Summary
Descriviamo istruzioni passo-passo a: 1) ingegnerizzare in modo efficiente gli organoidi intestinali utilizzando nanoparticelle magnetiche per la trasduzione lentile o retrovirale e, 2) generare sezioni congelate da organoidi ingegnerizzati. Questo approccio fornisce un potente strumento per modificare in modo efficiente l'espressione genica negli organoidi per lo studio degli effetti a valle.
Abstract
Le colture organoidi intestinali offrono un'opportunità unica per studiare la biologia delle cellule staminali intestinali e della crittografia in vitro, anche se approcci efficienti per manipolare l'espressione genica negli organoidi hanno fatto progressi limitati in questo campo. Mentre la tecnologia CRISPR/Cas9 consente una precisa modifica del genoma delle cellule per la generazione di organiidi, questa strategia richiede un'ampia selezione e screening per analisi di sequenza, che richiede tempo e denaro. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per una trasduzione virale efficiente degli organoidi intestinali. Questo approccio è rapido e altamente efficiente, riducendo così il tempo e le spese inerenti alla tecnologia CRISPR/Cas9. Presentiamo anche un protocollo per generare sezioni congelate da colture organoidi intatte per ulteriori analisi con colorazione immunohistochimica o immunofluorescente, che può essere utilizzata per confermare l'espressione genica o il silenziamento. Dopo aver raggiunto una trasduzione di vettori virali per l'espressione genica o il silenziamento, la funzione delle cellule staminali intestinali e della cripta può essere rapidamente valutata. Anche se la maggior parte degli studi organoidi impiega saggi in vitro, gli organoidi possono anche essere consegnati ai topi per analisi funzionali in vivo. Inoltre, i nostri approcci sono vantaggiosi per prevedere le risposte terapeutiche ai farmaci perché le terapie attualmente disponibili generalmente funzionano modulando l'espressione genica o la funzione proteica piuttosto che alterando il genoma.
Introduction
La capacità di coltura delle cellule di certera umana o di topo come organoidi tridimensionali (3D) dall'intestino tenue o dal colon per periodi di tempo prolungati ha fornito un importante passo avanti perché queste culture mostrano caratteristiche distintive dell'epitelio intestinale in vivo 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3. Gli organidi derivati dalle cripte primarie sono in grado di auto-rinnovamento e di auto-organizzazione, che esibiscono funzioni cellulari simili ai loro tessuti di origine. Infatti, gli organoidi riassumono non solo l'organizzazione strutturale delle cripte in vivo, ma anche molte caratteristiche molecolari, fornendo così strumenti utili per studiare i normali stati di biologia e malattia. Per illustrare, studi organoidi hanno rivelato nuovi percorsi molecolari coinvolti nella rigenerazione dei tessuti1,2,3,4,5 così come farmaci che potrebbero migliorare la funzione nelle impostazioni patologiche6,7.
Lo studio delle cellule staminali intestinali è di particolare interesse perché il rivestimento intestinale è tra i tessuti mammiferi più altamente rigenerativi, rinnovandosi ogni 3-5 giorni per proteggere l'organismo da batteri, tossine e altri agenti patogeni all'interno del lumen intestinali. Le cellule staminali intestinali (ISC) sono responsabili di questa notevole capacità rigenerativa e forniscono così un paradigma unico per studiare la funzione delle cellule staminali adulte1,2. Gli esperimenti di tracciamento del lignaggio nei topi hanno dimostrato che le cellule staminali isolate lgr5-positive possono essere coltivate per generare organoidi 3D o "mini-guts" in vitro dove rispecchiano da vicino le loro controparti in vivo. Le colture organoidi possono anche essere derivate da isolati di cellule crittogiformi intestinali costituiti da progenitori, ISC e cellule di Paneth, quest'ultima delle quali costituiscono le cellule di nicchia epiteliali in vivo. Infatti, la coltura organoide dalle cellule primarie della cripta intestinale si è evoluta in una tecnica relativamente di routine che è facile da implementare nella maggior parte dei laboratori utilizzando reagenti ampiamente disponibili. Questo modello è anche suscettibile di analisi quantitativa dell'espressione genica mediante RNA-sequencing (RNA-Seq) e proteine per spettrometria di massa, immunohistochimica o colorazione immunofluorescente2,4,8. Inoltre, la genetica funzionale può essere studiata utilizzando il guadagno di funzione (sopraespressione genica o espressione di un gene mutante attivatore) o la perdita di funzione (silenziamento genico o espressione di un mutante di perdita di funzione) si avvicina2.
È importante sottolineare che la bassa efficienza e l'elevata tossicità del DNA plasmide standard o dei protocolli di trasduzione virale con polibrene rimangono un ostacolo importante nel campo. Sebbene la tecnologia CRISPR/Cas9 consenta un editing preciso del genoma, questo approccio richiede una selezione che richiede molto tempo seguita dalla convalida della sequenza9. Qui presentiamo un protocollo di trasduzione virale per organoidi intestinali primari che ottimizza la consegna di particelle virali mediante coniugazione a nanoparticelle magnetiche e l'applicazione di un campo magnetico. Vengono fornite modifiche chiave ai protocolli precedenti4,5,10,11,12,13 e sono disponibili raccomandazioni per migliorare l'efficienza. Descriviamo anche un approccio per generare sezioni congelate da organoidi intatti coltivati in matrigel 3D (d'ora in poi indicato come matrice della membrana seminterrato o matrice) per ulteriori analisi con immunohistochimica o colorazione immunofluorescente.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC Committee). Questo protocollo viene modificato da un metodo pubblicato in precedenza10,11,12,13.
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare il mezzo fresco 293T con diverse ore di anticipo e riscaldare a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua per almeno 10 minuti prima dell'uso (Tabella 1).
- Preparare il DNA plasmide2,13,14 per l'imballaggio virale. (Tabella 2).
- Acquisire tutti gli altri materiali necessari (Tabella dei materiali).
2. Produzione di particelle di lentivirus o retrovirus
- Rene embrionale umano (HEK) 293T semina cellulare (Giorno 1)
- Preparare un piatto di coltura di 150 mm ricoprendo lo strato con 50 g/mL poli-D-lysina disciolto in salina tampina tamponata di fosfato (PBS; 10 mL/piatto) per 1 h a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere la salina tampone di fosfato (PBS)/poli-D-lysine e lavare il piatto rivestito due volte con 5 mL PBS.
- Seme 293T celle (8u201210 x 106) in 293T medio (Tabella 1) per un volume totale di 15 mL.
- Coltura 293T cellule durante la notte in un incubatore di coltura tissutale standard (37 , 5% DI CO2).
- HEK 293T trasfezione cellulare (giorno 2)
- Eseguire la trasfezione una volta che le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza (di solito circa 24 h dopo il seeding 8 -u201210 x 106 cellule).
- Preparare la miscela di trasfezione utilizzando un approccio efficiente, come una formulazione liposoma leale cationica commerciale (Tabelle 1 -u20122, Tabella dei materiali)2.
- Il DNA di lentivirus diluito costruisce12 (totale 24 g di DNA plasmide, tabella 2) in 1,2 mL di mezzo di trasfezione e incubazione per 5 min a RT in tubi da 1,5 mL ( Tabelladei materiali).
- Diluire trasfezione (36 o L) in 1,2 mL di mezzo di trasfezione (Tabella dei materiali) e incubare in tubi da 5 mL per 5 min secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere il reagente lentivirus (passaggio 2.2.2.1) al reagente di trasfezione (passaggio 2.2.2.2) e mescolare delicatamente con un tubo lento su e giù con un pipet da 5 mL.
- Incubare la miscela per 20 min a RT.
- Lavare delicatamente 293T cellule con 5 mL di mezzo di trasfezione e sostituire con 10 mL di mezzo di trasfezione.
- Aggiungere i complessi DNA-lipidici (dal passo 2.2.2.3) dropwise al mezzo di 293T cellule e mescolare attentamente i media nei piatti di coltura muovendosi in direzioni orizzontale e verticale per garantire la distribuzione equa dei complessi DNA-lipidici in ogni piatto.
- Incubare per 6 h in un'incubatrice di coltura tissutale standard (37 gradi centigradi, 5% di CO2).
- Dopo l'incubazione, sostituire il supporto con 20 mL di virus fresco che raccoglie il virus medio (Tabella 1).
- Raccolta di virus (giorni 3 -u20125)
- Raccogliere i supporti antivirus in tubi da 50 mL e conservarli in un frigorifero a 4 gradi centigradi per un'ulteriore concentrazione.
- Sostituire 20 mL di un mezzo di raccolta di virus fresco ogni 24 ore e di coltura durante la notte (24 h). Ripetere la raccolta dei file multimediali nei 2 giorni successivi (Giorni 4 -u20125).
- Assicurarsi che il volume totale del supporto raccolto dopo il giorno 5 sia di 60 mL (20 mL/giorno x 3 giorni).
- Concentrazione dei virus (giorno 5)
- Centrifugare il supporto raccolto (60 mL) per 5 min a 400 x g. Quindi, passare il supernatante attraverso un filtro (0,45 m pori) per rimuovere eventuali detriti cellulari.
- Concentrare il virus aggiungendo 15 mL di supporti antivirus filtrati in un'unità filtrante centrifuga (Tabella dei materiali). Centrifuga a 2.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Poiché il virus non può passare attraverso questo filtro, sarà concentrato nella camera superiore del filtro.
- Aspirare il flusso attraverso dal tubo (camera inferiore) e aggiungere altri 15 mL di raccolta virale rimanente supernatante alla stessa unità di filtro centrifuga. Centrifuga come sopra (2.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi) per concentrare il virus aggiuntivo dal sovrentrato.
- Ripetere il processo utilizzando lo stesso filtro per supporti da 60 mL da una singola piastra transdotta fino a raggiungere la concentrazione desiderata (100 volte).
Nota: In genere concentriamo 60 mL di supporti per la raccolta dei virus su 600 dollari. - Rimuovere il virus concentrato dalla camera superiore del filtro utilizzando un pipet da 1 mL, quindi conservare in tubi da 1,5 mL (50-u201260 l/tubo) a -80 gradi centigradi per un uso successivo. Conservare le particelle concentrate per un massimo di 6 mesi.
3. Isolare le cripte
- Topi eutanasi che utilizzano CO2 secondo le linee guida locali di IACUC.
- Posizionare l'animale eutanasia sulla schiena e lavare l'addome spruzzando con 70% etanolo.
- Eseguire un'incisione longitudinale della linea mediana dallo sterno all'inguine, incidendo prima la pelle e poi il tessuto sottocutaneo.
- Rimuovere l'intestino tenue dallo stomaco al cecum.
- Identificare le regioni di interesse all'interno dell'intestino tenue; cripte possono essere isolate dal duodenum, jejunum e ileum.
- Utilizzando una siringa da 10 mL, lavare l'intestino tenue isolato con tampone di dissociazione cripta (PBS pre-freddo contenente 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% penicillina /streptomicina (no Ca2 ' e Mg2)) in un piatto di 10 cm di coltura dei tessuti (Tavolo 1) )
- Rimuovere il tessuto adiposo periferico e aprire o "rintare" il tessuto intestinale longitudinalmente su una lastra di vetro sterile (15 cm x 15 cm).
- Raschiare delicatamente il villi epiteliale intestinale utilizzando un raschietto cellulare.
- Tagliare l'intestino tenue in sezioni di lunghezza di 2-u20123 cm.
- Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL contenente PBS pre-raffreddato utilizzando pinze piatte (116 mm). Lavare i frammenti di tessuto agitando vigorosamente a mano per 30 dollari (spostando il tubo in direzioni opposte 60 volte).
- Aggiornare il PBS e ripetere il lavaggio fino a quando il PBS diventa chiaro.
Nota: In genere laviamo i frammenti 2-u20123 volte. - Incubare il tessuto in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di tampone di dissociazione della cripta (Tabella 1) per 10 min a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale a velocità media una volta che il PBS è chiaro.
- Agitare vigorosamente il tubo a mano per 30 dollari (direzioni opposte 60 volte) e trasferire il tessuto utilizzando la forza piatta a un altro tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di tampone di dissociazione criptato. Incubare questa frazione sul ghiaccio. Non usare la prima frazione per la coltura organoide perché contiene principalmente villi.
- Ripetere i passaggi 3.11-u20123.13 per 3-u20124 volte, raccogliendo ogni frazione e posizionandole sul ghiaccio.
- Selezionare la frazione che viene arricchita con la più alta percentuale di cripte intestinali scansionando 200 campioni luna tiri provenienti da ogni frazione al microscopio invertito (4x). Identificare le cripte in base alla morfologia tipica descritta in precedenza (Figura 1A)10.
NOT: Appariranno di forma rotonda o ovale e conterranno celle del riquadro granulato. Al contrario, i villi sono strutture simili a dita prive delle celle Paneth granulari (Figura1B). - Passare la frazione selezionata attraverso un colino di 40 m per ottenere cripte di dimensioni simili, se necessario. In alternativa, isolare le cellule staminali Lgr5, basate sulla citometria di flusso per la proteina fluorescente verde (GFP), se i topi vengono incrociati sullo sfondo di EGFP-Lgr5 o su un altro modello adatto che consente l'identificazione delle cellule Lgr52.
- Contare il numero totale di cripte nella frazione selezionata come segue.
- Pipetta 50 -L della frazione selezionata in un emocitometro e contare il numero di cripte utilizzando un microscopio luminoso invertito (4x). Mettere 100 cripte per pozzo quando si utilizza una piastra di 48 pozzetti per consentire gli esperimenti di trasduzione in cui i pozzi 3 -u20126 saranno trasdotti per condizione sperimentale per il silenziamento genico o la sovraespressione.
- In base al numero di cripte per 50 gradi, calcolare il volume del buffer di dissociazione della cripta necessario e trasferire il volume in un tubo da 1,5 mL.
Nota: Per 300 cripte sono necessarie 10 cripte per 50 gradi l, per 300 cripte sono necessarie 6 x 50 l o 300 L.
- Centrifugare le cripte nei tubi da 1,5 mL a 300 x g per 5 min.
- Scartare con attenzione il supernatante pipettando delicatamente dallo strato liquido superiore e risospende nuovamente il pellet in 100 - L di fattore di crescita ridotto matrice della membrana seminterrato sul ghiaccio (Tavolo dei materiali).
- Semina le cripte che contengono la matrice in una piastra preriscaldata da 37 gradi centigradi (30 gradi l/pozzetto, cripte/pozzo da 100 dollari). Incubare la piastra in un'incubatrice di coltura tissutale standard per 5-u201215 min per consentire la gelazione a matrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).
- Sovrapporre ogni gel con un mezzo di colturaorganoide (ENR) di 250 l (ENR) e riporre le lastre di 48 pozze in un'incubatrice di coltura tissutale standard (37 gradi centigradi, 5% CO2). Controllare le culture per l'organizzazione cripta in piccole, rotonde, forme citiche dopo 24 ore; le gemme si formeranno dopo 2 giorni 2-u20125.
- Sostituire delicatamente i supporti ENR ogni 3 giorni. Rimuovere i vecchi supporti ENR con aspirazione delicata, facendo attenzione a non toccare la matrice durante la sostituzione dei supporti.
- Colture organoidi di passaggio ogni 4 -u20127 giorni come descritto in precedenza11.
4. Preparazione del frammento organoide
- Gli organoidi trasduceciati una volta che si formano (entro 1-u20122 settimane) o dopo essere stati passaggi. Per un singolo esperimento di trasduzione, preparate 2-u20123 pozzi di organoidi coltivati in una piastra di 48 pozzetti per condizione con organoidi/bene da 100,u201200 o da organoidi per condizione di trasduzione sperimentale.
- Scambiare ENR con 250 supportidi trasduzione (Tabella 1) e coltura nei mezzi di trasduzione per 3 o più giorni o fino a quando gli organoidi adottano una morfologia cistica. Includere sia Wnt3a che l'inibitore ROCK (Y27632) nel mezzo di trasduzione per aumentare il numero di cellule staminali e di Paneth; La nicotinamide (Nic) migliora l'efficienza della coltura (vedi mezzo di trasduzione nella tabella 1).
- Rompono meccanicamente la struttura a matrice a membrana del seminterrato simile a una cupola con supporti e una punta pipetta utilizzando un pipet da 1 mL.
- Trasferire gli organoidi e i supporti in un tubo sterile da 1,5 mL.
- Interrompere meccanicamente la matrice con il pipettaggio con un pipet da 200 dollari.
- Centrifugare i frammenti organoidi a RT a 500 x g per 5 min.
- Eliminare attentamente il supernatante utilizzando una pipetta e sospendere nuovamente il pellet in 1 mL di media DMEM/F12 (tabella1).
- Aggiungere Dispase I (6 a 10 mg/mL) e DNase I (2,5 l a 10 mg/mL). Mescolare bene pipettando delicatamente con un pipet da 1 mL.
- Incubare organoidi a 37 gradi centigradi per 20 min nel tubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 500 -L di supporto ENR per terminare la reazione di dissociazione; il siero nel ENR termina la reazione.
- Passare le cellule organoidi attraverso un colino cellulare di 20 m e centrifugare i frammenti organoidi a 400 x g per 5 min.
- Risospendere i frammenti organoidi con un mezzo di trasduzione di 150 gradi (tabella1).
5. Ingegneria genetica degli organoidi o delle cellule della cripta mediante trasduzione virale
NOT: Vedere la Figura 2.
- Cluster di cellule organoidi di semi con un mezzo/bene di trasduzione di 200 gradi in una piastra di 48 pozze e incubare in un'incubatrice di coltura tissutale standard (37 gradi centigradi, 5% CO2). In alternativa, inserire celle di cripto appena isolate (1.000 cripte) in 200 .
- Scongelare le fiale di virus per la trasduzione consentendo 50 dollari di virus concentrato per la trasduzione di ogni pozzo in lastre di 48 pozzetti o 100 dollari di virus concentrato per pozzo in piastre di 24 pozzetti.
- Incubare il virus con 12 l di soluzione magnetica nanoparticella per 15 min a RT in un tubo da 1,5 mL (Tabella 3).
- Aggiungere la miscela di soluzione/virus delle nanoparticelle magnetiche alle cellule da trasdure.
- Posizionare la piastra di coltura cellulare su una piastra magnetica e incubare per almeno 2 h (e fino a 6 h) in un'incubatrice a coltura di tessuto standard (37 , 5% CO2).
6. Seeding di frammenti organoidi infetti
- Trasferire gli ammassi di cellule organoidi infette e i supporti di trasduzione da ciascun pozzo in un tubo da 1,5 mL.
- Centrifuga a 500 x g per 5 min.
- Scartare il supernatante con un'aspirazione delicata e raffreddare il tubo contenente il pellet sul ghiaccio per 5 min.
- Aggiungere 120 -L di matrice di membrana del seminterrato e risospendere il pellet pipetting lentamente su e giù.
- Seme 30 gocce di miscela matrice-cellula in una nuova piastra di 48 pozze.
- Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 5,u201215 min fino a quando la matrice si solidifica.
- Aggiungete il mezzo di trasduzione ad ogni pozzo e incubate in un'incubatrice di coltura tissutale standard per 3 giorni (37 gradi centigradi, 5% CO2).
- Dopo 3-u20124 giorni, ispezionare le colture al microscopio luminoso (10x) per garantire l'organizzazione di ammassi cellulari in strutture organoidi. Quindi, sostituire delicatamente i supporti di trasduzione con un supporto ENR da 250.
- Sostituire i supporti ogni 3 giorni u20124.
7. Selezione (se applicabile)
- Dopo 2-u20123 giorni, aggiungere gli antibiotici o gli ormoni pertinenti per la selezione al mezzo di trasduzione, se appropriato.
NOT: Abbiamo usato la puromicina (2 g/mL) per la selezione della trasduzione lentivriale perché i plasmidi ospitavano un gene di resistenza puromycina2,14.
8. Conferma della trasduzione e dell'espressione genica di successo o del silenziamento
- Se si utilizza la lentivirus FUGW2,14, stimare l'efficienza della trasduzione misurando i segnali GFP al microscopio fluorescente o alla citometria di flusso.
- Convalidare la sovraespressione genica o il silenziamento utilizzando la reazione a catena di polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (RT-PCR) per il confronto quantitativo dell'mRNA nelle colture di controllo e organoide sperimentali.
- Confermare i livelli proteici per l'espressione o il silenziamento genico codificante di proteine da Western Blot o immunostaining2.
9. Criosezione organoide nella matrice della membrana del seminterrato
NOT: Vedere la Figura 3.
- Rimuovere il mezzo ENR con aspirazione delicata, facendo attenzione a non perturbare la matrice della membrana del seminterrato e lavare delicatamente una volta con 500 .
- Fissare gli organoidi con 1,0 mL del 4% di paraformaldeide (PFA) soluzione (Tabella dei materiali) a RT per 30 min.
- Rimuovere la PFA per aspirazione e lavare delicatamente due volte con 1 mL PBS.
- Rimuovere PBS per aspirazione e aggiungere 1,0 mL di 30% buffer di saccarosio a ogni campione. Incubare organoidi fissi nel saccarosio per 1 h a 4 gradi centigradi in una cella frigorifera, in frigorifero o sul ghiaccio per disidratare i campioni.
- Rimuovere il buffer di sucrosi per aspirazione e aggiungere abbastanza composto di incorporamento (Tabella dei materiali) per coprire il livello della matrice (300 dollari l/po) in ogni pozzo.
- Incubare a RT per 5 min.
- Mettete i campioni in un congelatore a -80 gradi centigradi per 10 min, o fino a quando il composto di incorporamento diventa solido e bianco.
- Posizionare il piatto con composto di incorporamento congelato a RT per consentire la fusione minima del composto lungo i bordi. Utilizzare un bisturi per separare il blocco dalle pareti del pozzo.
- Rimuovere il blocco composto che incorpora la matrice utilizzando la pinpe e posizionarlo in un blocco campione (ad esempio criomuffarsi), lavorando rapidamente per evitare la fusione.
- Riempire completamente lo stampo con l'incorporamento composto e congelare a -80 gradi centigradi per 30 min.
- Utilizzare il blocco è per sezionamento o stoccaggio in -80 gradi congelatore per un ulteriore utilizzo.
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Representative Results
Qui, descriviamo una tecnica di trasduzione rapida e altamente efficiente che sfrutta le nanoparticelle magnetiche esposte a un campo magnetico per fornire lentivirus alle cellule di interesse. Con gli strumenti prontamente disponibili, abbiamo applicato questo approccio non solo per trasdurre le celle di cripta appena isolate (Figura 1A), ma anche per gli organoidi (Figura 2) e altre cellule che sono refrattarie ad approcci di trasduzione più di routine. Le particelle lentivirali possono essere facilmente coniugate alle nanoparticelle magnetiche e i complessi virus-nanoparticelle risultanti vengono distribuiti in modo efficiente applicando un campo magnetico utilizzando una piastra magnetica. Per ottimizzare questo approccio, abbiamo prima testato vettori lentivirali collegati a GFP in modo che GFP potesse essere utilizzato per identificare le cellule trasdotte con microscopia a fluorescenza. Il GFP può essere visualizzato in ogni fase dello sviluppo organoide, anche quando le cellule cripta si organizzano in strutture simili a cisti (Figura 4A), o in momenti successivi in cui gli organoidi formano gemme (Figura 4B). Gli organoidi intestinali trasdotti con successo possono quindi sottoporsi ad analisi funzionali per le alterazioni nello sviluppo macchiando le membrane cellulari e i nuclei per enumerare il numero totale di cellule oltre ai marcatori di lignaggio, come il lisozima per identificare le cellule di Paneth ( Figura 4C).
Gli organoidi geneticamente ingegnerizzati possono essere utilizzati per un'ulteriore analisi generando sezioni congelate come descritto qui (Figura 3). Dopo l'incorporamento degli organoidi, i blocchi congelati possono essere conservati e successivamente sezionato per studi futuri. Questo approccio è anche efficiente (stimato in usd per il 95% in base alla percentuale di organoidi GFP(-) rispetto agli organoidi totali). Questo approccio può essere eseguito con reagenti di laboratorio standard, fornendo così tessuti che sono suscettibili a diverse indagini, tra cui il numero di cellule, il destino cellulare, e la presenza e i livelli di proteine specifiche2. Ad esempio, abbiamo usato sezioni congelate e colorazione immunofluorescente per identificare singole cellule e verificare il tipo di cellula (Figura 4C).
Figura 1: Cripte isolate e villi con cartoni animati che mostrano la morfologia tipica. (A) Le cripte isolate formano strutture rotonde o ovali. (B) I Villi sono identificati come strutture simili a dita. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema della trasduzione virale degli organoidi utilizzando nanoparticelle magnetiche e l'esposizione a un campo magnetico. Vengono mostrati i passaggi più critici del protocollo di trasduzione. (A) Incubare il virus e la soluzione magnetica delle nanoparticelle per 15 min a RT in un tubo da 1,5 mL. (B) Aggiungere la miscela nanoparticelle/virus magnetica alle cellule da trasdure. (C) Posizionare la piastra di coltura cellulare sulla piastra magnetica e incubare per 2 h in un incubatore di coltura tissutale standard. È inoltre possibile utilizzare tempi di incubazione più lunghi (6 h); il pozzo rappresentativo è mostrato qui sulla piastra magnetica. (D) Viene mostrata una cellula trasdotta con il virus e la nanoparticella magnetica. (E) Trasferire gli ammassi di cellule organoidi infetti e i supporti di trasduzione da ogni pozzo in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 500 x g per 5 min. Scartare il supernatante con aspirazione delicata e raffreddare il tubo contenente il pellet sul ghiaccio per 5 min. (F) Aggiungere 120 l di matrice della membrana del seminterrato e risospendere il pellet pipeting lentamente su e giù. (G) Gocce di semi di 30 - L contenenti miscela matrice-cellula in ogni pozzo in una nuova piastra di 48 pozze. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema del sezionamento congelato degli organoidi nella matrice 3D. Vengono visualizzati i passaggi più critici del protocollo di sezionamento bloccato. (A) È raffigurato un unico pozzo all'interno di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzi. (B) Aggiungere un composto di incorporamento sufficiente a coprire lo strato della matrice (300 DOLLARI l/well) e incubare a RT per 5 min. (C) Posizionare i campioni a -80 C in un congelatore per 10 min o fino a quando il composto di incorporamento diventa solido e bianco. Successivamente, posizionare il piatto a RT per consentire una leggera fusione lungo i bordi del campione. (D) Utilizzare un bisturi per separare il blocco dalle pareti del pozzo. (E) Rimuovere il blocco composto che incorpora la matrice utilizzando le pinze e posizionarlo in un contenitore o stampo superficiale appropriato per il congelamento dei tessuti. Riempire completamente lo stampo con il composto di incorporamento (OCT). (F) Bloccare il blocco a -80 C in un congelatore per 30 min. (G) Il blocco è pronto per la sezionamento o lo stoccaggio nel congelatore -80 C per un ulteriore utilizzo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative di organoidi intestinali trasdotti. (A) Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali al microscopio leggero che mostra la microscopia a fluorescenza (a sinistra) e , (destra) microscopia standard dell'espressione transgenica (EGFP) al terzo giorno dopo la trasduzione. Barra della scala - 50 m.(B) Esempio di sovraespressione della codifica genica GFP in organoide dopo la trasduzione utilizzando nanoparticelle magnetiche. Le cellule organoidi sono state tradursi con lentivirus che esprime GFP (FUGW; Top) o lentivirus sovraesprimente Hmga1 (FUGW-Hmga1; In basso) come mostrato al giorno 12 dopo la trasduzione. Barra della scala - 50 m. (C) Immunofluorescenza imaging della sezione congelata fissa di formalina degli organoidi. Le sezioni organoididi (4 m) erano macchiate con anti-lisozima (rosso), anti-EpCAM (verde) e DAPI (blu). EpCAM delimita i confini delle cellule, DAPI ha indicato singoli nuclei e macchie di lisozima cellule Paneth. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mezzo di coltura organiide (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 | 96 mL |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplemento (ad esempio Glutamax) | 1 mL |
| NEAA | 1 mL |
| Penna/Strep | 1 mL |
| HEPES | 1 mL |
| EGF (100 g/mL) | 5 ll |
| Noggin (100 g/mL) | 10 ll |
| R-spondina (100 g/ mL) | 10 ll |
| o supporto condizione R-spondin (CM) | 20 mL |
| Insulina ricombinante umana (10 mg/mL) | 5 ll |
| Mezzo di trasduzione | 5 mL |
| Medio ENR | 2,4 mL |
| Wnt condizione media (CM) | 2,5 mL |
| Nicotinamide (1M) | 100 ll |
| Y27632 (10 M) | 10 ll |
| Buffer di dissociazione Cripte | 100 mL |
| PBS (senza Ca2,Mg2) | 99 mL |
| Penna/Strep | 1 mL |
| 0,5 M EDTA | 100 ll |
| 0,1 M DTT (dithiothreitol) | 100 ll |
| 293T medio | 100 mL |
| DMEM (informazioni in stato di | 90 mL |
| Fbs | 10 mL |
| Raccolta virus Media | 100 mL |
| DMEM (informazioni in stato di | 99 mL |
| Fbs | 1 mL |
| Buffer di digestione organoide | 1 mL |
| DMEM/F12 | 1 mL |
| Dispase I (10 mg/mL) | 6 ll |
| Dnase I (10 mg/ mL) | 2,5 l l |
Tabella 1: supporti utilizzati nel protocollo.
| Piastre | 10 cm | 15 cm |
| Vettore trasdutto di Lentivirus | 6 g di g | 9 g di g |
| CMV-R8.91 | 8 g | 12 g di g |
| Md. grammo | 2 g | 3 g |
| Totale vettori | 16 g di g | 24 g di g |
Tabella 2: Quantità di DNA plasmide per la trasfezione.
| piatto | Perline magnetiche (L) | Volume del virus | Trasduzione finaleVolume (L) |
| 48-bene | 6 È possibile: | 50 anni | 250 anni |
| 24 bene | 12 mila | 100 del sistema | 500 |
Tabella 3: Volume della soluzione di perline magnetico e vettore.
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Discussion
La coltura primaria dell'epitelio intestinale adulto come organoidi fornisce un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella funzione delle cellule staminali, l'omeostasi epiteliale intestinale e la patologia1,2,3, 4. Anche se la tecnologia CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per ingegnerizzare geneticamente gli organoidi9, è limitata dalla necessità di un ampio screening e selezione basata sull'analisi della sequenza per i cambiamenti genetici desiderati. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire istruzioni chiare e concise con tutorial basati su video per la consegna di nanoparticelle magnetiche di lenti o retrovirus agli organoidi intestinali, seguiti da sezionamento congelato per ulteriori analisi.
Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per ingegnerizzare geneticamente gli organoidi intestinali e analizzare le conseguenze della sovraespressione genica o del silenziamento da sezioni congelate. I passaggi critici sono descritti nella Figura 2, Figura 3. Questa strategia consente di soccorrere il significato biologico delle alterazioni genetiche (sovraespressione o silenziamento) nelle cellule staminali intestinali e della loro progenie coltivata in condizioni 3D2,13. Abbiamo anche usato questa consegna magnetica basata su nanoparticelle di vettori virali per migliorarela trasduzione cellulare e l'espressione transgenica in vitro in diverse cellule primarie 2,13.
Con questo approccio, le particelle virali vengono rivestite con nanoparticelle magnetiche e consegnate alle cellule dall'esposizione a un campo magnetico. Rispetto agli attuali metodi di trasduzione, come la polibrene con o senza spinoculazione10,15,i complessi nanoparticella-virale magnetica sono meno tossici per le cellule perché l'assorbimento del materiale genetico è mediato dall'endocitosi e pinocytosis, due processi biologici naturali che non inducono danni significativi alle membrane cellulari. Pertanto, sia la vitalità cellulare che l'efficienza della trasduzione sono migliorate. L'efficienza della trasduzione può essere aumentata ulteriormente utilizzando piccoli frammenti di cripta o singole celle (vedi passo 4.8) invece di cripte più grandi o di organiidi interi come riportato in precedenza2,10,13,16. La distribuzione di nanoparticelle guidate magneticamente produce un rapido accumulo, penetrazione e assorbimento di vettori virali nelle cellule bersaglio2,13. Le nanoparticelle magnetiche sono fatte di ossido di ferro, che è completamente biodegradabile e rivestito con specifiche molecole cationiche proprietarie. L'associazione delle nanoparticelle con i vettori virali è ottenuta mediante l'aggregazione colloidale indotta dal sale e le interazioni elettrostatiche. Le nanoparticelle vengono poi concentrate sulle cellule da un campo magnetico esterno generato dalla piastra magnetica posta sotto la parabola di coltura. Mentre l'efficienza della trasduzione si avvicina al 95%, non tutte le cellule sono tradusse, il che è una limitazione a questa tecnica. Inoltre, i geni di interesse espressi endogenamente non vengono alterati come con gli approcci CRISPR/Cas9.
In seguito alla sovraespressione o al silenziamento genico, gli organoidi possono essere utilizzati per una miriade di studi, a seconda degli obiettivi scientifici, tra cui l'analisi dell'espressione genica, le alterazioni proteomiche all'interno delle cellule o secretite da cellule, alterazioni metaboliche e cambiamenti morfologici. Come per i tessuti viventi, è possibile ottenere sezioni congelate per studi immunohisofilici e immunofluorescenze di proteine specifiche come fattori di trascrizione, molecole citoplasmiche o marcatori di superficie cellulare. Il nostro articolo include un approccio efficace per ottenere sezioni congelate dagli organoidi senza disturbare la loro posizione e organizzazione nella cultura 3D. Questo è vantaggioso perché le tecniche precedenti richiedono la rimozione dell'organoide dalla matrice della membrana seminterrato prima del congelamento16. L'elaborazione degli organoidi mediante la rimozione dalla matrice potrebbe interrompere l'organizzazione strutturale dell'organoid piuttosto che riflettere la crescita e lo sviluppo in vitro.
Questo protocollo per gli organoidi intestinali geneticamente ingegnerici può anche essere adattato per studiare altri modelli cellulari e sistemi organoidi. Ad esempio, i sistemi organoidi pancreatici, colonici, epatici, cardiaci e cerebrali potrebbero essere trasdotti con questo approccio. Anche le cellule che crescono secondo tecniche di coltura più standard sono suscettibili alla tecnologia delle nanoparticelle. Inoltre, questo approccio può essere applicato per studiare i meccanismi molecolari delle malattie, non solo nel contesto dei sistemi organoidi derivati dalle cellule staminali, ma anche negli organoidi.
In sintesi, le modifiche chiave descritte in questi protocolli per gli studi organoidi intestinali, si spera, consentiranno agli scienziati di chiarire il ruolo dei fattori importanti e delle vie a valle coinvolte nella biologia delle cellule staminali intestinali e della loro progenie . Questi approcci dovrebbero fornire i mezzi per saperne di più sui meccanismi molecolari alla base dell'autorinnovamento, della determinazione del destino delle cellule, dell'omeostasi dei tessuti e della rigenerazione epiteliale intestinale, sia in condizioni fisiologiche che patologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), del Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), dell'American Lung Association, della Allegheny Health Network - Johns Hopkins Research Fund e il Centro di Ricerca di Base sulle Malattie Digestive Hopkins.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
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