Summary
基因编码扩展是研究广泛的生物过程, 包括蛋白质乙酰化的有力工具。在这里, 我们演示了一个轻便的协议, 利用这种技术, 在特定的地点, 在大肠杆菌细胞生成均匀乙酰蛋白。
Abstract
在蛋白质的特定位置发生的后平移修饰被证明在多种细胞过程中发挥重要作用。其中, 可逆赖氨酸乙酰化是最广泛分布在生活的所有领域之一。尽管已经进行了大量的质谱 acetylome 研究, 但对这些假定的乙酰化靶点的进一步定性是有限的。一个可能的原因是, 它是很难产生纯乙酰蛋白质在理想的位置, 大多数经典的生物化学方法。为了克服这一挑战, 基因编码扩展技术已被应用于使用一对工程 pyrrolysyl tRNA 合成酶变种, 其同源 tRNA 从Methanosarcinaceae物种, 以指导 cotranslational 公司成立acetyllysine 在特定的地点的蛋白质的利益。在首次应用于组蛋白乙酰化的研究中, 这种方法促进了对各种蛋白质的乙酰化研究。在这项工作中, 我们展示了一个简便的协议, 以生产现场特定的乙酰蛋白, 使用模型细菌大肠埃希菌作为宿主。以苹果酸脱氢酶为例。
Introduction
转录后的修饰 (PTMs) 的蛋白质发生后, 翻译过程, 并产生了共价键增加功能基团的氨基酸残留, 在几乎所有的生物过程中扮演重要的角色, 包括基因转录, 应激反应, 细胞分化和新陈代谢1,2,3。到目前为止, 已确定了大约400独特的 PTMs4。基因组和蛋白质的复杂性在很大程度上被蛋白质 PTMs, 因为它们调节蛋白质活性和定位, 并影响与其他分子的相互作用, 如蛋白质、核酸、血脂和因子5。
在过去二十年中, 蛋白质乙酰化一直处于 PTMs 研究的前沿6、7、8、9、10、11、12。在组蛋白中首次发现的赖氨酸乙酰化超过50年前的13,14, 已被仔细检查, 并已知存在于超过80转录因子、调节器和各种蛋白质15中, 16,17。对蛋白质乙酰化的研究不仅为我们提供了对其调节机制的更深的了解, 而且也为一些因功能失调而引起的疾病进行了指导治疗18,19,20,21,22,23. 据认为, 赖氨酸乙酰化只发生在真核生物, 但最近的研究表明, 蛋白质乙酰化也发挥关键作用的细菌生理学, 包括趋化性, 耐酸, 活化, 稳定致病性岛屿及其他毒力相关蛋白24,25,26,27,28,29。
一种常用的方法来生化的特点赖氨酸乙酰化是使用定点诱变。谷氨酰胺被用作 acetyllysine 的模拟, 因为它的大小和极性相似。精氨酸被用作非乙酰赖氨酸的模拟, 因为它在生理条件下保留了正电荷, 但不能乙酰。但是, 这两种模拟都不是真正的 isosteres, 并且并不总能产生预期的结果30。最严谨的方法是在特定的赖氨酸残留物中生成均匀的乙酰蛋白, 这对于大多数经典方法来说是困难或不可能的, 因为在自然界中, 赖氨酸乙酰化的低化学计量性7,11。这一挑战已被解开的遗传代码扩展战略, 采用了工程 pyrrolysyl-tRNA 合成酶变种从Methanosarcinaceae物种的收费 tRNAPyl与 acetyllysine, 利用主机用于抑制 mRNA 中的 UAG 停止密码子的平移机械, 并指示在目标蛋白31的设计位置中合并 acetyllysine。最近, 我们优化了这个系统, 改进了 EF Tu 绑定 tRNA32和升级后的 acetyllysyl-tRNA 合成酶33。此外, 我们在苹果酸脱氢酶34和氨-tRNA 合成酶35的乙酰化研究中应用了这种增强的并网系统。本文以苹果酸脱氢酶 (MDH) 为例, 研究了从分子克隆到生物化学鉴定的纯乙酰蛋白的生成方法, 并以此作为演示的例证。
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Protocol
1. 靶基因的定点诱变
注意: MDH 在pCDF-1向量中以CloDF13原点和20到 4034的副本号表示在 T7 启动子下。
- 介绍了琥珀色停止密码在该基因的位置140的引物 (向前底漆: GGTGTTTATGAC标记AACAAACTGTTCGGCG 和反向底漆: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), 按照指示的网站定向诱变试剂盒。
- 放大含有野生型苹果脱水基因的模板质粒, 通过聚合酶链反应 (PCR) 反应, 插入停止密码子突变。在反应混合物中, 包括12.5 µL 的 2X DNA 聚合酶组合物, 1.25 µL 10 µM 前引物, 1.25 µL 10 µM 反转底漆, 1 µL 模板 DNA (20 ng/µL) (pCDF-1质粒含有野生型 MDH 的基因), 9 µL 无核酸水。
- 使用 PCR 反应参数如下: 三十年代初变性在98° c;25周期十年代在98° c, 三十年代在55° c 和 3 min 在72° c;最后的引伸在72° c 为 3 min。PCR 后, 将放大的材料直接添加到激酶-连接-DpnI 酶混合从试剂盒1小时的室温 circularization 和模板去除。
注: 反应混合物含有1µL PCR 产物, 5 µL 2X 反应缓冲, 1 µL 10X 激酶连接 DpnI 酶混合, 3 µL 无核酸水。
- 使用 PCR 反应参数如下: 三十年代初变性在98° c;25周期十年代在98° c, 三十年代在55° c 和 3 min 在72° c;最后的引伸在72° c 为 3 min。PCR 后, 将放大的材料直接添加到激酶-连接-DpnI 酶混合从试剂盒1小时的室温 circularization 和模板去除。
- 添加5µL 的反应混合物的管25µL 解冻合格的大肠杆菌DH5α细胞从试剂盒。小心地弹管混合, 并将混合物放在冰上30分钟. 热冲击混合物在42° c 为三十年代和地方在冰为另外的5分钟。
- 吸管600µL 室温超优化汤与物抑制 (SOC) 介质从试剂盒到混合物, 孵育在37° c 为60分钟与晃动在 250 rpm, 传播100µL 到性肉汤 (LB) 琼脂板与相应的抗生素, 在37° c 的夜间孵育, 以 250 rpm 摇动。
- 选择4-6 个单一的殖民地到6毫升新鲜 LB 培养基与相应的抗生素, 并孵化在37° c 过夜与晃动 250 rpm。通过质粒纯化试剂盒从每一夜培养物中提取粒细胞, 按照制造商手册, 然后根据服务提供商的协议发送基因组进行 DNA 测序, 以确认停止密码子在正确位置的突变。
- 通过混合1毫升过夜培养和300µL 100% 亚砜, 在-80 ° c 下将应变存储在正确的顺序上。
2. 乙酰蛋白的表达
- 插入优化的 acetyllysyl-tRNA 合成酶33的基因, 并优化 tRNAPyl 32到pTech质粒。将 tRNA 合成酶基因置于本构lpp启动子下。将 tRNA 基因置于本构普罗克启动子34下。
- 将含有苹果酸脱氢酶的突变标记基因的表达载体34和包含优化的 acetyllysine 合并系统的质粒, 转化为25µL 解冻的合格的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞热休克在42° c 为十年代和地方在冰为另外5分钟。
- 吸管600µL 室温 SOC 介质进入混合物, 孵育在37° c 为60分钟, 晃动在 275 rpm, 传播100µL 到一个板块与100µg/毫升链霉素和50µg/毫升氯霉素, 和孵化过夜在37° c 与晃动在 275 rpm。
- 拿起一个单一的殖民地从板块, 并接种到15毫升新鲜 LB 培养基与100µg/毫升链霉素和50µg/毫升氯霉素在50毫升管夜间在37° c 与晃动的速度为 250 rpm。在1升烧瓶中用抗生素将15毫升过夜培养到300毫升新鲜 LB 培养基, 在37° c 下孵育, 在 250 rpm 时晃动。
- 用清水溶解 acetyllysine, 使100毫米库存溶液, 贮存在4° c。添加5毫米 acetyllysine 和20毫米烟酰胺 (抑制剂乙酰) 的增长媒体时, 吸光度达到 0.5, 在 600 nm。
- 在37° c 下增加1小时的细胞, 摇动 250 rpm, 然后增加0.5 毫米 IPTG 蛋白表达, 并在25° c 的夜间生长细胞, 以 180 rpm 摇动。
注意:表达条件可能需要对不同的蛋白质进行优化。
- 在37° c 下增加1小时的细胞, 摇动 250 rpm, 然后增加0.5 毫米 IPTG 蛋白表达, 并在25° c 的夜间生长细胞, 以 180 rpm 摇动。
- 收集细胞的离心在 3000 x g 在4° c 的15分钟, 丢弃上清液, 用磷酸盐缓冲的生理盐水 (PBS) 缓冲洗涤细胞小球 (10 毫米 Na2HPO4, 1.8 mm,2PO4, 137 毫米氯化钠, 2.7 mm 氯化钾)。收集洗涤的细胞在 1万 x g 在4° c 为5分钟, 放弃上清, 并且存放细胞小球在-80 ° c。
3. 乙酰蛋白的纯化
- 解冻冰冻细胞在冰上的颗粒并重新悬挂15毫升的裂解缓冲液 (50 毫米三 (羟甲基) 氨基 (三) pH 7.8, 300 毫米氯化钠, 20 毫米咪唑, 20 毫米烟酰胺), 5 µL β-基和1µL Benzonase 核酸 (250 单位)。
- 打破细胞由40赫超声在70% 功率输出与10周期的十年代短脉冲, 其次是三十年代的时间间隔, 冷却形成原油提取物。离心机粗提取物在 2万 x g 为25分钟在4° c。用0.45 µm 膜过滤器过滤上清液, 并将1毫升的镍三酸 (镍-NTA) 树脂平衡和20毫升的水和20毫升的裂解缓冲物载入一列。
注意:如果超声不可用, 也可以用温和的洗涤剂打破细胞。 - 用20毫升洗涤缓冲液 (50 mm ph 7.8, 300 毫米氯化钠, 50 毫米咪唑和20毫米烟酰胺) 冲洗柱, 然后洗与2毫升洗脱缓冲液 (50 毫米三 ph 7.8, 300 毫米氯化钠, 150 毫米咪唑, 和20毫米烟酰胺)。
- 淡化的洗脱馏分与脱盐缓冲 (25 毫米三 pH 7.8 和10毫米氯化钠) 的 PD-10 柱, 按照制造商的手册。按照布拉德福德蛋白测定试剂的指示, 测定洗蛋白的浓度。盐水蛋白为进一步的实验做好了准备。
注意:使50% 的甘油库存的蛋白质, 并保持在-80 ° c 存储。
4. 乙酰蛋白的生化特性
-
SDS-页和质谱分析。
- 变性蛋白质与十二烷基硫酸钠 (sds) 样品缓冲 (5 µL 蛋白质样品与2µL 4X sds 样品缓冲) 在2毫升管子在105° c 为 5 min, 离心混合物在 2000 x g 为十年代, 装载到4-20% 钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶 electrophoresis (SDS 页) 凝胶, 并运行在200伏30分钟。
- 用蒸馏水清洗凝胶, 轻轻摇动5分钟, 重复过程3次。将水丢弃, 用马斯亮的蓝色污渍将凝胶沾上1小时, 并轻轻摇动。用蒸馏水把凝胶弄脏, 轻轻摇动30分钟, 重复这个 de 污点3次。
- 削减 33 kDa 在马斯亮蓝染色的 SDS 页凝胶带, 并发送到质谱仪设施或公司, 以确认 acetyllysine 被纳入设计的立场。
注: 质谱分析的协议在上一次实验之前34。
-
西部印迹
- 在步骤4.1 中使用相同的协议运行 SDS 页凝胶。在凝胶奔跑以后, 浸泡胶凝体与转移缓冲 (25 毫米三, 192 毫米甘氨酸, pH 8.3 和20% 甲醇) 为 15 min。
- 激活一个0.2 µm, 7 厘米 x 8.5 厘米的聚偏氟 (PVDF) 膜与甲醇为1分钟, 并在准备转移三明治前用转移缓冲液冲洗。
注意:甲醇是危险的情况下, 皮肤接触, 眼睛接触, 摄入, 或吸入。严重过度暴露会导致死亡。 - 使从阴极到阳极 (海绵, 滤纸, SDS 页凝胶, PVDF 膜, 滤纸, 海绵) 的转移三明治。将栈放入转印罐中, 在350毫安的恒定电流下运行45分钟。
注意:传输时间可能需要优化。 - 用25毫升三缓冲盐水冲洗 PVDF 膜, 0.1% 吐温 20 (TBST) (137 毫米氯化钠, 20 毫米三, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 缓冲液为5分钟, 轻柔摇动。在室温下, 用5% 牛血清白蛋白 (BSA) 在 TBST 缓冲膜中阻挡1小时。
- 用 HRP 结合的 acetyllysine 抗体孵育膜, 最终浓度为1µg/毫升稀释, 在 TBST ° c 的情况下, 一夜之间用 5% BSA 进行温和摇动。
注意:为了更快的结果, 这一步可以在室温下执行1小时。抗体的稀释可能需要优化。 - 用20毫升 TBST 缓冲液冲洗膜, 5 分钟, 轻轻摇动, 重复步骤4次。按照制造商的指示, 将化学发光基板应用到膜上。用电荷耦合器件 (CCD) 相机为基础的成像器捕捉信号。
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Representative Results
乙酰 MDH 蛋白的产量为每 1 l 培养15毫克, 而野生型 MDH 为31毫克, 每 1 l 培养。用 SDS-页分析纯化蛋白, 如图 1所示。使用野生类型的 MDH 作为正控制34。从细胞中纯化的 acetyllysine (AcK) 合并系统和突变的mdh基因, 但在生长培养基中没有 AcK, 被用作阴性对照。用 acetyllysine 抗体检测纯化蛋白的赖氨酸乙酰化, 如图 2所示。用串联质谱分析法证实了赖氨酸渣140在苹果酸脱氢酶中的乙酰化, 如图 3所示。
MDH 蛋白的蛋白质序列 (串联 MS 分析的片段是黑体):
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
优化 acetyllysyl tRNA 合成酶的蛋白质序列33:
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
优化 tRNA 的基因序列Pyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA
图 1: 马斯亮蓝染色 SDS-页凝胶的纯化全长 MDH 及其含 AcK 变种.同样体积的洗脱分数被加载到 SDS 页凝胶。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 纯化野生型 MDH 及其含 AcK 变种的印迹.同样体积的洗脱馏分被加载。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 含 AcK 的 MDH 变体的 LC/ms 分析.肽的串联质谱 (残滓 135-142) AGVYDKACNK 从纯化乙酰 MDH 变种。KAC表示 AcK 合并。含有 AcK 的肽的部分序列可以从注释的 b 或 y 离子系列中读取。匹配的峰值为红色。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
非氨基酸 (ncAAs) 的基因合并是基于对一个被分配的密码子的镇压, 主要琥珀色的中止密码子 UAG36,37,38,39, 由 ncAA 充电 tRNA包含相应的子。众所周知, UAG 密码子是公认的释放 factor-1 (RF1) 的细菌, 它也可以抑制附近同源转运从主机的标准氨基酸 (cAAs), 如赖氨酸和酪氨酸40,41。因此, ncaa 在 UAG 密码子中的注册效率取决于 ncaa-转运和 RF1 之间的竞争, 而 ncaa 公司的成立则依赖于 ncaa 的转运和近同源转运之间的竞争。目标乙酰蛋白的低产量和纯度可能是由于引入宿主细胞的正交对的低并网效率造成的。这一问题可以通过增加介质中的 acetyllysine 浓度来解决, 并使用最近优化的 acetyllysine 合并系统, 这增加了 UAG 密码器抑制58次32,33, 这两个acetyllysine 公司的效率和纯度将得到提高。如图 1所示并比较蛋白质的产量, acetyllysine 合并的效率约为 50%, 并且没有可检测的蛋白纯化的细胞窝藏的 ack 注册系统和突变基因的 MDH, 但没有 AcK生长媒介, 表明高纯度 acetyllysine 并网。此外, 质谱分析也没有显示任何 cAAs 的位置140的 MDH, 表明同质性的 acetyllysine 成立。
这种方法有两个主要的限制。首先, 由于 acetyllysine 的 tRNA 与 RF1 的竞争, 以及在上面描述的近同源转运, 目前, 可以同时纳入单个蛋白质的最大 acetyllysine 残留量是三33,42。其次, 细胞有其他类型的乙酰, 抗烟酰胺和可能 deacetylate 某些靶蛋白。因此, 这些蛋白在特定的部位可能达不到100% 的乙酰化。最近, 我们建立了一个 acetyllysine 合并系统, 可作为非 deacetylable 模拟的 acetyllysine43, 因此这个系统可以是一个很好的替代方法在这种情况下。
如前所述, 经典的生化特征赖氨酸乙酰化的方法是使用定点诱变。谷氨酰胺被用作 acetyllysine 的模拟, 精氨酸被用作非乙酰赖氨酸的模拟。但是, 这两种模拟都不是真正的 isosteres, 并且并不总是产生预期的结果30。基因编码扩展策略可以在特定的赖氨酸残留物中生成均匀的乙酰蛋白, 这是乙酰蛋白质的最严格的表征方法。
acetyllysine 的遗传整合系统是从一对 pyrrolysyl-tRNA 合成酶变种, 其同源 tRNA 从Methanosarcinaceae物种, 这也被称为在真核生物44正交。以往的研究表明, 该系统可以应用于哺乳动物细胞和某些动物的蛋白质乙酰化研究39, 因此, 目前的协议可以扩大到哺乳动物细胞, 甚至动物更广泛的应用在医疗研究和工业。此外, 该协议实质上也是用于合并不同类型的 ncAAs 的相同协议, 因此必须对引入到宿主单元中的正交对进行简单的更改。
赖氨酸乙酰 (KDACs) 从蛋白质的乙酰赖氨酸残留物中除去乙酰基,45。sirtuin 型科布是唯一的已知的乙酰在大肠杆菌,可以抑制烟酰胺27。因此, 为了防止在细胞生长和蛋白质纯化过程中产生的乙酰蛋白的脱乙酰度, 应在生长培养基和纯化缓冲液中加入20至50毫米的烟酰胺。一旦纯化, 由于缺乏乙酰, 赖氨酸残留物的乙酰化相对稳定。其次, 为了降低蛋白质中其他赖氨酸残留物的非特异性乙酰化的背景, BL21 (DE3) 菌株被用作表达菌株, 其蛋白乙酰化水平明显低于常用的 K12-derived 菌株46.如图 2所示, 从 BL21 (DE3) 细胞中表达的野生型 MDH 没有被西方印迹所检测到的乙酰化。这是提高靶蛋白乙酰化纯度的另一个重要因素。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国立卫生研究院 (AI119813) 的支持, 这是来自阿肯色州大学的起步, 也是来自阿肯色州生物科学研究所的奖项。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
References
- Krishna, R. G., Wold, F.
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M.
- Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
- Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T.
- Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
- Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
- Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
- Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
- Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
- Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
- Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
- Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
- You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
- Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E.
- Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
- Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
- Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
- Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
- Jones, J. D., O'Connor, C. D.
- Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
- Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
- Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
- Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
- Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M.
- Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
- Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
- Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D.
- O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
- Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
- O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
- Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
- Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
- Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
- Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).
