवंशिकी लाभ के समारोह का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (जीन overexpression या एक सक्रिय उत्परिवर्ती जीन की अभिव्यक्ति) या हानि के समारोह (जीन silencing या एक हानि के समारोह उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति) दृष्टिकोण2.
महत्वपूर्ण बात, कम दक्षता और मानक प्लाज्मिड डीएनए या polybrene के साथ वायरल transduction प्रोटोकॉल के उच्च विषाक्तता क्षेत्र में एक बड़ी बाधा बनी हुई है. हालांकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देता है, इस दृष्टिकोण समय लेने वाली चयन अनुक्रम सत्यापन9के बाद की आवश्यकता है. यहाँ, हम प्राथमिक आंतों organoids कि चुंबकीय नैनोकणों और एक चुंबकीय क्षेत्र के आवेदन करने के लिए संयोजन द्वारा वायरल कणों के वितरण का अनुकूलन के लिए एक वायरल transduction प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पूर्व प्रोटोकॉल4,5,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण संशोधन और दक्षता बढ़ाने के लिए सिफारिशें प्रदान की जाती हैं . हम भी 3 डी matricgel में सुसंस्कृत बरकरार organoids से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन (इसलिए आगे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के साथ आगे विश्लेषण के लिए.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल जॉन्स हॉपकिंस चिकित्सा संस्थानों पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था. इस प्रोटोकॉल को पहले प्रकाशित विधियों10,11,12,13से संशोधित किया गया है .
1. अभिकर्मकों की तैयारी
- ताजा 293T माध्यम कई घंटे पहले तैयार करें और उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें (सारणी 1)।
- वायरल पैकेजिंग के लिए प्लाज्मिड डीएनए2,13,14 तैयार करें। (सारणी 2)।
- अन्य सभी आवश्यक सामग्री प्राप्त करें (सामग्री की तालिका)।
2. Lentivirus या रेट्रोवायरस कण उत्पादन
- मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T सेल बोने (दिन 1)
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 एच के लिए फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस; 10 एमएल/डिश) में भंग 50 ग्राम/एमएल पॉली-डी-लाइसिन के साथ कोटिंग द्वारा एक 150 मिमी संस्कृति पकवान तैयार करें।
- फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस)/पॉली-डी-लीसिन निकालें और लेपित डिश को 5 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
- बीज 293T कोशिकाओं (8 $u201210 x 106) में 293T मध्यम (तालिका 1) 15 एमएल की कुल मात्रा के लिए.
- संस्कृति 293T कोशिकाओं एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।
- HEK 293T सेल transfection (दिन 2)
- एक बार कोशिकाओं 70-80% संगम तक पहुँच चुके हैं transfection प्रदर्शन (आमतौर पर के बारे में 24 h बीज बोने के बाद 8$u201210 x 106 कोशिकाओं).
- एक कुशल दृष्टिकोण जैसे कि वाणिज्यिक धनायनिक लिपोसोम तैयार करना (टेबल्स 1 जेडयू20122, सामग्री की तालिका)2का उपयोग करके ट्रांसफेक्शन मिश्रण तैयार करें .
- डिल्यू लेन्टीवायरस डीएनए12 (कुल $24 ग्राम प्लाज्मिड डीएनए , तालिका 2) में 1.2 एमएल ट्रांसफेक्शन मीडियम और इनक्यूबेट में 1.5 एमएल ट्यूब में आरटी में 5 मिनट के लिए (सामग्रीकी तालिका) का निर्माण करता है।
- 1.2 एमएल ट्रांसफेक्शन मीडियम (सामग्रीकीतालिका) में डिल्यूट ट्रांसफेक्शन रीजेंट (36 जेडएल) और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 5 मिनट के लिए 5-एमएल ट्यूबों में इनक्यूबेट।
- ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक (चरण 2.2.2.2) के लिए lentivirus अभिकर्मक जोड़ें (चरण 2.2.2.2) और धीरे से एक 5 एमएल पाइप का उपयोग कर ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण.
- आरटी में 20 मिनट के लिए मिश्रण इनक्यूबेट करें।
- 5 एमएल ट्रांसफेक्शन मीडियम के साथ 293T कोशिकाओं को धीरे से धोएं और 10 एमएल ट्रांसफेक्शन माध्यम से बदलें।
- 293T कोशिकाओं के माध्यम के लिए डीएनए-लिपिड परिसरों (चरण 2.2.2.3) ड्रॉपवार जोड़ें और ध्यान से प्रत्येक डिश में डीएनए-लिपिड परिसरों के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में ले जाकर संस्कृति व्यंजनों में मीडिया मिश्रण।
- एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 6 एच के लिए इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।
- ऊष्मायन के बाद, मीडिया को 20 एमएल ताजा वायरस संग्रह माध्यम (सारणी1) से बदलें।
- वायरस संग्रह (दिन 3$u20125)
- 50 एमएल ट्यूबों में वायरस मीडिया लीजिए, और आगे एकाग्रता के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर।
- ताजा वायरस इकट्ठा करने के 20 एमएल हर 24 एच और संस्कृति रात भर बदलें ($24 ज). अगले 2 दिनों में मीडिया संग्रह दोहराएँ (दिन 4$u20125).
- यह सुनिश्चित करें कि दिन 5 के बाद एकत्रित माध्यम की कुल मात्रा $ 60 एमएल (20 एमएल/दिन x 3 दिन) है।
- वायरस एकाग्रता (दिन 5)
- एकत्र मीडिया (60 एमएल) के लिए 5 मिनट 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज। फिर, किसी भी सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एक फिल्टर (0.45 डिग्री मीटर pores) के माध्यम से supernatant गुजरती हैं।
- एक केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई (सामग्री की तालिका) में फ़िल्टर किए गए वायरस मीडिया के 15 एमएल जोड़कर वायरस को ध्यान में रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। क्योंकि वायरस इस फिल्टर के माध्यम से पारित नहीं कर सकते, यह फिल्टर के ऊपरी कक्ष में केंद्रित किया जाएगा.
- ट्यूब (नीचे कक्ष) से प्रवाह के माध्यम से प्रेरित और एक ही केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई के लिए शेष वायरल संग्रह मीडिया supernatant की एक और 15 एमएल जोड़ें. ऊपर के रूप में सेंट्रीफ्यूज (2,500 x g के लिए 15 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस) supernatant से अतिरिक्त वायरस ध्यान केंद्रित करने के लिए।
- वांछित एकाग्रता तक पहुँच गया है जब तक एक एकल ट्रांसड्यूस प्लेट से 60 एमएल मीडिया के लिए एक ही फिल्टर का उपयोग कर प्रक्रिया को दोहराएँ ($ 100 गुना).
नोट: हम आम तौर पर वायरस संग्रह मीडिया के $ 60 एमएल $ 600 $L करने के लिए ध्यान केंद्रित. - फिल्टर के ऊपरी कक्ष से केंद्रित वायरस को 1 एमएल पाइप्ट का उपयोग करके निकालें, फिर एलिकोट और स्टोर 1.5 एमएल ट्यूब में (50 $u201260 $L/tube) बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर। 6-u201212 महीने तक केंद्रित कणों को संग्रहीत करें.
3. अलग Crypts
- स्थानीय IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार सीओ2 का उपयोग कर चूहों Euthanize.
- अपनी पीठ पर ethanized जानवर प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा पेट धोने.
- स्टर्नम से कमर तक एक अनुदैर्घ्य मिडलाइन चीरा प्रदर्शन, पहले त्वचा incising, और फिर चमड़े के नीचे ऊतक.
- पेट से सीकम तक छोटी आंत निकालें।
- छोटी आंत के भीतर ब्याज के क्षेत्रों की पहचान; crypts ग्रहणी, जेजुनम और ileum से अलग किया जा सकता है.
- एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करना, क्रिप्ट वियोजन बफर के साथ अलग छोटी आंत फ्लश (पूर्व ठंडा पीबीएस युक्त 1 एम एम डिथियोथ्रेटोल (डीटीटी), 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (कोई Ca2+ और Mg2+)) एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति डिश में (तालिका 1)
- परिधीय वसा ऊतक निकालें, और खुला या "फिलेट" आंतों के ऊतकों longitudinally एक बाँझ ग्लास प्लेट पर (15 सेमी x 15 सेमी).
- एक सेल खुरचनी का उपयोग कर आंतों उपकला villi धीरे से खत्म.
- छोटी आंत को 2$u20123 सेमी लंबाई-वार खंडों में काटें।
- फ्लैट संदंश (116 मिमी) का उपयोग कर पूर्व ठंडा पीबीएस युक्त एक 15 एमएल ट्यूब करने के लिए ऊतक स्थानांतरण। $ 30 s के लिए हाथ से जोरदार मिलाते हुए ऊतक के टुकड़े धो लें (विपरीत दिशाओं में ट्यूब को हिलाते हुए ]60 बार)।
- पीबीएस को ताज़ा करें और पुन: धो लें जब तक PBS स्पष्ट हो जाता है।
नोट: हम आम तौर पर टुकड़े धोने 2$u20123 बार. - पीबीएस के स्पष्ट होने के बाद मध्यम गति पर कक्षीय शकर पर10 मि.मी.
- जोरदार ढंग से $ 30 एस (विपरीत दिशाओं $60 बार) के लिए हाथ से ट्यूब हिला और एक और 15 एमएल शंकु ट्यूब क्रिप्ट वियोजन बफर युक्त एक और 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए फ्लैट बल्स का उपयोग कर ऊतक हस्तांतरण। बर्फ पर इस अंश को इनक्यूबेट करें। organoid संस्कृति के लिए पहले अंश का उपयोग न करें क्योंकि यह मुख्य रूप से villi शामिल हैं.
- कदम दोहराएँ 3.11-u20123.13 3 के लिए u20124 बार, प्रत्येक अंश इकट्ठा करने और उन्हें बर्फ पर रखकर.
- एक उल्टे माइक्रोस्कोप (4x) के तहत प्रत्येक अंश से 200 डिग्री सेल्सियस नमूने स्कैन करके आंतों crypts के उच्चतम प्रतिशत के साथ समृद्ध है कि अंश का चयन करें। पहले वर्णित के रूप में विशिष्ट आकारिकी द्वारा crypts की पहचान करें (चित्र 1A)10.
नोट: वे आकार में गोल या अंडाकार दिखाई देते हैं और दानेदार Paneth कोशिकाओं होते हैं। इसके विपरीत, विली उंगली की तरह संरचनाओं दानेदार Paneth कोशिकाओं की कमी है (चित्र 1B)कर रहे हैं. - यदि आवश्यक हो तो समान आकार के crypts प्राप्त करने के लिए एक 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से चयनित अंश पास. वैकल्पिक रूप से, अलग Lgr5 + स्टेम कोशिकाओं हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के आधार पर (GFP) अगर चूहों EGFP-Lgr5 + पृष्ठभूमि या एक अन्य उपयुक्त मॉडल है कि Lgr5 + कोशिकाओं की पहचान सक्षम बनाता है पर पार कर रहे हैं2.
- चयनित भिन्न में crypts की कुल संख्या निम्नानुसार गणना करें।
- पिपेट 50 डिग्री सेल्सियस एक हीमोसाइटोमीटर में चयनित अंश के और एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप (4x) का उपयोग कर crypts की संख्या गिनती। एक 48-वेल प्लेट का उपयोग करते समय प्रति अच्छी तरह से $100 crypts रखें transduction प्रयोगों के लिए अनुमति देने के लिए जिसमें 3 $u20126 कुओं जीन silencing या overexpression के लिए प्रयोगात्मक शर्त प्रति transduced किया जाएगा.
- प्रति crypts की संख्या के आधार पर 50 $L, crypt वियोजन बफर की मात्रा की गणना की जरूरत है और एक 1.5 एमएल ट्यूब में उस मात्रा हस्तांतरण.
नोट: उदाहरण के लिए, प्रति 10 crypts प्रति 50 $L गिना जाता है, 6 x 50 $L या 300 $L 300 crypts के लिए आवश्यक हैं।
- 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 1.5-एमएल ट्यूबों में crypts सेंट्रीफ्यूज।
- अति-नितल को ऊपरी द्रव परत को धीरे से पाइप करके सावधानीपूर्वक त्यागें तथा गोलक को 100 डिग्री में वृद्धि कारक के 100 डिग्री सेल्सियस में पुन: स्फूर्ति दें जिससे बर्फ पर बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (सामग्रीकी सारणी) को कम किया जा सकता है ।
- मैट्रिक्स युक्त crypts एक 37 डिग्री पूर्व गर्म 48 अच्छी तरह से प्लेट में बीज (30 डिग्री एल / मैट्रिक्स जेलेशन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए अनुमति देने के लिए एक मानक ऊतकसंस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- 250 डिग्री एल organoid संस्कृति (ENR) मध्यम (तालिका 1) के साथ प्रत्येक जेल ओवरले और 48 अच्छी प्लेटें वापस एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में जगह (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) . 24 ज के बाद छोटे, गोल, सिस्टिक आकृतियों में क्रिप्ट संगठन के लिए संस्कृतियों की जाँच करें; कलियों के बाद फार्म होगा 2$u20125 दिनों.
- धीरे से हर 3 दिन में ENR मीडिया की जगह. कोमल चूषण के साथ पुराने ENR मीडिया निकालें, ध्यान रखना मैट्रिक्स स्पर्श नहीं जब मीडिया की जगह.
- दर्रा organoid संस्कृतियों हर 4 $u20127 दिन के रूप में पहले11वर्णित .
4. ऑर्गनॉइड अंश तैयारी
- एक बार वे फार्म organoids ट्रांसड्यूस (1$u20122 सप्ताह के भीतर) या पारित होने के बाद. एक एकल transduction प्रयोग के लिए, एक 48-well प्लेट प्रति शर्त में एक 48-well प्लेट में सुसंस्कृत organoids के 2 $u20123 कुओं तैयार करने के साथ $100$u2200 organoids /
- 250 डिग्री सेल्सियस ट्रांसडक्शन मीडिया के साथ एक्सचेंज ईएनआर (तालिका 1) और 3 या अधिक दिनों के लिए ट्रांसडक्शन मीडिया में संस्कृति या जब तक organoids एक सिस्टिक आकारिकी को अपनाने। स्टेम और Paneth कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए transduction माध्यम में Wnt3a और रॉक अवरोध करनेवाला (Y27632) दोनों शामिल हैं; निकोटिनामिड (निक) संस्कृति दक्षता में सुधार करता है (तालिका 1में transduction माध्यम देखें).
- यांत्रिक रूप से एक 1 एमएल पाइप का उपयोग कर मीडिया और एक पाइप टिप के साथ गुंबद की तरह तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स संरचना टूटना।
- organoids और मीडिया एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- यंत्रवत् मैट्रिक्स आगे एक 200 $L पाइप्ट के साथ pipeting द्वारा बाधित [10]u201215 बार.
- 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर आरटी में organoid टुकड़े सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को पिपेट का उपयोग करके सावधानीपूर्वक त्यागें और 1 एमएल डीएमईएम/एफ 12 माध्यम (सारणी1) में गोली को पुन: क्रमित करें।
- डिपेस I (6 $L पर 10 mg/mL) और DNase I (2.5 $L पर 10 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें। 1 एमएल पाइप्ट का उपयोग करके धीरे से पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
- 1.5 एमएल ट्यूब में 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट organoids।
- वियोजन प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए ENR मीडिया का 500 $L जोड़ें; ENR में सीरम प्रतिक्रिया समाप्त.
- ऑर्गनॉइड कोशिकाओं को 20 डिग्री सेल्सियस कोशिका छलनी के माध्यम से पास करें और ऑर्गनॉइड के टुकड़े को 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें।
- 150 डिग्री सेल्सियस के पारवहन माध्यम के साथ अंगाभ के टुकड़े को पुन: स्निग्ध करें (सारणी 1)।
5. वायरल ट्रांसडक्शन द्वारा ऑर्नोइड्स या क्रिप्ट सेल की जेनेटिक इंजीनियरिंग
नोट: चित्र 2देखें.
- एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में एक 48-वेल प्लेट और इनक्यूबेटमें 200 डिग्री सेल्सियस ट्रांसडक्शन मीडियम/वेल के साथ बीज organoid सेल समूहों। वैकल्पिक रूप से, एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में एक 48-वेल प्लेट और इनक्यूबेट में 200डिग्री सेल्सियस ट्रांसक्लक्शन मीडियम/वेल में ताजा अलग क्रिप्ट कोशिकाओं ($1,000 crypts) रखें।
- ट्रांसडक्शन के लिए वायरस की थाव शीशियों 48-वेल प्लेटों में प्रत्येक कुएं के ट्रांसडक्शन के लिए $ 50 डिग्री सेल्सियस या 24-वेल प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से केंद्रित वायरस के 100 डिग्री एल के लिए अनुमति देता है।
- 1ण्5 एमएल ट्यूब (सारणी3) में आरटी पर 15 मि. के लिए चुंबकीय नैनोकण विलयन के 12 डिग्री सेल्सियस के साथ इनक्यूबेट वायरस।
- ट्रांसड्यूस किए जाने वाले कोशिकाओं में चुंबकीय नैनोकण विलयन/वायरस मिश्रण जोड़ें।
- कोशिका संस्कृति प्लेट को चुंबकीय प्लेट पर रखें तथा एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2)में कम से कम 2 ज (और $6 ज तक) के लिए इनक्यूबेट करें।
6. संक्रमित अंगकेटुकड़े का बीज
- संक्रमित organoid सेल समूहों और transduction मीडिया प्रत्येक अच्छी तरह से एक 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण.
- 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- कोमल चूषण के साथ supernatant छोड़ें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर गोली युक्त ट्यूब शांत.
- तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 120 डिग्री एल जोड़ें और धीरे धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा गोली resuspend.
- एक नई 48-वेल प्लेट में मैट्रिक्स-सेल मिश्रण के बीज 30 डिग्री एल बूँदें।
- प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5$u201215 मिनट के लिए तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि मैट्रिक्स ठोस न हो जाए।
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए transduction माध्यम जोड़ें और एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 3 $u20124 दिनों के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।
- 3 $u20124 दिनों के बाद, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (10x) के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण organoid संरचनाओं में सेल समूहों के संगठन सुनिश्चित करने के लिए. फिर, धीरे 250 डिग्री एल एनआर माध्यम के साथ transduction मीडिया की जगह.
- मीडिया को हर 3$u20124 दिनों में बदलें।
7. चयन (यदि लागू हो)
- 2 $u20123 दिनों के बाद, यदि उचित हो तो ट्रांसडक्शन माध्यम में चयन के लिए प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं या हार्मोन जोड़ें।
नोट: हमने मसूरी ट्रांसडक्शन के चयन के लिए प्यूरोमाइसिन (2 ग्राम/
8. सफल Transduction और जीन अभिव्यक्ति या Silencing की पुष्टि
- यदि FUGW lentivirus2,14का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से GFP संकेतों को मापने के द्वारा transduction दक्षता का अनुमान है.
- नियंत्रण और प्रयोगात्मक organoid संस्कृतियों में MRNA की मात्रात्मक तुलना के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) का उपयोग करके जीन ओवरएक्सप्रेशन या मौन को मान्य करें।
- प्रोटीन-कोडिंग जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन के स्तर की पुष्टि करें या पश्चिमी ब्लॉट या इम्यूनोस्टेनिंग2द्वारा मौन।
9. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में Organoid Cryosection
नोट: चित्र 3देखें.
- कोमल चूषण द्वारा ईएनआर माध्यम निकालें, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है और धीरे पीबीएस के 500 डिग्री एल के साथ एक बार धो लो।
- 30 मिनट के लिए आरटी में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) समाधान (सामग्रीकीतालिका) के 1.0 एमएल के साथ organoids को ठीक करें।
- चूषण द्वारा पीएफए निकालें, और धीरे से 1 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
- चूषण द्वारा पीबीएस निकालें और प्रत्येक नमूने के लिए 30% sucrose बफर के 1.0 एमएल जोड़ें। नमूनों को निर्जलित करने के लिए ठंडे कमरे, रेफ्रिजरेटर, या बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए सुक्रोज में इनक्यूबेट स्थिर organoids।
- चूषण द्वारा sucrose बफर निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से मैट्रिक्स परत को कवर करने के लिए बस पर्याप्त embedding यौगिक (सामग्री कीतालिका) जोड़ें ($300 $L/well)।
- 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
- 10 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूने रखें, या embedding यौगिक ठोस और सफेद हो जाता है जब तक.
- किनारों के साथ परिसर के कम से कम पिघलने के लिए अनुमति देने के लिए आरटी पर जमे हुए embedding यौगिक के साथ पकवान प्लेस. कुएं की दीवारों से ब्लॉक को अलग करने के लिए स्कैल्पल का उपयोग करें।
- संदंश का उपयोग करमैट्रिक्स-एम्बेडिंग यौगिक ब्लॉक निकालें और इसे एक नमूना ब्लॉक (उदा. क्रायोमोल्ड) में रखें, पिघलने को रोकने के लिए जल्दी से काम करें।
- मोल्ड को पूरी तरह से एम्बेडिंग यौगिक के साथ भरें और 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
- ब्लॉक का उपयोग आगे उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में अनुभागया या भंडारण के लिए है।
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Representative Results
यहाँ, हम एक तेजी से और अत्यधिक कुशल transduction तकनीक है जो एक चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में चुंबकीय नैनोकणों ब्याज की कोशिकाओं को lentivirus देने के लिए harnesses का वर्णन. आसानी से उपलब्ध उपकरणों के साथ, हमने इस दृष्टिकोण को न केवल नए सिरे से पृथक क्रिप्ट कोशिकाओं (चित्र 1A) को पार करने के लिए लागू किया है , बल्कि organoids के लिए भी (चित्र 2) और अन्य कोशिकाओं को भी लागू किया है जो अधिक नियमित ट्रांसडक्शन दृष्टिकोणों के लिए रिफ्रैक्टरी हैं। Lentiviral कणों को आसानी से चुंबकीय नैनोकणों के लिए संयुग्मी किया जा सकता है और जिसके परिणामस्वरूप वायरस-नैनोकण परिसरों एक चुंबकीय प्लेट का उपयोग कर एक चुंबकीय क्षेत्र को लागू करने से कुशलता से वितरित कर रहे हैं। इस दृष्टिकोण का अनुकूलन करने के लिए, हमने पहले GFP से जुड़े lentiviral वैक्टरकाओं का परीक्षण किया ताकि जीएफपी का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जा सके। GFP organoid विकास में प्रत्येक चरण में कल्पना की जा सकती है, जब crypt कोशिकाओं पुटी की तरह संरचनाओं में व्यवस्थित जब पर जल्दी सहित (चित्र 4A), या बाद में समय अंक जब organoids फार्म कलियों (चित्र 4B) . सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस आंत्र organoids तो कोशिका झिल्ली और नाभिक दाग द्वारा विकास में परिवर्तन के लिए कार्यात्मक विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं वंश मार्करों के अलावा कुल कोशिका संख्या की गणना करने के लिए, इस तरह के lysozyme के रूप में Paneth कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ( चित्र 4C).
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर organoids जमे हुए वर्गों पैदा करके आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यहाँ उल्लिखित (चित्र 3) . organoids embedding के बाद, जमे हुए ब्लॉक संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में भविष्य के अध्ययन के लिए अनुभाग. यह दृष्टिकोण भी कुशल है (कुल organoids के लिए GFP(+) organoids के प्रतिशत के आधार पर $ 95% होने का अनुमान). इस दृष्टिकोण मानक प्रयोगशाला अभिकर्मकों के साथ किया जा सकता है, इस प्रकार ऊतकों कि सेल संख्या, सेल भाग्य, और उपस्थिति और विशिष्ट प्रोटीन2के स्तर सहित विविध जांच के लिए अनुकूल हैं प्रदान . उदाहरण के लिए, हमने अलग-अलग कोशिकाओं की पहचान करने और सेलप्रकार का पता लगाने के लिए जमे हुए वर्गों और इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला का उपयोग किया ।
चित्र 1: ठेठ आकृति विज्ञान दिखा कार्टून के साथ अलग crypts और villi. (ए) पृथक क्रिप्ट्स गोल या अंडाकार संरचनाओं का निर्माण करते हैं। (इ) विली की पहचान उंगली नुम संरचनाओं के रूप में की जाती है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: चुंबकीय नैनोकणों और एक चुंबकीय क्षेत्र के लिए जोखिम का उपयोग organoids के वायरल transduction के Schematic. transduction प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम दिखाए जाते हैं. (ए) 1.5 एमएल ट्यूब में आरटी पर 15 मिनट के लिए इन्क्यूबेट वायरस और चुंबकीय नैनोकण समाधान। (बी) ट्रांसड्यूस किए जाने वाले कोशिकाओं में चुंबकीय नैनोकणों/वायरस मिश्रण को जोड़ें। (ग) सेल कल्चर प्लेट को चुंबकीय प्लेट पर रखें और मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें। लंबे समय तक ऊष्मायन समय भी इस्तेमाल किया जा सकता है ($6 एच); प्रतिनिधि अच्छी तरह से चुंबकीय प्लेट पर यहाँ दिखाया गया है. (घ) एक कोशिका जो वायरस से लिपटी हुई है और चुंबकीय नैनोकण दिखाया गया है। (ई) संक्रमित ऑर्गनॉइड सेल समूहों और ट्रांसडक्शन मीडिया को प्रत्येक कुएं से 1.5 एमएल ट्यूब और 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रण में स्थानांतरित करें। सुपरनेंट को कोमल चूषण के साथ छोड़ दें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर गोली युक्त ट्यूब को ठंडा करें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 120 डिग्री एल और धीरे धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा गोली resuspend. (जी) 30 डिग्री सेल्सियस की बीज बूँदें जिसमें मैट्रिक्स-सेल मिश्रण होता है, प्रत्येक में एक नई 48-वेल प्लेट में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: 3 डी मैट्रिक्स में organoids के जमे हुए अनुभागन के Schematic. जमे हुए अनुभागिंग प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरण दिखाए जाते हैं। (एक) एक 24 अच्छी कोशिका संस्कृति की थाली के भीतर एक ही अच्छी तरह से चित्रित किया गया है. (ख) मैट्रिक्स परत को कवर करने के लिए बस पर्याप्त embedding यौगिक जोड़ें ($30 $L/well) और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट (सी) 10 मिनट के लिए एक फ्रीजर में -80 सी पर नमूने रखें या embedding यौगिक ठोस और सफेद हो जाता है जब तक. अगले, आरटी पर पकवान जगह के लिए नमूना के किनारों के साथ मामूली पिघलने के लिए अनुमति देते हैं. (घ) कुएं की दीवारों से ब्लॉक को अलग करने के लिए स्कैल्पल का प्रयोग करें। (ई) संदंश का उपयोग करके मैट्रिक्स-एम्बेडिंग यौगिक ब्लॉक को निकालें और ठंडे ऊतकों के लिए उपयुक्त उथले कंटेनर या मोल्ड में रखें। मोल्ड को पूरी तरह से एम्बेडिंग कंपाउंड (OCT) के साथ भरें. (F) 30 मिनट के लिए एक फ्रीजर में -80 सी पर फ्रीज ब्लॉक (जी) ब्लॉक आगे उपयोग के लिए -80 सी फ्रीजर में अनुभाग या भंडारण के लिए तैयार है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: ट्रांसड्यूस आंत्र organoids के प्रतिनिधि छवियों. (ए) प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत छोटे आंतों के organoids के प्रतिनिधि छवि दिखा (बाएं) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, और, (दाएं) ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के मानक माइक्रोस्कोपी (EGFP) दिन 3 में transduction के बाद. स्केल बार - 50 डिग्रीमी (ठ) चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग करके ऑर्गेनाइड में जीएफपी को पार करने के बाद जीन एनकोडिंग जीएफपी के अतिअभिव्यक्ति का उदाहरण। Organoid कोशिकाओं lenivirus GFP व्यक्त करने के साथ ट्रांसड्यूस किया गया (FUGW; शीर्ष) या lentivirus overexpressing Hmga1 (FUGW-Hmga1; नीचे) के रूप में 12 दिन में दिखाया गया है transduction के बाद. स्केल बार - 50डिग्री मी. (सी ) इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग ऑफ फॉर्मेलिन फिक्स्ड जमे हुए अनुभाग ऑफ ऑर्गेनोइड्स। ऑर्गेनॉयड सेक्शन (4 डिग्री मी) एंटी-लाइसोज़ाइम (लाल), एंटी-एपसीएएम (हरा) और डीएपीआई (नीला) के साथ दागा गया था। EpCAM सेल सीमाओं demarcates, DAPI व्यक्तिगत नाभिक संकेत दिया, और lysozyme दाग Paneth कोशिकाओं. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| ऑर्गेनोइड कल्चर मीडियम (ईएनआर) | 100 एमएल |
| DMEM/F12+ | 96 एमएल |
| एल-ऐलेनिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड पूरक (उदा. ग्लूटामैक्स) | 1 एमएल |
| एनईए | 1 एमएल |
| पेन/स्ट्रेप | 1 एमएल |
| HEPES | 1 एमएल |
| EGF (100 g/ | 5 $L |
| नोगिन (100 ग्राम/ | 10 जेडएल |
| आर-स्पॉन्डिन (100 ग्राम/ | 10 जेडएल |
| या आर-स्पॉन्डिन कंडीशन मीडियम (सीएम) | 20 एमएल |
| मानव पुनः संयोजक इंसुलिन (10 मिलीग्राम / | 5 $L |
| ट्रांसडक्शन माध्यम | 5 एमएल |
| ईएनआर माध्यम | 2.4 एमएल |
| Wnt हालत मध्यम (सीएम) | 2.5 एमएल |
| निकोटिनमाइड (1 म)। | 100 $L |
| Y27632 (10 $M) | 10 जेडएल |
| Crypts वियोजन बफर | 100 एमएल |
| पीबीएस (के बिना Ca2 +, Mg2+) | 99 एमएल |
| पेन/स्ट्रेप | 1 एमएल |
| 0.5 एम एड्टा | 100 $L |
| 0.1 एम डीटीटी (डाइथियोथ्रेटोल) | 100 $L |
| 293T माध्यम | 100 एमएल |
| डीएमईएम | 90 एमएल |
| एफबीएस | 10 एमएल |
| वायरस संग्रह मध्यम | 100 एमएल |
| डीएमईएम | 99 एमएल |
| एफबीएस | 1 एमएल |
| Organoid पाचन बफर | 1 एमएल |
| DMEM/F12+ | 1 एमएल |
| Dispase मैं (10 मिलीग्राम / | 6 $L |
| डीएनएस मैं (10 मिलीग्राम/ | 2.5 $एल |
तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किया गया मीडिया।
| प्लेटें | 10 से.मी. | 15 सें.मी. |
| Lentivirus ट्रांसड्यूसिंग वेक्टर | 6 डिग्री | 9 ग्राम |
| सीएमवी$R8.91 | 8 $g | 12 ग्राम |
| मोहम्मद. जी | 2 ग्राम | 3 डिग्री |
| कुल सदिश | [16 ] जी | $24 $g |
तालिका 2: transfection के लिए प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा.
| प्लेट | चुंबकीय मोती (जेडएल) | वायरस की मात्रा (जेडएल) | अंतिम TransductionVolume (जेडएल) |
| 48-वेल | 6 | 50 | 250 |
| 24-वेल | 12 | 100 | 500 |
तालिका 3: चुंबकीय मनका समाधान और वेक्टर की मात्रा.
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Discussion
वयस्क आंतों उपकला की प्राथमिक संस्कृति organoids के रूप में स्टेम सेल समारोह में शामिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है , आंतों उपकला homeostasis , और विकृति1,2,3, 4. हालांकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर organoids9के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह वांछित आनुवंशिक परिवर्तन के लिए अनुक्रम विश्लेषण के आधार पर व्यापक स्क्रीनिंग और चयन के लिए की आवश्यकता से सीमित है. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आगे के विश्लेषण के लिए जमे हुए अनुभागिंग के बाद, lenti- या retrovirus के चुंबकीय नैनोकण वितरण के लिए वीडियो आधारित ट्यूटोरियल के साथ स्पष्ट और संक्षिप्त निर्देश प्रदान करना है।
यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से आंतों organoids इंजीनियर और जीन overexpression या जमे हुए वर्गों से silencing के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और कुशल तरीका है. महत्वपूर्ण चरणों को चित्र 2, चित्र 3में रेखांकित किया गया है। इस कार्यनीति से आंतों की स्टेम कोशिकाओं में आनुवंशिक परिवर्तन (ओवरएक्सप्रेशन या साइलेंसिंग )के जीवविज्ञानी महत्व की जांच की जा सके . हमने विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं2,13में इन विट्रो में कोशिका रूपांतरण और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए वायरल सदिशों के इस चुंबकीय नैनोकण आधारित वितरण का भी उपयोग किया है।
इस दृष्टिकोण के साथ, वायरल कणों चुंबकीय नैनोकणों के साथ लेपित और एक चुंबकीय क्षेत्र के लिए जोखिम से कोशिकाओं को दिया जाता है। वर्तमान transduction तरीकों की तुलना में, इस तरह के साथ या spinoculation के बिना polybrene के रूप में10,15, चुंबकीय नैनोकण-वायरल परिसरों कोशिकाओं को कम विषाक्त कर रहे हैं क्योंकि आनुवंशिक सामग्री के तेज एंडोसाइटोसिस द्वारा मध्यस्थता की है और pinocytosis, दो स्वाभाविक रूप से होने वाली जैविक प्रक्रियाओं है कि कोशिका झिल्ली के लिए महत्वपूर्ण नुकसान पैदा नहीं करते. अतः कोशिका व्यवहार्यता तथा पारवहन दक्षता दोनों में वृद्धि होती है। संक्रमण दक्षता में और अधिक वृद्धि की जा सकती है , छोटे क्रिप्ट खंडों या एकल कोशिकाओं का उपयोग करते हुए (चरण 4-8 देखें ) के बजाय बडी क्रिप्ट या संपूर्ण अंगभों के स्थान पर , जैसा कि पहले बताया गया है2,10,13,16. चुंबकीय रूप से निर्देशित नैनोकण वितरण के परिणामस्वरूप लक्ष्य कोशिकाओं2,13में तेजी से संचय, प्रवेश, और वायरल वैक्टर के तेज हो जाते हैं। चुंबकीय नैनोकणों लोहे के ऑक्साइड, जो पूरी तरह से biodegradable है और विशिष्ट स्वामित्व धासी अणुओं के साथ लेपित से बना रहे हैं। वायरल सदिशों के साथ नैनोकण संघ नमक प्रेरित कोलाइडयन एकत्रीकरण और स्थिर वैद्युत बातचीत द्वारा हासिल की है। नैनोकणों तो संस्कृति पकवान के तहत रखा चुंबकीय प्लेट द्वारा उत्पन्न एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र द्वारा कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। जबकि transduction दक्षता दृष्टिकोण 95%, नहीं सभी कोशिकाओं transduced हैं, जो इस तकनीक के लिए एक सीमा है. इसके अतिरिक्त, ब्याज के अंतर्जात रूप से व्यक्त जीनों को CRISPR/Cas9 दृष्टिकोणों के रूप में परिवर्तित नहीं किया जाता है।
जीन overexpression या silencing के बाद, organoids अध्ययन के असंख्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वैज्ञानिक उद्देश्यों पर निर्भर करता है, जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण सहित, कोशिकाओं के भीतर proteomic परिवर्तन या कोशिकाओं द्वारा स्रावित, चयापचय परिवर्तन, और रूपात्मक परिवर्तन। जीवित ऊतकों के साथ के रूप में, जमे हुए वर्गों इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इस तरह के प्रतिलेखन कारक, साइटोप्लाज्मिक अणुओं, या सेल सतह मार्करों के रूप में विशिष्ट प्रोटीन के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के लिए प्राप्त किया जा सकता है। हमारे लेख 3 डी संस्कृति में उनकी स्थिति और संगठन परेशान किए बिना organoids से जमे हुए वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण भी शामिल है. यह लाभप्रद है क्योंकि पूर्व तकनीकों को16ठंड से पहले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से organoid को हटाने की आवश्यकता है . मैट्रिक्स से हटाने के द्वारा organoids प्रसंस्करण organoid के संरचनात्मक संगठन को बाधित कर सकता है बजाय इन विट्रो विकास और विकास को प्रतिबिंबित.
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर आंतों organoids के लिए इस प्रोटोकॉल भी अन्य सेल आधारित मॉडल और organoid प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अग्नाशय, कोलनिक, यकृत, हृदय, और मस्तिष्क organoid सिस्टम इस दृष्टिकोण के साथ transduced किया जा सकता है. यहां तक कि अधिक मानक संस्कृति तकनीक के तहत बढ़ कोशिकाओं नैनोकण प्रौद्योगिकी के लिए अनुकूल हैं. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण रोगों के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, न केवल स्टेम सेल व्युत्पन्न organoid सिस्टम के संदर्भ में, लेकिन यह भी ट्यूमर organoids में.
संक्षेप में, आंतों organoid अध्ययन के लिए इन प्रोटोकॉल में वर्णित महत्वपूर्ण संशोधनों उम्मीद है कि वैज्ञानिकों को महत्वपूर्ण कारकों और आंत्र स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतान के जीव विज्ञान में शामिल बहाव रास्ते की भूमिका स्पष्ट करने के लिए सशक्त होगा . इन दृष्टिकोणों को आत्म-नवीकरण, कोशिका भाग्य निर्धारण, ऊतक होमोस्टेसिस, और आंतों के उपकला पुनर्जनन के तहत, दोनों शारीरिक और रोग ग्रस्त स्थितियों के तहत अंतर्निहित आणविक तंत्र के बारे में अधिक जानने के लिए साधन प्रदान करना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), मैरीलैंड स्टेम सेल रिसर्च फंड (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), अमेरिकन लुंग एसोसिएशन, Allegheny स्वास्थ्य नेटवर्क से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था हॉपकिंस रिसर्च फंड और हॉपकिंस पाचन रोग बुनियादी अनुसंधान कोर केंद्र.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
