Summary
Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .
Abstract
Modificações borne-translational que ocorrem em posições específicas das proteínas foram mostradas para desempenhar um papel importante em uma variedade de processos celulares. Entre eles, a acetilação reversível lisina é um do mais amplamente distribuído em todos os domínios da vida. Apesar de numerosos estudos de espectrometria de massa-baseado acetylome foram realizados, ainda mais, caracterização dessas metas de acetilação putativo tem sido limitada. Uma razão possível é que é difícil gerar proteínas puramente acetiladas em posições desejadas pela maioria das abordagens bioquímicas clássicas. Para superar este desafio, a técnica de expansão do código genético foi aplicada para usar o par de uma variante do engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetase e seu tRNA cognatos de espécies de Methanosarcinaceae , para dirigir a incorporação de cotranslational de acetyllysine no site específico da proteína de interesse. Após a primeira aplicação no estudo de acetilação da histona, esta abordagem tem facilitado a estudos de acetilação em uma variedade de proteínas. Neste trabalho, temos demonstrado um protocolo facile para produzir proteínas site-specifically acetificadas usando a bactéria modelo Escherichia coli como o anfitrião. Malato desidrogenase foi usado como um exemplo de demonstração neste trabalho.
Introduction
Modificações borne-translational (PTMs) de proteínas ocorrerem após o processo de tradução e surgem de adição covalente de grupos funcionais para resíduos de aminoácidos, desempenhando papéis importantes em quase todos os processos biológicos, incluindo o gene transcrição, resposta ao estresse, diferenciação celular e metabolismo1,2,3. Até à data, cerca de 400 distintivo PTMs foram identificados4. A complexidade do genoma e a proteoma é amplificada em grande medida por PTMs de proteína, como regular a localização e atividade da proteína e afetam a interação com outras moléculas tais como proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e cofactores5.
Acetilação de proteínas tem estado na vanguarda dos estudos PTMs nas últimas duas décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilação de lisina foi descoberta em histonas há mais de 50 anos13,14, tem sido bem analisadas e é conhecida por existir em mais de 80 fatores de transcrição, reguladores e várias proteínas15, 16,17. Estudos na acetilação de proteínas não apenas nos proporcionou uma compreensão mais profunda de seus mecanismos reguladores, mas também guiada tratamentos para uma série de doenças causadas por acetilação disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. acreditava-se que a acetilação de lisina só acontece nos eucariontes, mas estudos recentes têm mostrado que acetilação de proteínas também desempenha papéis-chave na fisiologia bacteriana, incluindo a quimiotaxia, resistência ácida, ativação e estabilização do Ilhas de patogenicidade e virulência outra relacionadas com proteínas24,25,26,,27,28,29.
Um método comumente usado para caracterizar bioquimicamente acetilação de lisina é usando o mutagenesis local-dirigido. Glutamina é usada como um mímico de acetyllysine por causa de seu tamanho semelhante e polaridade. Arginina é utilizada como uma mímica de lisina não-acetilado, uma vez que preserva a sua carga positiva sob condições fisiológicas, mas não pode ser acetilado. No entanto, ambos imita não é isosteres real e não sempre produzir os resultados esperados30. A abordagem mais rigorosa é gerar proteínas homogeneamente acetiladas em resíduos de lisina específica, que é difícil ou impossível para métodos mais clássicos, devido a baixa estequiometria da acetilação de lisina na natureza7,11. Este desafio tem sido desvendado pela estratégia de expansão de código genético, que emprega uma engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetasePyl com acetyllysine, variante de Methanosarcinaceae espécie de cobrar tRNA que utiliza o host translacional máquinas para suprimir o UAG parar códon no mRNA e direciona a incorporação de acetyllysine na posição projetada da proteína alvo31. Recentemente, otimizamos o sistema com uma melhoria de tRNA EF-Tu-ligação32 e um atualizado acetyllysyl-tRNA sintetase33. Além disso, temos aplicado este sistema de incorporação reforçada em estudos de acetilação da malato desidrogenase34 e correntes-tRNA sintetase35. Aqui, demonstramos o protocolo para gerar proteínas puramente acetiladas da clonagem molecular para identificação bioquímica usando malato desidrogenase (MDH), que temos estudado extensivamente como um exemplo demonstrativo.
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Protocol
1. site-Directed Mutagenesis do Gene alvo
Nota: O MDH é expressa sob promotor T7 no vetor com a origem de CloDF13 e um número de cópia de 20 a 4034 pCDF-1 .
- Introduzir o códon âmbar para na posição 140 no gene por Cartilhas (encaminhar cartilha: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverter a primeira demão: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguindo as instruções do kit mutagenesis local-dirigido.
- Amplificar o plasmídeo de modelo contendo o gene de dehidratase selvagem-tipo malato e inserir a mutação de códon de parada pela reação do polymerase reação em cadeia (PCR). A mistura de reação, incluem 12,5 µ l de mistura de enzima 2 X DNA polimerase, 1,25 µ l de cartilha para a frente de 10 µM, 1,25 µ l de primer reverso de 10 µM, 1 µ l do modelo de DNA (20 ng / µ l) (pCDF-1 plasmídeo contendo o gene do selvagem-tipo MDH) e 9 µ l de água livre de nuclease.
- Usar parâmetros de reação de PCR como segue: inicial de desnaturação a 98 ° C por 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 3 min a 72 ° C; extensão final a 72 ° C por 3 min. Após a PCR, adicione o material amplificado diretamente à mistura enzima quinase-Ligase-DpnI do kit por 1h à temperatura ambiente para a remoção de circularização e modelo.
Nota: A mistura de reação contém 1 µ l de produto do PCR, 5 µ l de 2 X amortecedor da reação, 1 µ l do mix de enzima X quinase-Ligase-DpnI 10 e 3 µ l de água livre de nuclease.
- Usar parâmetros de reação de PCR como segue: inicial de desnaturação a 98 ° C por 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 3 min a 72 ° C; extensão final a 72 ° C por 3 min. Após a PCR, adicione o material amplificado diretamente à mistura enzima quinase-Ligase-DpnI do kit por 1h à temperatura ambiente para a remoção de circularização e modelo.
- Adicionar 5 µ l da mistura de reação para o tubo de 25 µ l descongelado competentes de Escherichia coli DH5α células do kit. Cuidadosamente agite o tubo para misturar e coloque a mistura no gelo por 30 min. de choque do calor a mistura a 42 ° C por 30 s e o lugar no gelo por mais 5 min.
- Pipetar 600 µ l de temperatura ideal Super caldo com meios de repressão (SOC) Catabolite do kit para a mistura, incubar a 37 ° C por 60 min com agitação a 250 rpm, espalha 100 µ l de em uma placa de ágar de caldo (LB) lisogenia com o antibiótico correspondente e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 250 rpm.
- Escolha colônias única de 4-6 em 6 mL frescos LB meios de comunicação com o antibiótico correspondente e incubar a 37 ° C durante a noite, com agitação a 250 rpm. Extrai o plasmídeo de cada cultura durante a noite por kit de purificação de plasmídeo, seguindo o manual do fabricante, então enviar plasmídeos para sequenciamento de DNA de acordo com o protocolo do prestador de serviços para confirmar a mutação de códon de parada em posições corretas.
- Armazene a tensão com a sequência correta a-80 ° C, misturando cultura durante a noite de 1 mL e 300 µ l 100% DMSO.
2. a expressão da proteína acetilada
- Inserir os genes de otimizado acetyllysyl-tRNA sintetase33 e otimizado tRNAPyl 32 para o plasmídeo pTech . Coloque o gene tRNA sintetase, sob o promotor constitutivo lpp . Coloque o gene tRNA sob o de promotor constitutivo proK 34.
- Co, transformar o vetor de expressão34 contendo o gene mutado TAG-contendo da malato desidrogenase, e o plasmídeo abrigando o acetyllysine otimizado sistema de incorporação, em 25 µ l descongelado competente Escherichia coli BL21(DE3) células por choque térmico a 42 ° C, durante 10 s e o lugar no gelo por mais 5 min.
- Pipetar 600 µ l da mídia SOC de temperatura para a mistura, incubar a 37 ° C por 60 min com agitação a 275 rpm, espalhar 100 µ l em um prato com 100 µ g/mL Estreptomicina e cloranfenicol 50 de µ g/mL e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 275 rpm.
- Pegar uma única colônia da placa e inocular em mídia LB fresca 15ml com 100 µ g/mL Estreptomicina e cloranfenicol 50 µ g/mL em um tubo de 50 mL durante a noite a 37 ° C com agitação na velocidade de 250 rpm. Transferir a cultura durante a noite de 15 mL para mídia LB fresca 300ml com antibióticos num balão de 1L e incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
- Dissolver acetyllysine com água para fazer a solução estoque de 100 mM, loja a 4 ° C. Adicionar acetyllysine de 5 mM e 20 mM nicotinamida (inibidor de deacetilases) para a mídia de crescimento quando absorvência atinge 0,5 em 600 nm.
- Desenvolvem-se células para um adicional 1 h a 37 ° C, agitação a 250 rpm, em seguida, adicionar 0,5 mM IPTG para expressão de proteínas e desenvolvem-se células a 25 ° C durante a noite, agitando a 180 rpm.
Nota: As condições de expressão precise de otimização para proteínas diferentes.
- Desenvolvem-se células para um adicional 1 h a 37 ° C, agitação a 250 rpm, em seguida, adicionar 0,5 mM IPTG para expressão de proteínas e desenvolvem-se células a 25 ° C durante a noite, agitando a 180 rpm.
- Coletar as células por centrifugação a 3.000 x g a 4 ° C por 15 min, desprezar o sobrenadante e lavar pelotas de célula com o tampão fosfato (PBS) tampão salino (10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Recolher pilhas lavadas a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min, desprezar o sobrenadante e armazenar pelotas de célula a-80 ° C.
3. purificação da proteína acetilada
- Descongelar as pelotas de célula congelado no gelo e re-suspender com 15 mL de tampão de lise (50mm (hidroximetil) aminometano (Tris) pH do tris 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol 20mm e nicotinamida 20 mM), 5 µ l de β-Mercaptoetanol e 1 nuclease de Benzonase µ l (250 unidades).
- Quebrar as células pelo sonication 40 kHz em 70% da potência de saída com 10 ciclos de 10 rajadas de s, seguidos de intervalos de 30 s para arrefecimento de extrato bruto de formulário. Extraia o centrifugador bruto a 20.000 x g, durante 25 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante com o filtro de membrana de 0,45 µm e carregar em uma coluna contendo 1 mL de resina de (Ni-NTA) ácida nitrilotriacético-níquel incubada com 20 mL de água e 20 mL de tampão de Lise.
Nota: As células também podem ser quebradas pelo detergentes suaves, se sonication não está disponível. - Lavar a coluna com 20 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol 50mm e nicotinamida 20 mM) e em seguida eluir com 2 mL de tampão de eluição (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol 150mm e nicotinamida 20 mM).
- Do desalt a fração de eluição com dessalinização tampão (25 mM Tris pH 7,8 e 10 mM de NaCl) pela coluna PD-10, seguindo o manual do fabricante. Medir a concentração da proteína eluted, seguindo as instruções do reagente de ensaio da proteína de Bradford. A proteína demolhada está pronta para novas experiências.
Nota: Fazer estoque de glicerol 50% da proteína e manter-se na-80 ° C para armazenamento.
4. bioquímica caracterização da proteína acetilada
-
Análises de espectrometria de SDS-PAGE e massa.
- Denaturação de proteínas com o sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) amortecedor da amostra (5 µ l proteínas da amostra com 2 µ l 4 X tampão de amostra SDS) em um tubo de 2 mL a 105 ° C por 5 min, centrifugar a mistura a 2000 x g por 10 s, carga para o 4-20% de sódio Dodecil sulfato do gel de polyacrylamide electroph gel de oresis (SDS-PAGE) e executar a 200 V por 30 min.
- Lave o gel com água destilada e agitar suavemente durante 5 min, repetir o processo 3 vezes. Descartar a água e manchar o gel com azul de Coomassie mancha para 1 h com agitação suave. De manchar o gel com água destilada, agitar suavemente durante 30 min e repetir esta mancha de 3 vezes.
- Cortar a banda em kDa 33 sobre o gel de SDS-PAGE de manchadas de azul de Coomassie e enviá-lo para instalações de espectrometria de massa ou empresas para confirmar que o acetyllysine foi incorporada na posição projetada.
Nota: O protocolo de análise de espectrometria de massa seguiu o experimento anterior34.
-
Mancha ocidental
- Execute o gel de SDS-PAGE com o mesmo protocolo na etapa 4.1. Depois o gel executar, mergulhe o gel com o buffer de transferência (25 mM Tris glicina 192 mM, pH 8.3 e 20% metanol) por 15 min.
- Ativar um 0,2 µm, membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno 7 x 8,5 cm com metanol por 1 min e enxágue com buffer de transferência antes de preparar o sanduíche de transferência.
Nota: O metanol é perigoso em caso de contacto com a pele, olhos, ingestão ou inalação. Excesso de exposição severo pode resultar em morte. - Fazer o sanduíche de transferência do cátodo para o ânodo (esponja, papel de filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, papel de filtro e esponja). Colocar a pilha no tanque de transferência, execute em uma corrente constante de 350 mA por 45 min.
Nota: Tempo de transferência pode precisar de otimização. - Lavar a membrana PVDF com 25 mL solução tampão salino, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,6) buffer para 5 min com agitação suave. Bloquear a membrana com 5% albumina de soro bovino (BSA) no buffer TBST por 1h à temperatura ambiente.
- Incube a membrana com acetyllysine-anticorpo conjugado HRP com uma concentração final de 1 µ g/mL diluido com 5% BSA em TBST em 4 ° C durante a noite com agitação suave.
Nota: Para resultados mais rápidos, esta etapa pode ser executada em temperatura ambiente por 1 h. A diluição de anticorpo pode precisar de otimização. - Lave a membrana com 20 mL de tampão TBST por 5 min com agitação suave, repetindo o passo 4 vezes. Aplica o substrato de quimioluminescência para a membrana, seguindo as instruções do fabricante. Captar o sinal com um dispositivo de carga acoplada (CCD) baseado em câmera câmera.
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Representative Results
O rendimento de proteína MDH acetilado foi 15 mg por cultura de 1 L, enquanto que do selvagem-tipo MDH foi 31 mg / cultura de 1 L. Proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE, conforme mostrado na Figura 1. O selvagem-tipo MDH foi usado como um controle positivo34. A proteína purificada de células de abrigar o sistema de incorporação de acetyllysine (AcK) e o gene mutante mdh , mas sem AcK em meios de crescimento, foi usada como um controle negativo. Acetilação de lisina de proteínas purified foi detectada pela mancha ocidental usando o acetyllysine-anticorpo, como mostrado na Figura 2. A acetilação do resíduo lisina 140 na malato desidrogenase foi confirmada pela análise de espectrometria de massa em tandem conforme mostrado na Figura 3.
A sequência da proteína da proteína MDH (o fragmento para análise de MS em tandem é em negrito):
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
A sequência da proteína de otimizado acetyllysyl-tRNA sintetase33:
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
A sequência do gene do tRNA otimizadoPyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA
Figura 1 : The Coomassie manchadas de azul gel de SDS-PAGE de MDH completo purificada e sua variante contendo AcK. Os mesmos volumes de eluição fracções foram carregadas da SDS-página do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : A mancha ocidental de MDH purificado do selvagem-tipo e sua variante contendo AcK. Os mesmos volumes de frações de eluição foram carregados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de LC-MS/MS da variante de AcK-contendo MDH. O espectro em massa em tandem do peptídeo (resíduos 135-142) AGVYDKACNK da variante MDH acetilado purificada. KAC denota AcK incorporação. A sequência parcial do peptide contendo o AcK pode ser lido da série de íon y ou b anotada. Picos correspondentes foram em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A incorporação genética de aminoácidos não-canônico (ncAAs) baseia-se a supressão de um codão atribuído, principalmente o âmbar stop códon UAG36,37,38,39, pelo tRNA ncAA-carregada contendo o anticodão correspondente. Como é sabido, o códon UAG é reconhecido pelo lançamento factor-1 (RF1) em bactérias, e isso pode também ser suprimido por perto os tRNAs cognata de hosts cobrados pela canonical aminoácidos (cAAs) como lisina e tirosina40,41. Então, a eficiência da incorporação da ncAA no códon UAG depende a concorrência entre ncAA-cobrado os tRNAs e RF1, enquanto a pureza da incorporação de ncAA baseia-se na competição entre os tRNAs ncAA-carregada e cAA-cobrado perto cognato tRNAs. Baixo rendimento e pureza da proteína alvo acetilado podem ser causadas pela eficiência baixa incorporação do par ortogonais introduzidos em células hospedeiras. Este problema poderia ser resolvido aumentando a concentração de acetyllysine na mídia, e usando recentemente otimizado de sistemas de incorporação de acetyllysine, que aumentou a repressão de códon UAG por 58 vezes32,33, ambos serão melhoradas a eficiência e a pureza de incorporação de acetyllysine. Como mostrado na Figura 1 e comparando o rendimento de proteína, a eficiência da incorporação de acetyllysine foi de cerca de 50% e não havia nenhum detectável proteína purificada de células de abrigar o sistema de incorporação do AcK e o gene mutante de MDH, mas sem AcK em meios de crescimento, que indicaram a alta pureza de incorporação de acetyllysine. Além disso, análise de espectrometria de massa também não mostrou qualquer cAAs na posição 140 de MDH, indicando a homogeneidade da incorporação acetyllysine.
Existem duas principais limitações desta abordagem. Em primeiro lugar, por causa da competição do tRNA acetyllysine carregada com ambos RF1 e cAA-cobrado perto cognato tRNAs descrito acima, atualmente, o número máximo de resíduos de acetyllysine que podem ser simultaneamente incorporados em uma única proteína é três 33,,42. Em segundo lugar, as células têm outros tipos de deacetilases, que resistem a nicotinamida e podem deacetylate certas proteínas alvo. Então, essas proteínas podem não alcançar 100% de acetilação em locais específicos. Recentemente, nós estabelecemos um sistema de incorporação thio-acetyllysine que pode ser usado como um análogo não-deacetylable da acetyllysine43, assim, este sistema pode ser uma boa abordagem alternativa neste caso.
Como mencionado anteriormente, a abordagem clássica para caracterizar bioquimicamente acetilação de lisina é usando o mutagenesis local-dirigido. Glutamina é usada como um mímico de acetyllysine, e arginina é utilizada como uma mímica de lisina não-acetilados. No entanto, ambos imita não é isosteres real e não sempre produzir os resultados esperados30. A estratégia de expansão do código genético poderia gerar proteínas homogeneamente acetiladas em resíduos de lisina específica, que é a maneira mais rigorosa para caracterizar proteínas acetiladas.
O sistema de incorporação genética para acetyllysine derivou-se a par de pyrrolysyl-tRNA sintetase variantes e seus tRNA cognatos de espécies de Methanosarcinaceae , que também são conhecidos por ser ortogonais em eucariontes44. Estudos anteriores mostraram que este sistema pode ser aplicado em células de mamíferos e certos animais para proteína acetilação estudos39, assim, o presente protocolo poderia ser expandido para células de mamíferos e até animais para aplicações mais amplas em medicina investigação e indústria. Além disso, este protocolo também é essencialmente o mesmo protocolo usado para incorporar diferentes tipos de ncAAs, necessitando de uma simples mudança ao ortogonais par introduzidos em células hospedeiras.
Lisina deacetilases (KDACs) remover o resíduo de lisina acetilado em proteínas45grupo acetila. O tipo sirtuin CobB é o deacetilase apenas conhecido em Escherichia coli, que pode ser inibido por nicotinamida27. Então, para evitar a deacetilação da proteína acetificada gerada durante o crescimento celular e purificação de proteínas, nicotinamida 20 a 50 mM deve ser adicionada em meios de crescimento e purificação buffers. Uma vez purificados, acetilação de resíduos de lisina é relativamente estável devido à falta de deacetilase. Em segundo lugar, para abaixar o plano de fundo da acetilação inespecífica em outros resíduos de lisina na proteína, o BL21 (DE3) estirpe foi usado como a cepa de expressão, devido ao seu nível significativamente menor de acetilação de proteínas comumente usados K12-derivado das estirpes46 . Como mostrado na Figura 2, o selvagem-tipo MDH expressa de BL21(DE3) células tinha acetilação não detectável pela mancha ocidental. Este é outro fator importante para aumentar a pureza da acetilação da proteína alvo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH (AI119813), o arranque da Universidade de Arkansas e o prêmio do Instituto de Biociências de Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
References
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