Summary
Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.
Abstract
As culturas organoides intestinais proporcionam uma oportunidade única para investigar a biologia intestinal da célula-tronco e da cripta in vitro, embora abordagens eficientes para manipular a expressão gênica em organóides tenham feito progressos limitados nesta arena. Enquanto a tecnologia CRISPR/Cas9 permite a edição precisa do genoma das células para a geração de organoides, essa estratégia requer extensa seleção e triagem por análise de sequência, que é demorada e dispendiosa. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a transdução viral eficiente de organoids intestinais. Essa abordagem é rápida e altamente eficiente, diminuindo assim o tempo e a despesa inerentes à tecnologia CRISPR/Cas9. Nós igualmente apresentamos um protocolo para gerar seções congeladas das culturas organoid intactas para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemical ou Immunofluorescent, que pode ser usada para confirmar a expressão ou o silenciamento do gene. Após a transdução bem-sucedida de vetores virais para expressão gênica ou silenciamento é alcançada, a função de célula-tronco intestinal e cripta pode ser rapidamente avaliada. Embora a maioria dos estudos organoides empreguem ensaios in vitro, os organóides também podem ser entregues em camundongos para análises funcionais in vivo. Além disso, nossas abordagens são vantajosas para prever respostas terapêuticas às drogas porque as terapias atualmente disponíveis geralmente funcionam modulando a expressão gênica ou a função protéica em vez de alterar o genoma.
Introduction
A capacidade de cultura de rato ou células de criptas humanas como tridimensional (3D) organóides do intestino delgado ou cólon durante períodos prolongados de tempo proporcionou um grande avanço, porque estas culturas exibem características definidoras do epitélio intestinal in vivo 1. º , 2. º , 3. organóides derivados de criptas primárias são capazes de autorenovação e autoorganização, exibindo funções celulares semelhantes aos seus tecidos de origem. Na verdade, os organóides recapitulam não só a organização estrutural das criptas in vivo, mas também muitas características moleculares, proporcionando assim ferramentas úteis para estudar a biologia normal e os Estados da doença. Para ilustrar, os estudos organoid revelaram as vias moleculars novas envolvidas na regeneração do tecido1,2,3,4,5 assim como as drogas que poderiam realçar a função em configurações patológicas6,7.
O estudo das células estaminais intestinais é de particular interesse porque o revestimento intestinal está entre os tecidos de mamíferos mais altamente regenerativos, renovando-se a cada 3-5 dias para proteger o organismo de bactérias, toxinas e outros patógenos dentro do lúmens intestinais. As pilhas de haste intestinais (ISCS) são responsáveis para esta capacidade regenerativa notável e fornecem assim um paradigma original para estudar a função adulta da pilha de haste1,2. Experimentos de linhagem-rastreamento em camundongos demonstraram que células-tronco isoladas Lgr5-positivas podem ser cultivadas para gerar organóides 3D ou ' mini-Guts ' in vitro, onde eles espelham de perto suas contrapartes in vivo. Culturas organoides também podem ser derivadas de isolados de células de cripta intestinal, constituídos por progenitores, ISCs e células Paneth, sendo que estes últimos constituem as células de nicho epitelial in vivo. Na verdade, a cultura organóide de células de cripta intestinal primária evoluiu para uma técnica relativamente rotineira que é fácil de implementar na maioria dos laboratórios usando reagentes amplamente disponíveis. Este modelo também é capaz de análise quantitativa da expressão gênica por sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e proteínas por espectrometria de massas, imuno-histoquímica, ou coloração imunofluorescente2,4,8. Além, a genética funcional pode ser estudada usando o ganho--função (superexpressão do gene ou expressão de um gene de activação do mutante) ou perda--função (silenciamento do gene ou expressão de um mutante da perda--função) aproximações2.
Importante, a baixa eficiência e a toxicidade elevada do ADN padrão do plasmídeo ou dos protocolos virais da transdução com Polybrene permanecem um obstáculo principal no campo. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 permita a edição precisa do genoma, essa abordagem requer uma seleção demorada seguida pela validação da sequência9. Aqui, apresentamos um protocolo de transdução viral para organóides intestinais primários que otimiza a entrega de partículas virais por conjugação com nanopartículas magnéticas e aplicação de um campo magnético. Principais modificações aos protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 e recomendações para aumentar a eficiência são fornecidos. Nós igualmente descrevemos uma aproximação para gerar as seções congeladas dos organóides intactos cultivados no matrigel 3D (doravante referido como a matriz ou a matriz da membrana do porão) para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemistry ou Immunofluorescent.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais das instituições médicas Johns Hopkins (IACUC). Este protocolo é modificado a partir de um métodos publicados anteriormente10,11,12,13.
1. preparação de reagentes
- Prepare um meio fresco de 293T com várias horas de antecedência e aqueça a 37 ° c em um banho de água por pelo menos 10 min antes da utilização (tabela 1).
- Prepare DNA plasmídeo2,13,14 para embalagens virais. (Tabela 2).
- Adquira todos os outros materiais necessários (tabela de materiais).
2. Lentivirus ou retrovirus produção de partículas
- Propagação de células de rim de embrião humano (HEK) 293T (Dia 1)
- Prepare 1 150 mm cultura prato por revestimento com 50 μg/mL poli-D-lisina dissolvido em fosfato tampão salina (PBS; 10 mL/prato) para 1 h à temperatura ambiente (RT).
- Retire o tampão fosfato salina (PBS)/poly-D-lysine e lave o prato revestido duas vezes com 5 mL de PBS.
- Sementes de 293T (8 \ u201210 x 106) em meio 293T (tabela 1) a um volume total de 15 ml.
- Cultura 293T células durante a noite em uma incubadora padrão da cultura do tecido (37 ° c, 5% CO2).
- Transfection da pilha de HEK 293T (dia 2)
- Realize o transfection uma vez que as pilhas alcangaram 70-80% confluência (geralmente aproximadamente 24 h após a semeadura 8 \ u201210 x 106 pilhas).
- Preparar a mistura de transfecção utilizando uma abordagem eficiente, como uma formulação comercial de lipoalguns catiônicos (tabelas 1 \ u20122, tabela de materiais)2.
- Diluir o DNA de Lentivirus constrói12 (total ~ 24 ΜG de DNA plasmídeo, tabela 2) em 1,2 ml de meio de transfecção e incubar por 5 min em RT em tubos de 1,5 ml (tabela de materiais).
- Diluir a transfecção regente (36 μL) em 1,2 mL de meio de transfecção (tabela de materiais) e incubar em tubos de 5 ml por 5 min de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicione o reagente de Lentivirus (Step 2.2.2.1) ao reagente de transfecção (passo 2.2.2.2) e misture suavemente com pipetagem lenta para cima e para baixo utilizando um Pipet de 5 mL.
- Incubar a mistura durante 20 min em RT.
- Lave suavemente as células de 293T com 5 mL de meio de transfecção e substitua por 10 mL de meio de transfecção.
- Adicione os complexos DNA-lipídicos (da etapa 2.2.2.3) gota gota ao meio das células 293T e misture cuidadosamente a mídia nos pratos de cultura movendo-se em direções horizontais e verticais para garantir a distribuição igual dos complexos DNA-lipídicos em cada prato.
- Incubar por 6 h em uma incubadora padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).
- Após a incubação, substitua a mídia por um meio de coleta de vírus fresco de 20 mL (tabela 1).
- Coleta de vírus (dias 3 \ u20125)
- Colete meios do vírus em 50 tubos de mL, e armazene-os em um refrigerador de 4 ° c para uma concentração mais adicional.
- Substitua 20 mL de meio de coleta de vírus fresco a cada 24 h e cultura durante a noite (~ 24 h). Repita a coleta de mídia nos próximos 2 dias (dias 4 \ u20125).
- Assegure-se de que o volume total de meio coletado após o dia 5 seja ~ 60 mL (20 mL/dia x 3 dias).
- Concentração de vírus (dia 5)
- Centrifugue a mídia coletada (60 mL) por 5 min a 400 x g. Em seguida, passe o sobrenadante através de um filtro (0,45 μm poros) para remover quaisquer detritos celulares.
- Concentre o vírus adicionando 15 mL de mídia de vírus filtrada em uma unidade de filtro centrífugo (tabela de materiais). Centrifugador a 2.500 x g durante 15 min a 4 ° c. Porque o vírus não pode passar através deste filtro, ele será concentrado na câmara superior do filtro.
- Aspirar o fluxo através do tubo (câmara inferior) e adicionar mais 15 mL de sobrenadante de mídia de coleta viral restante para a mesma unidade de filtro centrífugo. Centrifugador como acima (2.500 x g para 15 minutos em 4 ° c) para concentrar o vírus adicional do sobrenadante.
- Repita o processo usando o mesmo filtro para 60 mL de mídia de uma única placa transfilada até que a concentração desejada seja atingida (~ 100 vezes).
Nota: nós tipicamente concentrar ~ 60 mL de mídia de coleta de vírus para ~ 600 μL. - Retire o vírus concentrado da câmara superior do filtro utilizando um Pipet de 1 ml, depois alíquota e guarde em tubos de 1,5 ml (50 \ u201260 μl/tubo) a-80 ° c para uso posterior. Armazene partículas concentradas por até 6 \ u201212 meses.
3. isolando criptas
- Eutanizar camundongos usando CO2 de acordo com as diretrizes locais da IACUC.
- Coloque o animal eutanasiado nas costas e lave o abdômen pulverizando com 70% de etanol.
- Realize uma incisão longitudinal de linha média do esterno à virilha, incitando a pele primeiro, e depois o tecido subcutâneo.
- Retire o intestino delgado do estômago para o cálio.
- Identificar regiões de interesse dentro do intestino delgado; as criptas podem ser isoladas do duodeno, do jejuno e do íleo.
- Usando uma seringa de 10 mL, lave o intestino delgado isolado com tampão de dissociação de cripta (PBS pré-resfriado contendo 1 mM de ditiothreitol (DTT), 1% de penicilina/estreptomicina (sem CA2 + e mg2 +)) em um prato de cultura de tecido de 10 cm (tabela 1) o
- Retire o tecido adiposo periférico, e abra ou "filé" o tecido intestinal longitudinalmente em uma placa de vidro estéril (15 cm x 15 cm).
- Raspe delicadamente fora dos Villi epithelial intestinais usando um raspador da pilha.
- Corte o intestino delgado em 2 \ u20123 cm de comprimento-sábio seções.
- Transfira o tecido para um tubo de 15 mL contendo PBS pré-resfriado usando pinça plana (116 mm). Lave os fragmentos de tecido agitando vigorosamente à mão por ~ 30 s (movendo o tubo em direções opostas ~ 60 vezes).
- Refresque o PBS e repita a lavagem até que o PBS se torne desobstruído.
Nota: nós normalmente lavar os fragmentos 2 \ u20123 vezes. - Incubar o tecido em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de tampão de dissociação de cripta (tabela 1) por 10 min a 4 ° c em um agitador orbital em velocidade média, uma vez que o PBS é claro.
- Agitar vigorosamente o tubo com a mão para ~ 30 s (direções opostas ≈ 60 vezes) e transferir o tecido usando pinça plana para outro 15 mL tubo cônico contendo 10 mL de cripta dissociação buffer. Incubar esta fração no gelo. Não use a primeira fração para cultura organóide porque ele contém principalmente Villi.
- Repita os passos 3.11 \ u 20123.13 para 3 \ u20124 vezes, coletando cada fração e colocando-os no gelo.
- Selecione a fração que é enriquecida com a maior percentagem de criptas intestinais através da digitalização de 200 μL de amostras de cada fração um microscópio invertido (4x). Identificar as criptas pela morfologia típica descrita anteriormente (Figura 1a)10.
Nota: Eles vão aparecer em forma redonda ou oval e contêm células Paneth granuladas. Por outro lado, as vilosidades são estruturas tipo dedo que faltam as células Paneth granulares (Figura 1b). - Passe a fração selecionada através de um filtro de células de 40 μm para obter criptas de tamanho semelhante, se necessário. Alternativamente, isolar células-tronco Lgr5 + com base na citometria de fluxo para a proteína fluorescente verde (GFP) se os camundongos são cruzados sobre o fundo EGFP-Lgr5 + ou outro modelo adequado que permite a identificação de células Lgr5 +2.
- Conte o número total de criptas na fração selecionada da seguinte maneira.
- Pipete 50 μL da fração selecionada em um hemociômetro e conte o número de criptas usando um microscópio de luz invertido (4x). Coloque ~ 100 criptas por poço ao usar uma placa 48-bem para permitir que os experimentos de transdução em que 3 \ u20126 poços serão dutransados por condição experimental para silenciamento genético ou superexpressão.
- Com base no número de criptas por 50 μL, calcule o volume de buffer de dissociação da cripta necessário e transfira esse volume para um tubo de 1,5 mL.
Nota: por exemplo, 10 criptas por 50 μL são contados, 6 x 50 μL ou 300 μL são necessários para as criptas 300.
- Centrifugue as criptas nos tubos de 1,5-mL a 300 x g durante 5 min.
- Elimine cuidadosamente o sobrenadante introduzindo suavemente a camada líquida superior e ressuscitar a pelota em 100 μL de fator de crescimento reduzida matriz de membrana basal no gelo (tabela de materiais).
- Semente a matriz-contendo criptas em um 37 ° c pre-aquecido 48-bem placa (30 μL/bem, ~ 100 criptas/bem). Incubar a placa em uma incubadora padrão da cultura do tecido para o minuto 5 \ u201215 para permitir a geladura da matriz (° c 37, 5% CO2).
- Sobreponha cada gel com 250 μL de cultura organoide (ENR) (tabela 1) e coloque as placas 48-well de volta em uma incubadora de cultura de tecidos padrão (37 ° c, 5% co2). Verific as culturas para a organização da cripta em formas pequenas, redondas, císticas após 24 h; os botões formarão após 2 \ u20125 dias.
- Substitua suavemente a mídia ENR a cada 3 dias. Remova os meios velhos de ENR com sucção delicada, tomando o cuidado para não tocar na matriz ao substituir meios.
- Culturas organoid da passagem cada 4 \ u20127 dias como descrito previamente11.
4. preparação de fragmentos organóides
- Transduce organóides uma vez que eles formam (dentro de 1 \ u20122 semanas) ou depois de ser passaged. Para uma única experiência da transdução, prepare 2 \ u20123 poços de organóides cultivados em uma placa 48-well por a circunstância com ~ 100 \ u2012200 organóides/poço ou ~ 200 \ u2012600 organóides por a condição experimental da transdução.
- Troca de ENR com 250 μL de mídia de transdução (tabela 1) e cultura na mídia de transdução por 3 ou mais dias ou até que os organóides adotem uma morfologia cística. Inclua o inibidor Wnt3a e ROCK (Y27632) no meio de transdução para aumentar o número de células caule e Paneth; A nicotinamida (NIC) melhora a eficiência da cultura (ver meio de transdução na tabela 1).
- Ruptura mecanicamente a estrutura da matriz da membrana do porão-como da abóbada com meios e uma ponta do Pipet usando um 1 mL de Pipet.
- Transfira os organóides e a mídia para um tubo estéril de 1,5 mL.
- Interromper mecanicamente a matriz mais por pipetagem com um 200 μL Pipet ~ 10 \ u201215 vezes.
- Centrifugue os fragmentos organóides em RT a 500 x g durante 5 min.
- Descarte o sobrenadante com cuidado usando uma pipeta e resuma a pelota em 1 mL de meio DMEM/F12 (tabela 1).
- Adicionar Dispase I (6 μL a 10 mg/mL) e DNase I (2,5 μL a 10 mg/mL). Misture bem pipetando suavemente utilizando um Pipet de 1 mL.
- Incubar organóides a 37 ° c durante 20 min no tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 500 μL de mídia ENR para encerrar a reação de dissociação; o soro no ENR encerra a reação.
- Passe as células organóides através de um filtro de células de 20 μm e centrifugue os fragmentos organoides em 400 x g por 5 min.
- Ressuspender fragmentos organoides com meio de transdução de 150 μL (tabela 1).
5. engenharia genética de organóides ou células cripta por transdução viral
Nota: Consulte a Figura 2.
- Aglomerados de células organóides com 200 μL de meio de transdução/poço em uma placa de 48 poços e incubar em uma incubadora padrão de cultura tecidual (37 ° c, 5% CO2). Alternativamente, coloc pilhas recentemente isoladas da cripta (~ 1.000 criptas) no meio do transdução de 200 μL/poço em uma placa 48-well e incubar em uma incubadora padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).
- Thaw frascos de vírus para transdução permitindo ~ 50 μL de vírus concentrado para transdução de cada poço em placas de 48 poços ou ~ 100 μL de vírus concentrado por poço em placas de 24 poços.
- Incubar o vírus com 12 μL de solução de nanopartículas magnéticas por 15 min em RT em um tubo de 1,5 mL (tabela 3).
- Adicione a mistura de solução/vírus de nanopartículas magnéticas às células a serem transacadas.
- Coloc a placa da cultura da pilha em uma placa magnética e incubar por pelo menos 2 h (e até ~ 6 h) em uma incubadora padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).
6. semeadura de fragmentos organóides infectados
- Transfira os aglomerados de células organóides e meios de transdução infectados de cada poço em um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugador a 500 x g durante 5 min.
- Descarte o sobrenadante com sucção suave e Resfrie o tubo contendo o pellet no gelo por 5 min.
- Adicionar 120 μL de matriz de membrana basal e ressuscitar o pellet pipetando lentamente para cima e para baixo.
- Semente 30 μL de gotas da mistura da matriz-pilha em uma placa 48-well nova.
- Incubar a placa a 37 ° c durante 5 u201215 min até que a matriz se solidifique.
- Adicione o meio da transdução a cada poço e incubar em uma incubadora padrão da cultura do tecido por 3 \ u20124 dias (37 ° c, 5% CO2).
- Após 3 \ u20124 dias, inspecione culturas um microscópio de luz (10x) para garantir a organização de aglomerados de células em estruturas organóides. Em seguida, substitua suavemente a mídia de transdução com 250 μL de meio ENR.
- Substitua a mídia a cada 3 \ u20124 dias.
7. seleção (se aplicável)
- Após 2 \ u20123 dias, adicione antibióticos ou hormonas relevantes para a seleção ao meio da transdução se apropriado.
Nota: Utilizou-se a puromicina (2 μg/ml) para a seleção da transdução lentivrial, pois os plasmívoros abrigaram um gene de resistência à puromicina2,14.
8. confirmação da transdução bem-sucedida e expressão gênica ou silenciamento
- Se usando o Lentivirus fugw2,14, estimamos a eficiência da transdução medindo sinais do GFP através do microscópio fluorescente ou do fluxo cytometry.
- Valide o superexpressão ou o silenciamento do gene usando a reacção em cadeia reversa quantitativa do polymerase do transcriptase (RT-PCR) para a comparação quantitativa de mRNA no controle e em culturas organoid experimentais.
- Confirme os níveis de proteína para a expressão gênica de codificação protéica ou silenciamento por Western blot ou imunocoloração2.
9. Cryosection organoid na matriz da membrana do porão
Nota: Consulte a Figura 3.
- Remova o meio de ENR pela sucção delicada, sendo cuidadoso não perturbe a matriz da membrana do porão e lave delicadamente uma vez com 500 μL de PBS.
- Fixar organóides com 1,0 mL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) (tabela de materiais) em RT por 30 min.
- Retire a PFA por sucção e lave suavemente duas vezes com 1 mL de PBS.
- Retire a PBS por sucção e adicione 1,0 mL de tampão de sacarose a 30% a cada amostra. Incubar organóides fixos em sacarose por 1 h a 4 ° c em sala fria, geladeira ou gelo para desidratar amostras.
- Retire o tampão de sacarose por sucção e acrescente apenas o suficiente composto de incorporação (tabela de materiais) para cobrir a camada de matriz (~ 300 μl/poço) em cada poço.
- Incubar em RT por 5 min.
- Coloque as amostras em um freezer de-80 ° c por 10 min, ou até que o composto de incorporação se transforme sólido e branco.
- Coloc o prato com o composto de incorporação congelado em RT para permitir o derretimento mínimo do composto ao longo das bordas. Use um bisturi para separar o bloco das paredes do poço.
- Remova o bloco composto de incorporação de matrizes usando fórceps e coloque-o em um bloco de amostra (por exemplo, crimológicas), trabalhando rapidamente para evitar o derretimento.
- Encha o molde completamente com o composto de incorporação e congele-se em-80 ° c por 30 minutos.
- Use o bloco para o corte ou armazenamento em-80 ° c freezer para uso posterior.
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Representative Results
Aqui, nós descrevemos uma técnica rápida e altamente eficiente da transdução que chicotes nanopartículas magnéticas expor a um campo magnético para entregar o Lentivirus às pilhas do interesse. Com ferramentas prontamente disponíveis, aplicamos esta abordagem não só para transduce células criptárias recém-isoladas (Figura 1a), mas também para organóides (Figura 2) e outras células refratárias a abordagens de transdução mais rotineiras. As partículas de Lentivirus podem facilmente ser conjugadas às nanopartículas magnéticas e os complexos resultantes do vírus-Nanoparticle são entregados eficientemente aplicando um campo magnético usando uma placa magnética. Para otimizar essa abordagem, testamos primeiro vetores lentivirais vinculados ao GFP, de forma que a GFP poderia ser usada para identificar células transviadas com microscopia de fluorescência. O GFP pode ser visualizado em cada estágio no desenvolvimento organoide, incluindo precocemente quando as células cripta se organizam em estruturas semelhantes a cistos (figura 4a), ou em pontos de tempo posteriores quando os organóides formam botões (Figura 4B). Os organóides intestinais transados com sucesso podem então submeter-se à análise funcional para alterações no desenvolvimento manchando as membranas e os núcleos de pilha para enumerar o número total da pilha além do que marcadores da linhagem, tais como o lisozima para identificar pilhas de Paneth ( Figura 4C).
Os organóides geneticamente modificados podem ser utilizados para posterior análise por meio da geração de seções congeladas, conforme descrito aqui (Figura 3). Após a incorporação de organóides, blocos congelados podem ser armazenados e posteriormente seccionados para estudos futuros. Esta abordagem também é eficiente (estimado para ser ~ 95% com base na percentagem de organóides GFP (+) para organóides totais). Esta abordagem pode ser realizada com reagentes laboratoriais padrão, proporcionando assim tecidos que são amáveis a diversas investigações, incluindo número de células, destino celular, e a presença e níveis de proteínas específicas2. Por exemplo, utilizamos seções congeladas e coloração imunofluorescente para identificar células individuais e verificar o tipo de célula (Figura 4C).
Figura 1: criptas isoladas e Villi com desenhos animados que mostram a morfologia típica. (A) as criptas isoladas formam estruturas redondas ou ovais. (B) os Villi são identificados como estruturas dedo-like. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema de transdução viral de organóides utilizando nanopartículas magnéticas e exposição a um campo magnético. As etapas mais críticas do protocolo de transdução são mostradas. (A) Incubar o vírus e a solução magnética da nanopartícula por 15 minutos em RT em um tubo de 1,5 ml. (B) adicionar as nanopartículas magnéticas/mistura de vírus às células a serem transacadas. (C) coloc a placa da cultura da pilha na placa magnética e incubar por 2 h em uma incubadora padrão da cultura do tecido. Tempos de incubação mais longos também podem ser usados (~ 6 h); o poço representativo é mostrado aqui na placa magnética. (D) é mostrada uma célula que está sendo transada com o vírus e a nanopartícula magnética. (E) transferir os clusters de células organóides e os meios de transdução infectados de cada poço para um tubo de 1,5 ml e centrifugar a 500 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante com sucção suave e resfriar o tubo contendo a pelota no gelo por 5 min. (F) adicionar 120 μL de matriz de membrana basal e ressuscitar a pelota introduzindo lentamente para cima e para baixo. (G) gotas de semente de 30 μl contendo uma mistura de células-matriz em cada poço em uma nova placa de 48 poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: esquema de seccionamento congelado de organóides em matriz 3D. As etapas mais críticas do protocolo de corte congelado são mostradas. (A) um único poço dentro de uma placa da cultura da pilha de 24 poços é representado. (B) adicione apenas o suficiente composto de incorporação para cobrir a camada de matriz (~ 300 μl/poço) e INCUBAR em RT por 5 min. (c) Coloque as amostras em-80 C em um freezer por 10 min ou até que o composto de incorporação gira sólido e branco. Em seguida, coloque o prato em RT para permitir uma ligeira fusão ao longo das bordas da amostra. (D) Use um bisturi para separar o bloco das paredes do poço. (E) Retire a matriz-encaixando o bloco composto usando o fórceps e coloc em um recipiente ou em um molde raso apropriado para congelar tecidos. Encha o molde completamente com o composto de incorporação (OCT). (F) congelar bloco em-80 C em um freezer por 30 min. (G) o bloco está pronto para o corte ou armazenamento em-80 c freezer para uso posterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens representativas de organóides intestinais transados. (A) imagem representativa de pequenos organoides intestinais microscópio de luz (esquerda) microscopia de fluorescência e, (direita) microscopia padrão de expressão transgênica (EGFP) no dia 3 após a transdução. Barra de escala = 50 μm. (B) exemplo de superexpressão do gene que codifica GFP no organoid após a transdução usando nanopartículas magnéticas. As pilhas organoid foram transfoviadas com o Lentivirus que expressa GFP (FUGW; Top) ou Lentivirus overexpressando Hmga1 (fugw-Hmga1; Inferior) como mostrado no dia 12 após a transdução. Barra de escala = 50 μm. (C) imagiologia por imunofluorescência da Secção congelada fixa de formalina de organóides. As seções organoid (4 μm) foram manchadas com o anti-lysozyme (vermelho), o anti-EpCAM (verde) e o DAPI (azul). Epcam demarca beiras da pilha, DAPI indicou núcleos individuais, e o lisozima mancha pilhas de Paneth. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio de cultura organóide (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 + | 96 mL |
| Suplemento de dipeptídeo l-alanyl-L-glutamina (por exemplo, Glutamax) | 1 mL de |
| A NEAA | 1 mL de |
| Pen/Strep | 1 mL de |
| HEPES | 1 mL de |
| EGF (100 μg/mL) | 5 μL de |
| Noggin (100 μg/mL) | 10 μL de |
| R-spondin (100 μg/mL) | 10 μL de |
| ou R-spondin meio de condição (CM) | 20 mL de |
| Insulina recombinante humana (10 mg/mL) | 5 μL de |
| Meio de transdução | 5 mL de |
| Meio de ENR | 2,4 mL |
| Meio da circunstância de WNT (CM) | 2,5 mL |
| Nicotinamida (1M) | 100 μL |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL de |
| Buffer de dissociação de criptas | 100 mL |
| PBS (sem CA2 +, mg2 +) | 99 mL |
| Pen/Strep | 1 mL de |
| 0,5 M EDTA | 100 μL |
| 0,1 M DTT (dithiothreitol) | 100 μL |
| 293T médio | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| Fbs | 10 mL de |
| Meio de coleta de vírus | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| Fbs | 1 mL de |
| Tampão de digestão organóide | 1 mL de |
| DMEM/F12 + | 1 mL de |
| Dispase I (10 mg/mL) | 6 μL de |
| DNase I (10 mg/mL) | 2,5 μL |
Tabela 1: mídia utilizada no protocolo.
| Placas | de 10 cm | 15 cm de |
| Vetor de transviação de Lentivirus | de 6 μg | de 9 μg |
| CMVΔR 8.91 | 8 μg de | 12 μg |
| Md. G | 2 μg de | 3 μg de |
| Total de vetores | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
Tabela 2: quantidade de DNA plasmídeo para transfecção.
| Placa | Grânulos magnéticos (μL) | Volume de vírus (μL) | Transiciona final volume (μL) |
| 48-bem | 6 | 50 | 250 |
| 24-bem | 12 | 100 | 500 |
Tabela 3: volume da solução e do vetor magnéticos do grânulo.
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Discussion
A cultura preliminar do epitélio intestinal adulto como organóides fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos moleculars envolvidos na função da pilha de haste, na homeostase epithelial intestinal, e na patologia1,2,3, a 4. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 possa ser usada para projetar geneticamente organóides9, ela é limitada pela necessidade de triagem e seleção extensas com base na análise sequencial para as alterações genéticas desejadas. O objetivo deste protocolo é fornecer instruções claras e concisas com tutoriais baseados em vídeo para a entrega de nanopartículas magnéticas de Lenti-ou retrovírus a organóides intestinais, seguidos por corte congelado para posterior análise.
Este protocolo é um método rápido e eficiente para projetar geneticamente organóides intestinais e analisar as conseqüências da superexpressão gênica ou silenciamento de seções congeladas. As etapas críticas são descritas na Figura 2, Figura 3. Essa estratégia permite a investigação do significado biológico de alterações genéticas (superexpressão ou silenciamento) em células-tronco intestinais e sua descendência cultivada em condições 3D2,13. Também utilizamos esta entrega magnética baseada em nanopartículas de vetores virais para melhorar a transdução celular e a expressão de trans-gene in vitro em diferentes células primárias2,13.
Com esta aproximação, as partículas virais são revestidas com as nanopartículas magnéticas e entregadas às pilhas pela exposição a um campo magnético. Comparado aos métodos atuais da transdução, tais como o Polybrene com ou sem spinoculation10,15, os complexos Nanoparticle-virais magnéticos são menos tóxicos às pilhas porque a captação do material genético é negociada pela endocitose e pinocitose, dois processos biológicos que ocorrem naturalmente que não induzem danos significativos às membranas celulares. Assim, a viabilidade da célula e a eficiência da transdução são reforçadas. A eficiência da transdução pode ser aumentada mais usando fragmentos pequenos da cripta ou únicas pilhas (veja etapa 4,8) em vez das criptas maiores ou dos organóides inteiros como relatado previamente2,10,13,16. A entrega de nanopartículas guiada magneticamente resulta em rápida acumulação, penetração e captação de vetores virais em células-alvo2,13. As nanopartículas magnéticas são feitas de óxido de ferro, que é totalmente biodegradável e revestida com moléculas catiônicas proprietárias específicas. A associação de nanopartículas com vetores virais é alcançada por agregação coloidal induzida por sal e interações eletrostáticas. As nanopartículas são então concentradas em células por um campo magnético externo gerado pela placa magnética colocada o prato de cultura. Enquanto a eficiência de transdução se aproxima de 95%, nem todas as células são dutransadas, o que é uma limitação dessa técnica. Além, os genes endogenamente expressos do interesse não são alterados como com as aproximações de crispr/Cas9.
Após a superexpressão ou silenciamento do gene, os organóides podem ser usados para uma infinidade de estudos, dependendo dos objetivos científicos, incluindo a análise da expressão gênica, alterações proteômicas dentro das células ou secretadas por células, alterações metabólicas e alterações morfológicas. Como com os tecidos vivos, as seções congeladas podem ser obtidas para estudos immunohistochemical e da imunofluorescência de proteínas específicas tais como fatores da transcrição, moléculas cytoplasmic, ou marcadores de superfície da pilha. Nosso artigo inclui uma abordagem eficaz para obter seções congeladas de organóides sem perturbar a sua posição e organização na cultura 3D. Isto é vantajoso porque as técnicas anteriores exigem a remoção do organoid da matriz da membrana do porão antes de congelar16. Processar organóides pela remoção da matriz poderia perturbar a organização estrutural do organoid um pouco do que reflete o crescimento e o desenvolvimento in vitro.
Este protocolo para projetar geneticamente organóides intestinais também pode ser adaptado para estudar outros modelos baseados em células e sistemas organoides. Por exemplo, os sistemas organoides pancreáticos, colônicos, hepáticos, cardíacos e cerebrais poderiam ser transados com essa abordagem. Mesmo as pilhas que crescem mais técnicas padrão da cultura são passíveis à tecnologia do nanopartícula. Além disso, essa abordagem pode ser aplicada para estudar os mecanismos moleculares de doenças, não apenas no contexto de sistemas organoides derivados de células-tronco, mas também em organóides tumorais.
Em síntese, as principais modificações descritas nestes protocolos para estudos organoides intestinais irão, esperançosamente, capacitar os cientistas a elucidar o papel dos factores importantes e das vias a jusante envolvidas na biologia das células estaminais intestinais e das suas progêulas . Essas abordagens devem fornecer os meios para aprender mais sobre mecanismos moleculares subjacentes à autorenovação, determinação do destino celular, homeostase tecidual e regeneração epitelial intestinal, condições fisiológicas e patológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional de saúde (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), a associação americana de pulmão, a rede de saúde Allegheny-Johns Fundo de pesquisa Hopkins e as doenças digestivas Hopkins Centro núcleo de pesquisa básica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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