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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Abstract

Modificaciones post-traduccionales que ocurren en las posiciones específicas de proteínas han demostrado desempeñar un papel importante en una variedad de procesos celulares. Entre ellos, la acetilación reversible de la lisina es uno de los más ampliamente distribuidos en todos los ámbitos de la vida. Aunque se han realizado numerosos estudios de acetylome basada en espectrometría de masa, más caracterización de estos objetivos de acetilación putativo ha sido limitada. Una razón posible es que es difícil generar proteínas puramente acetiladas en posiciones deseadas por mayoría enfoques bioquímicos clásicos. Para superar este reto, se ha aplicado la técnica de expansión del código genético para utilizar el par de una variante de ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa y su cognado tRNA de las especies de Methanosarcinaceae , para dirigir la incorporación cotranslacional de acetyllysine en el sitio específico en la proteína de interés. Después de la primera aplicación en el estudio de la acetilación de histonas, este enfoque ha facilitado estudios de acetilación sobre una variedad de proteínas. En este trabajo, hemos demostrado un protocolo fácil para producir proteínas site-specifically acetiladas utilizando la bacteria Escherichia coli de la modelo como anfitrión. Malato deshidrogenasa fue utilizada como un ejemplo de demostración en este trabajo.

Introduction

(PTMs) las modificaciones post-traduccionales de las proteínas ocurren después del proceso de traducción y surgen de adición covalente de grupos funcionales a los residuos del aminoácido, jugando papeles importantes en casi todos los procesos biológicos, incluyendo gene transcripción, respuesta al estrés, diferenciación celular y metabolismo1,2,3. Hasta la fecha, cerca de 400 distintivo PTMs han sido identificados4. La complejidad del genoma y el proteoma se amplifica en gran medida por la proteína MPa, regular localización y actividad de la proteína, y afectan la interacción con otras moléculas como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y cofactores5.

Acetilación de proteínas ha estado a la vanguardia de los estudios de MPa en las última dos décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilación de la lisina fue descubierta en las histonas hace más de 50 años13,14, ha sido bien analizado y se sabe para existir en más de 80 factores de transcripción, reguladores y varias proteínas15, 16,17. Estudios sobre la acetilación de proteínas no sólo nos proporciona una comprensión más profunda de sus mecanismos reguladores, sino también guiada por tratamientos para un número de enfermedades causadas por acetilación disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. se creía que la acetilación de la lisina ocurre solo en eucariotas, pero estudios recientes han demostrado que la acetilación de proteínas también juega un papel clave en la fisiología bacteriana, incluyendo chemotaxis, resistencia ácida, la activación y estabilización de Islas de patogenicidad y virulencia otra relacionadas con las proteínas24,25,26,27,28,29.

Un método comúnmente utilizado para caracterizar bioquímicamente la acetilación de la lisina está utilizando mutagénesis sitio-dirigida. Glutamina es utilizada como un imitador de acetyllysine debido a su tamaño y polaridad similar. Arginina es utilizada como un imitador de lisina no acetilado, ya que conserva su carga positiva en condiciones fisiológicas pero no puede ser acetilado. Sin embargo, ambos imitadores no son isosteres reales y no siempre producen los resultados esperados30. El enfoque más riguroso es generar homogéneo acetiladas proteínas en residuos de lisina específico, que es difícil o imposible por métodos más clásicos debido a la baja estequiometría de acetilación de la lisina en naturaleza7,11. Este desafío ha sido desentrañando la estrategia de expansión del código genético, que emplea una ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa variante de especies Methanosarcinaceae para cargar tRNAPyl con acetyllysine, utiliza el host traslacional maquinaria para suprimir la UAG stop codon en el mRNA y dirige la incorporación de acetyllysine en la posición diseñada de la proteína blanco del31. Recientemente, hemos optimizado este sistema con una mejor EF-Tu-Unión tRNA32 y un actualizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33. Además, hemos aplicado este sistema mayor incorporación en estudios de acetilación de la malato deshidrogenasa34 y Tirosil tRNA sintetasa35. Aquí, demostramos el protocolo para la generación de proteínas puramente acetiladas de la clonación molecular para identificación bioquímica mediante el uso de malato deshidrogenasa (MDH), que hemos estudiado como ejemplo demostrativo.

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Protocol

1. dirigida mutagénesis Gene de la blanco

Nota: MDH se expresa bajo el promotor de T7 en el vector de pCDF-1 con el origen de CloDF13 y un número de copia de 20 a 4034.

  1. Introducir el codón ámbar en la posición 140 en el gene de cartillas (adelante cartilla: GGTGTTTATGACetiquetaAACAAACTGTTCGGCG y revertir la cartilla: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), siguiendo las instrucciones del kit de mutagénesis sitio-dirigida.
  2. Amplificar el plásmido de plantilla que contiene el gen de la dehidratasa del malato de tipo salvaje e inserte la mutación del codón de parada por la reacción de polimerasa (PCR) reacción en cadena. En la mezcla de reacción, son 12,5 μl de mezcla de enzima de polimerasa de ADN X 2, 1.25 μl de primer avance de 10 μm, 1,25 μl de cebador inverso de 10 μm, 1 μl de ADN de plantilla (20 ng/μL) (pCDF-1 plásmido que contiene el gen de tipo salvaje MDH) y 9 μl de agua libre de nucleasa.
    1. Utilizar parámetros de reacción de polimerización en cadena del siguiente modo: inicial de desnaturalización a 98 ° C por 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y a 3 min a 72 ° C; extensión final a 72 ° C durante 3 minutos. Después de la polimerización en cadena, agregue el material amplificado directamente a la mezcla de enzima quinasa-ligasa-DpnI del kit por 1 h a temperatura ambiente para la eliminación de la circularización y plantilla.
      Nota: La mezcla de reacción contiene 1 μl del producto PCR, 5 μl de 2 X Buffer de reacción, 1 μl de mezcla de enzima quinasa-ligasa-DpnI de X 10 y 3 μl de agua libre de nucleasa.
  3. Añadir 5 μl de la mezcla de reacción con el tubo 25 μl descongelado competentes de e. coli DH5α células del kit. Cuidadosamente el tubo para mezclar la película y coloque la mezcla en hielo durante 30 min choque del calor la mezcla a 42 ° C por 30 s y el lugar en hielo durante 5 minutos adicionales.
    1. Pipetear 600 μl de caldo Super óptima con los medios de represión (SOC) de catabolito del kit de temperatura en la mezcla, incubar a 37 ° C durante 60 min, con agitación a 250 rpm, 100 μL en una placa de agar de lisogenia caldo (LB) con el correspondiente antibiótico de propagación e incubar toda la noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
  4. Seleccionar colonias solo 4-6 en 6 mL fresco LB medios con el antibiótico correspondiente e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Extraer plásmidos de cada cultura durante la noche por el kit de purificación del plásmido, siguiendo el manual del fabricante, luego enviar plásmidos para la secuenciación del ADN según el protocolo de la empresa para confirmar la mutación del codón de parada en posición correcta.
  5. Almacenar la tensión con la secuencia correcta a-80 ° C mediante la mezcla de cultura durante la noche de 1 mL y 300 μL 100% DMSO.

2. expresión de la proteína acetilada

  1. Introducir los genes de optimizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33 y optimizado tRNAPyl 32 en el plásmido de pTech . Lugar gen tRNA sintetasa bajo el promotor constitutivo lpp . Lugar el gen tRNA bajo el promotor constitutivo proK del34.
    1. Transformar conjuntamente la expresión vector34 que contiene el gene transformado que contiene la etiqueta de la malato deshidrogenasa, y el plásmido que el sistema de incorporación de acetyllysine optimizado, en 25 μl descongeladas competente e. coli BL21(DE3) células por choque térmico a 42 ° C por 10 s y el lugar en el hielo durante 5 minutos adicionales.
    2. Pipetear 600 μl de medio SOC de temperatura en la mezcla, incubar a 37 ° C durante 60 min con agitación en rpm 275, extensión 100 μL en una placa con estreptomicina μg/mL 100 y 50 μg/mL cloranfenicol e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 275 rpm.
  2. Recoger una sola Colonia de la placa e inocular en medios LB frescos 15 mL con 100 estreptomicina μg/mL y el cloramfenicol 50 μg/mL en un tubo de 50 mL durante la noche a 37 ° C con agitación a la velocidad de 250 rpm. Transferencia de la cultura durante la noche de 15 mL a 300 mL fresco LB medios con antibióticos en un matraz de 1 L e incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
  3. Disolver acetyllysine con agua para hacer la solución stock de 100 mM, almacenar a 4 ° C. Añadir acetyllysine de 5 mM y 20 mM nicotinamida (inhibidor de desacetilasas) a los medios de crecimiento cuando la absorbancia alcanza 0.5 a 600 nm.
    1. Cultivar células por un adicional 1 h a 37 ° C, agitación a 250 rpm, añada 0,5 mM IPTG para expresión de la proteína y crecen las células a 25 ° C durante la noche, con agitación a 180 rpm.
      Nota: Las condiciones de expresión necesario optimización para diferentes proteínas.
  4. Recogen las células por centrifugación a 3.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos, descartar el sobrenadante y lavar el pellet celular con el tampón fosfato salino (PBS) buffer (10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Recoger las células lavadas a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante y almacenar pellets de células a-80 ° C.

3. purificación de la proteína acetilada

  1. Descongelar los pellets de células congeladas en el hielo y vuelva a suspender con 15 mL de tampón de lisis (50 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 20 mM y 20 mM nicotinamida), 5 μl de β-mercaptoetanol y nucleasa de Benzonase μL 1 (250 unidades).
  2. Rompen las células por sonicación de 40 kHz a 70% potencia de salida con 10 ciclos de ráfagas cortas de 10 s, seguidos por intervalos de 30 s para la refrigeración de extracto crudo de la forma. Extracto de centrífuga crudo a 20.000 x g durante 25 minutos a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante con el filtro de membrana de 0,45 μm y cargar en una columna que contiene 1 mL de resina (Ni-NTA) ácido nitrilotriacético níquel, equilibrada con 20 mL de agua y 20 mL de tampón de lisis.
    Nota: Las células también podrían romper por detergentes suaves, si no hay baño de ultrasonidos.
  3. Lavar la columna con 20 mL de tampón de lavado (50 mM Tris, pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 50 mM y 20 mM nicotinamida) y luego eluir con 2 mL de tampón de elución (50 mM Tris, pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 150 mM y 20 mM nicotinamida).
  4. Desalar la fracción de elución con buffer 25 mM Tris pH 7,8 y 10 mM (NaCl) la desalación la columna PD-10, siguiendo el manual del fabricante. Medir la concentración de la proteína eluída siguiendo la instrucción del reactivo de análisis de la proteína de Bradford. La proteína desalada está lista para más experimentos.
    Nota: Hacer stock de glicerol 50% de la proteína y guardar en-80 ° C para el almacenamiento.

4. bioquímico caracterización de la proteína acetilada

  1. Análisis de SDS-PAGE y masa espectrometría.
    1. Desnaturalizar las proteínas con el sodio dodecil sulfato (SDS) tampón de muestra (5 μl proteína muestra con 2 μl 4 X tampón SDS) en un tubo de 2 mL a 105 ° C por 5 min, centrifugar la mezcla a 2000 x g durante 10 s, carga sobre el 4-20% sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel este gel oresis (SDS-PAGE) y ejecutar a 200 V durante 30 minutos.
    2. Lavar el gel con agua destilada y agitar suavemente durante 5 min, repetir el proceso 3 veces. Deseche el agua y teñir el gel con colorante azul de Coomassie para 1 h con agitación suave. -Teñir el gel con agua destilada, agitar suavemente durante 30 minutos y repita esto de manchas 3 veces.
    3. Corte la banda de 33 kDa en el gel SDS-PAGE teñido de azul de Coomassie y envían a instalaciones de espectrometría de masas o las empresas para confirmar que la acetyllysine fue incorporada en la posición diseñada.
      Nota: El protocolo de análisis de espectrometría de masas siguió el experimento anterior34.
  2. El borrar occidental
    1. Correr el gel SDS-PAGE con el mismo protocolo en el paso 4.1. Después el gel ejecutar, poner en remojo el gel con el tampón de transferencia (25 mM Tris, glicina 192 mM, pH 8.3 y 20% metanol) durante 15 minutos.
    2. Activar un 0.2 μm, membrana de difluoruro (PVDF) del polivinilideno de 7 cm x 8,5 cm con metanol durante 1 min y lavar con tampón de transferencia antes de preparar el sándwich de transferencia.
      Nota: El metanol es peligroso en caso de contacto con la piel, contacto con los ojos, ingestión o inhalación. La sobreexposición severa puede causar la muerte.
    3. Hacer el sandwich de la transferencia del cátodo al ánodo (esponja, papel de filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, papel de filtro y esponja). Poner la pila en el tanque de la transferencia, a una corriente constante de 350 mA para 45 minutos.
      Nota: Tiempo de transferencia puede necesitar optimización.
    4. Lavar la membrana PVDF con 25 mL con tampón Tris salino, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween 20, pH 7,6) buffer por 5 min con agitación suave. Bloquear la membrana con 5% albúmina sérica bovina (BSA) en el buffer TBST por 1 h a temperatura ambiente.
    5. Incubar la membrana con acetyllysine-anticuerpo conjugado con HRP con una concentración final de 1 μg/mL diluido con 5% de BSA en TBST a 4 ° C durante la noche con agitación suave.
      Nota: Para resultados más rápidos, este paso podría realizarse a temperatura ambiente durante 1 hora. La dilución del anticuerpo puede necesitar optimización.
    6. Lavar la membrana con 20 mL de tampón de TBST por 5 min con agitación suave, repetir el paso 4 veces. El sustrato de la quimioluminescencia se aplica a la membrana siguiendo las instrucciones del fabricante. Capturar la señal con un sensor de cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).

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Representative Results

El rendimiento de proteína MDH acetilado fue 15 mg por cultura de 1 L, mientras que la de tipo salvaje MDH fue 31 mg por cultura de 1 L. Proteínas purificadas fueron analizadas por SDS-PAGE, como se muestra en la figura 1. El MDH de tipo salvaje fue utilizado como un control positivo de34. La proteína purificada de células que el sistema de incorporación de acetyllysine (AcK) y el gen mutante mdh , pero sin confirmación en medios de crecimiento, se utilizó como control negativo. Acetilación de la lisina de las proteínas purificadas fue detectada por western blot utilizando el anticuerpo acetyllysine como se muestra en la figura 2. La acetilación de los residuos de lisina 140 en malato deshidrogenasa fue confirmada por análisis de espectrometría de masas tándem como se muestra en la figura 3.

La secuencia de la proteína de la proteína MDH (el fragmento para análisis de MS tandem está en negrita):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

La secuencia de la proteína de acetyllysyl optimizado-tRNA sintetasa33:

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

La secuencia del gene del tRNA optimizadoPyl 32:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
Figura 1 : El Coomassie teñido de azul gel de SDS-PAGE de MDH purificada de larga duración y su variante que contiene AcK. Los mismos volúmenes de elución fracciones fueron cargadas en el SDS-PAGE gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : El borrar occidental de purificada MDH de tipo salvaje y su variante que contiene AcK. Los mismos volúmenes de fracciones elución fueron cargados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : LC-MS/MS análisis de variante de AcK que contiene MDH. El tándem espectro de masas de los péptidos (residuos 135-142) AGVYDKACNK de purificada acetilado variante MDH. KAC denota incorporación de AcK. La secuencia parcial del péptido que contiene el AcK se puede leer de la anotada b o serie de ion y. Emparejado picos estaban en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La incorporación genética de noncanonical aminoácidos (ncAAs) se basa en la supresión de un codón asignado, sobre todo el ámbar stop codón UAG36,37,38,39, por el tRNA cargado de ncAA que contiene el anticodon correspondiente. Como es sabido, el codón UAG es reconocido por el factor de liberación-1 (RF1) en bacterias y puede también ser suprimido por cerca de tRNAs cognado de anfitriones por aminoácidos canónicos (cAAs) como lisina y tirosina40,41. Por lo tanto, la eficacia de la incorporación de la ncAA en el codón UAG depende de la competencia entre ncAA-tRNAs y RF1, mientras que la pureza de la incorporación de la ncAA se basa en la competencia entre los tRNAs cargados de ncAA y cAA-cargado cerca de tRNAs cognado. Bajo rendimiento y la pureza de la proteína diana acetilado pueden ser causadas por la eficacia de incorporación bajo del par orthogonal introducido en las células hospedadoras. Este problema podría solucionarse aumentando la concentración de acetyllysine en los medios de comunicación y utilizando recientemente optimizado sistemas de incorporación de acetyllysine, que aumentaron la represión de codón UAG veces 5832,33, ambos se mejorará la eficiencia y la pureza de la incorporación de acetyllysine. Como se muestra en la figura 1 y la comparación de rendimientos de proteína, la eficacia de la incorporación de acetyllysine era alrededor del 50% y no había detectable proteína purificada a partir de las células que el sistema de incorporación de AcK y el gen mutado de MDH, pero sin confirmación de medios de cultivo, que indicaron la pureza de la incorporación de acetyllysine. Por otra parte, análisis de espectrometría de masas también no mostró ningún cAAs en la posición 140 de MDH, que indica la homogeneidad de la incorporación de acetyllysine.

Hay dos principales limitaciones de este enfoque. En primer lugar, debido a la competencia de acetyllysine-charged tRNA con ambos RF1 y cAA-cargado cerca de tRNAs cognado descrito anteriormente, en la actualidad, el número máximo de acetyllysine los residuos que pueden ser incorporados simultáneamente en una única proteína es tres 33,42. En segundo lugar, las células tienen otros tipos de desacetilasas, que resisten la nicotinamida y pueden deacetylate ciertas proteínas objetivo. Por lo tanto, las proteínas no pueden alcanzar 100% acetilación en sitios específicos. Recientemente, hemos establecido un sistema de incorporación de tio-acetyllysine que puede ser utilizado como un análogo no deacetylable de la acetyllysine43, así este sistema podría ser una buena alternativa en este caso.

Como se mencionó anteriormente, el enfoque clásico para caracterizar bioquímicamente la acetilación de la lisina está utilizando mutagénesis sitio-dirigida. Glutamina es utilizada como un imitador de acetyllysine y arginina es utilizada como un imitador de lisina no acetilada. Sin embargo, ambos imitadores no isosteres real y no siempre producen los resultados esperados30. La estrategia de expansión del código genético podría generar homogéneo acetiladas proteínas en residuos de lisina específico, cual es la manera más rigurosa para caracterizar las proteínas acetiladas.

El sistema de incorporación genética para acetyllysine fue derivado del par de pyrrolysyl-tRNA sintetasa variantes y su cognado tRNA de especies Methanosarcinaceae , que también es conocidas por ser ortogonales en eucariotas44. Estudios previos han demostrado que este sistema puede aplicarse en células de mamíferos y ciertos animales por acetilación de proteínas estudios39, por lo tanto el presente Protocolo se podría ampliar a células de mamíferos y animales incluso para usos más amplios en médico investigación y la industria. Además, este protocolo es esencialmente el mismo protocolo utilizado para incorporar diferentes tipos de ncAAs, haciendo necesario un cambio sencillo al par orthogonal introducido en las células hospedadoras.

Lisina deacetilasas (KDACs) quitar el grupo acetilo de los residuos de lisina acetilada en proteínas45. Sirtuina-tipo CobB es la deacetilasa sólo conocido en e. coli, que puede ser inhibida por nicotinamida27. Por lo tanto, para evitar la deacetylation acetilado proteína generada durante el crecimiento celular y purificación de proteínas, nicotinamida 20 a 50 mM debe agregarse en medios de cultivo y purificación búferes. Una vez purificado, la acetilación de residuos de lisina es relativamente estable debido a la falta de deacetilasa. En segundo lugar, para bajar el fondo de la acetilación no específico en otros residuos de lisina en la proteína, la BL21 (DE3) cepa fue utilizado como la cepa de expresión, debido a su menor nivel de acetilación de proteínas que comúnmente usadas derivados de K12 cepas46 . Como se muestra en la figura 2, el MDH de tipo salvaje de BL21(DE3) células no tenía detectable acetilación por borrar occidental. Este es otro factor importante para aumentar la pureza de la acetilación en la proteína diana.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los NIH (AI119813), la puesta en marcha de la Universidad de Arkansas y el premio del Instituto de biociencias de Arkansas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Inmunología número 130 la acetilación de proteínas modificación poste-de translación expansión del código genético aminoácidos noncanonical malato deshidrogenasa biología sintética
Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en <em>Escherichia Coli</em>
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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

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