Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Summary

Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .

Abstract

Modificações borne-translational que ocorrem em posições específicas das proteínas foram mostradas para desempenhar um papel importante em uma variedade de processos celulares. Entre eles, a acetilação reversível lisina é um do mais amplamente distribuído em todos os domínios da vida. Apesar de numerosos estudos de espectrometria de massa-baseado acetylome foram realizados, ainda mais, caracterização dessas metas de acetilação putativo tem sido limitada. Uma razão possível é que é difícil gerar proteínas puramente acetiladas em posições desejadas pela maioria das abordagens bioquímicas clássicas. Para superar este desafio, a técnica de expansão do código genético foi aplicada para usar o par de uma variante do engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetase e seu tRNA cognatos de espécies de Methanosarcinaceae , para dirigir a incorporação de cotranslational de acetyllysine no site específico da proteína de interesse. Após a primeira aplicação no estudo de acetilação da histona, esta abordagem tem facilitado a estudos de acetilação em uma variedade de proteínas. Neste trabalho, temos demonstrado um protocolo facile para produzir proteínas site-specifically acetificadas usando a bactéria modelo Escherichia coli como o anfitrião. Malato desidrogenase foi usado como um exemplo de demonstração neste trabalho.

Introduction

Modificações borne-translational (PTMs) de proteínas ocorrerem após o processo de tradução e surgem de adição covalente de grupos funcionais para resíduos de aminoácidos, desempenhando papéis importantes em quase todos os processos biológicos, incluindo o gene transcrição, resposta ao estresse, diferenciação celular e metabolismo^1,2,3. Até à data, cerca de 400 distintivo PTMs foram identificados⁴. A complexidade do genoma e a proteoma é amplificada em grande medida por PTMs de proteína, como regular a localização e atividade da proteína e afetam a inte....

Protocol

1. site-Directed Mutagenesis do Gene alvo

Nota: O MDH é expressa sob promotor T7 no vetor com a origem de CloDF13 e um número de cópia de 20 a 40³⁴ pCDF-1 .

1. Introduzir o códon âmbar para na posição 140 no gene por Cartilhas (encaminhar cartilha: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverter a primeira demão: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguindo as instruções do kit mutagenesis local-dirigido.
2. Amplificar o plasmídeo de modelo contendo o gene de dehidratase selvagem-tipo malato e inserir a mutação de códon de parada pela reação do polymerase reação em cadeia (PCR....

Results

O rendimento de proteína MDH acetilado foi 15 mg por cultura de 1 L, enquanto que do selvagem-tipo MDH foi 31 mg / cultura de 1 L. Proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE, conforme mostrado na Figura 1. O selvagem-tipo MDH foi usado como um controle positivo³⁴. A proteína purificada de células de abrigar o sistema de incorporação de acetyllysine (AcK) e o gene mutante mdh , mas sem AcK em meios de crescimento, foi .......

Discussion

A incorporação genética de aminoácidos não-canônico (ncAAs) baseia-se a supressão de um codão atribuído, principalmente o âmbar stop códon UAG^36,37,38,39, pelo tRNA ncAA-carregada contendo o anticodão correspondente. Como é sabido, o códon UAG é reconhecido pelo lançamento factor-1 (RF1) em bactérias, e isso pode também ser suprimido por perto os tRNAs cognata de hosts cobrados pela canonical a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ensaio de proteína de Bradford	Bio-Rad	5000006	Concentração de proteína
4x Tampão de amostra Laemmli Tampão	de amostra Bio-Rad	1610747	SDS
Coloração Coomassie G-250 Coloração	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE
4-20% Gel pronto para SDS-PAGE	Bio-Rad	4561093	Determinação de proteínas
Ac-K-100 (Conjugado HRP)	Célula Sinalização	6952	Anticorpo
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Indutor de expressão
Nε -Acetil-L-lisina	CHEM-IMPEX	5364	Aminoácido não canônico
PD-10 coluna de dessalinização	GE Healthcare	17085101	Dessalinização
Q5 Kit de Mutagênese Dirigida ao Local	NEB	E0554	Apresentando as células do códon de parada
BL21 (DE3)	NEB	C2527	Expressando a cepa
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extraindo plasmídeos
Resina Ni-NTA	QIAGEN	30210	Resina de purificação de afinidade
nicotinamida	Sigma-Aldrich	N3376	Inibidor de desacetilase
β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Agente redutor
Reagente de extração de proteína BugBuster	Sigma-Aldrich	70584	Quebrando células
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Quimioluminescência
Pré-misturada LB Caldo	VWR	97064	Meio de crescimento celular
Albumina de soro bovino	VWR	97061-416	bloqueio de western blots