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Immunology and Infection

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l'acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .

Abstract

Modificazioni post-traduzionali che si verificano alle posizioni specifiche delle proteine hanno dimostrati di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi cellulari. Fra loro, acetilazione reversibile lisina è uno dei più ampiamente distribuita in tutti i domini della vita. Sebbene siano stati condotti numerosi studi basati sulla spettrometria di massa acetylome, ulteriore caratterizzazione di questi bersagli putativi acetilazione è stato limitato. Una possibile ragione è che è difficile generare proteine puramente acetilati alle posizioni desiderate dalla maggior parte degli approcci biochimica classica. Per superare questa sfida, la tecnica di espansione del codice genetico è stata applicata per utilizzare la coppia di una variante di derivati dal pyrrolysyl-tRNA sintetasi e sue cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , per dirigere l'incorporazione di cotranslational di acetyllysine presso il sito specifico della proteina di interesse. Dopo la prima applicazione nello studio di acetilazione dell'istone, questo approccio ha facilitato gli studi di acetilazione su una varietà di proteine. In questo lavoro, abbiamo dimostrato un protocollo facile per produrre proteine site-specifically acetilati utilizzando il batterio Escherichia coli di modello come host. La malato deidrogenasi è stata utilizzata come un esempio di dimostrazione in questo lavoro.

Introduction

Modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine si verificano dopo il processo di traduzione e derivano da covalente aggiunta di gruppi funzionali ai residui dell'amminoacido, giocando ruoli importanti in quasi tutti i processi biologici, tra cui gene trascrizione, risposta allo stress, differenziazione cellulare e metabolismo1,2,3. Ad oggi, circa 400 distintivo PTMs sono state identificate4. La complessità del genoma e del proteoma è amplificata in grande misura dalla proteina PTMs, come essi regolano la localizzazione e l'attività della proteina e influenzare l'interazione con altre molecole come proteine, acidi nucleici, lipidi e cofattori5.

Acetilazione della proteina è stato all'avanguardia di PTMs studi nell'ultimo ventennio6,7,8,9,10,11,12. Acetilazione di lisina in primo luogo è stato scoperto in istoni più di 50 anni fa13,14, ha stato bene esaminato ed è conosciuta per esistere in più di 80 fattori di trascrizione, regolatori e varie proteine15, 16,17. Studi sull'acetilazione della proteina hanno non solo ci ha fornito una comprensione più profonda dei suoi meccanismi di regolamentazione, ma anche trattamenti per un certo numero di malattie causate da disfunzionale acetilazione18,19, guidati 20 , 21 , 22 , 23. si credeva che l'acetilazione lisina accade solo negli eucarioti, ma recenti studi hanno dimostrato che acetilazione di proteina svolge anche ruoli chiave in fisiologia batterica, tra cui chemiotassi, resistenza agli acido, attivazione e stabilizzazione di Isole di patogenicità e altri virulenza relative proteine24,25,26,27,28,29.

Un metodo comunemente usato per caratterizzare biochimicamente acetilazione di lisina è mediante mutagenesi sito-diretta. Glutamina è usata come un mimo di acetyllysine a causa delle sue dimensioni simili e la polarità. Arginina è utilizzata come un mimo di lisina non-acetilati, poiché esso conserva la sua carica positiva in condizioni fisiologiche, ma non può essere acetilato. Tuttavia, entrambi imita non è veri isosteri e non sempre danno i risultati attesi30. L'approccio più rigoroso è quello di generare in modo omogeneo acetilati proteine ai residui di lisina specifico, che è difficile o impossibile per i più classici metodi a causa della bassa stechiometria di acetilazione di lisina in natura7,11. Questa sfida ha stata svelata dalla strategia di espansione di codice genetico, che impiega una derivati dal pyrrolysyl-tRNA-sintetasi variante da Methanosarcinaceae specie di addebitare tRNAPyl con acetyllysine, utilizza l'host traslazionale macchinari per sopprimere l'UAG codone nel mRNA di arresto e dirige l'incorporazione di acetyllysine in posizione progettata della proteina bersaglio31. Recentemente, abbiamo ottimizzato questo sistema con una migliore EF-Tu-associazione tRNA32 e un aggiornato acetyllysyl-tRNA sintetasi33. Inoltre, abbiamo applicato questo sistema avanzato incorporazione negli studi di acetilazione di malato deidrogenasi34 e tyrosyl-tRNA sintetasi35. Qui, dimostriamo il protocollo per la generazione di proteine puramente acetilati dalla clonazione molecolare per l'identificazione biochimica utilizzando la malato deidrogenasi (MDH), che abbiamo studiato estesamente come esempio dimostrativo.

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Protocol

1. mutagenesi del Gene Target

Nota: MDH è espresso sotto promotore T7 nel vettore pCDF-1 con l'origine di CloDF13 e un numero di copia di 20 a 4034.

  1. Introdurre il codone di stop ambra nella posizione 140 nel gene di primer (forward primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverse primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguendo le istruzioni del kit di mutagenesi sito-diretta.
  2. Amplificare il plasmide di modello che contiene il gene della deidratasi di selvaggio-tipo malate e inserire la mutazione del codone di arresto dalla reazione della polimerasi reazione a catena (PCR). Nella miscela di reazione, sono 12,5 µ l della miscela enzima di 2 X DNA polimerasi, 1.25 µ l di 10 µM Forward primer, 1.25 µ l di primer Reverse di 10 µM, 1 µ l di DNA campione (20 ng / µ l) (pCDF-1 plasmide contenente il gene di tipo selvatico MDH) e 9 µ l di acqua priva di nucleasi.
    1. Utilizzare parametri di reazione di PCR come segue: iniziale denaturazione a 98 ° C per 30 s; 25 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 3 min a 72 ° C; estensione finale a 72 ° C per 3 min. Dopo la PCR, aggiungere il materiale amplificato direttamente al mix enzima chinasi-ligasi-DpnI dal kit per 1 h a temperatura ambiente per rimozione circularization e modello.
      Nota: La miscela di reazione contiene 1 µ l di prodotto PCR, 5 µ l di tampone di reazione: 2x, 1 µ l di miscela di enzima 10 X chinasi-ligasi-DpnI e 3 µ l di acqua priva di nucleasi.
  3. Aggiungere 5 µ l di miscela di reazione per il tubo di 25 µ l scongelati competente Escherichia coli cellule DH5α dal kit. Attentamente a scatti la provetta per mescolare e mettere il composto sul ghiaccio per 30 min. scossa di calore la miscela a 42 ° C per 30 s e posto in ghiaccio per ulteriori 5 minuti.
    1. Pipettare 600 µ l di temperatura ottimale Super brodo con media di repressione (SOC) dei cataboliti dal kit nella miscela, incubare a 37 ° C per 60 min con agitazione a 250 giri/min, sviluppa 100 µ l su una piastra di agar del brodo (LB) di Lisogenesi con l'antibiotico corrispondente e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
  4. Prendere 4-6 singole colonie in media LB fresco 6 mL con l'antibiotico corrispondente e incubare a 37 ° C per una notte con agitazione a 250 giri/min. Estrarre i plasmidi dall'ogni cultura durante la notte con il kit di purificazione del plasmide, seguendo il manuale del produttore, quindi invia plasmidi per la sequenza di DNA in base al protocollo del prestatore per confermare la mutazione del codone di arresto alle posizioni corrette.
  5. Conservare il ceppo con la corretta sequenza a-80 ° C mescolando 1 mL coltura durante la notte e 300 µ l 100% DMSO.

2. espressione della proteina acetilata

  1. Inserire i geni di ottimizzato acetyllysyl-tRNA sintetasi33 e ottimizzato tRNAPyl 32 nel plasmide pTech . Luogo del gene di tRNA sintetasi sotto il promotore costitutivo lpp . Posto del gene tRNA sotto il promotore costitutivo proK 34.
    1. Co-trasformare il vettore di espressione34 contenente il gene mutato contenenti TAG del malato deidrogenasi e il plasmide che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine ottimizzato, in 25 µ l competente scongelati e. coli BL21 (DE3) cellule di shock termico a 42 ° C per 10 s e posto in ghiaccio per ulteriori 5 minuti.
    2. Pipettare 600 µ l di temperatura media SOC in miscela, incubare a 37 ° C per 60 min con agitazione a 275 giri/min, sviluppa 100 µ l in un piatto con 100 µ g/mL di streptomicina e cloramfenicolo di 50 µ g/mL e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 275 giri/min.
  2. Pick up una singola Colonia dalla piastra e inoculare in media LB freschi 15ml con 100 µ g/mL di streptomicina e cloramfenicolo 50 µ g/mL in una provetta da 50 mL durante la notte a 37 ° C con agitazione alla velocità di 250 giri/min. Trasferire la cultura notte 15 mL media LB fresco 300 mL con antibiotici in un pallone da 1 L e incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
  3. Sciogliere acetyllysine con acqua per fare la soluzione di riserva di 100 mM, conservare a 4 ° C. Aggiungere acetyllysine di 5 mM e 20 mM nicotinammide (inibitore delle deacetilasi) ai media crescita quando assorbanza raggiunge 0,5 a 600 nm.
    1. Crescere le cellule per un ulteriore 1 h a 37 ° C, agitando a 250 giri/min, poi aggiungere 0,5 mM IPTG per l'espressione della proteina e far crescere cellule a 25 ° C durante la notte, con agitazione a 180 giri/min.
      Nota: Le condizioni di espressione possono bisogno di ottimizzazione per diverse proteine.
  4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g a 4 ° C per 15 min, scartare il surnatante e lavare palline delle cellule con il tampone fosfato salino (PBS) buffer (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl). Raccogliere cellule lavate a 10.000 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e archiviare palline delle cellule a-80 ° C.

3. la purificazione della proteina acetilata

  1. Scongelare il pellet di cellule congelate su ghiaccio e risospendere con 15 mL di tampone di lisi (50mm tris (idrossimetil) amminometano (Tris) a pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 20 mM e 20 mM nicotinammide), 5 µ l di β-mercaptoetanolo e nucleasi di 1 µ l Benzonase (250 unità).
  2. Rompere le cellule di sonicazione 40 kHz a 70% potenza di uscita con 10 cicli di 10 brevi raffiche di s, seguite da intervalli di 30 s per il raffreddamento estratto grezzo di forma. Centrifuga del greggio estratto a 20.000 x g per 25 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante con il filtro a membrana da 0,45 µm e caricare in una colonna contenente 1 mL di nichel-nitrilotriacetico acido resina (Ni-NTA) equilibrata con 20 mL di acqua e 20 mL di tampone di lisi.
    Nota: Cellule detergenti delicati, potrebbero essere interrotta anche se sonicazione non è disponibile.
  3. Lavare la colonna con 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 50 mM e 20 mM nicotinammide) e quindi eluire con 2 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 150 mM e 20 mM nicotinammide).
  4. Dissalare la frazione di eluizione con desalificazione buffer (25 mM Tris pH 7,8 e 10 mM NaCl) dalla colonna PD-10, seguendo il manuale del produttore. Misurare la concentrazione della proteina eluita seguendo le istruzioni del reagente di analisi della proteina di Bradford. La proteina dissalata è pronta per ulteriori esperimenti.
    Nota: Fare magazzino di glicerolo di 50% della proteina e mantenere a-80 ° C per la conservazione.

4. Descrizione biochimica della proteina acetilata

  1. Analisi di spettrometria di massa e SDS-PAGE.
    1. Denaturare le proteine con il sodio dodecil solfato (SDS) tampone del campione (campione di proteina 5 µ l con 2 µ l 4 X tampone campione SDS) in una provetta da 2 mL a 105 ° C per 5 min, centrifugare la miscela a 2000 x g per 10 s, carico sui 4-20% sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide electroph gel di oresis (SDS-PAGE) ed eseguire a 200 V per 30 min.
    2. Lavare il gel con acqua distillata e agitare delicatamente per 5 min, ripetendo il processo 3 volte. Eliminare l'acqua e macchia il gel con la macchia blu di Coomassie per 1 h con agitazione delicata. De-macchia il gel con acqua distillata, agitare delicatamente per 30 min e ripetere questo de-macchia 3 volte.
    3. Tagliare la banda al kDa 33 sul gel di SDS-PAGE di Coomassie blu-macchiato e inviarlo a: Servizi di spettrometria di massa o aziende per confermare che il acetyllysine è stato incorporato nella posizione progettata.
      Nota: Il protocollo di analisi di spettrometria di massa ha seguito il precedente esperimento34.
  2. Macchiarsi occidentale
    1. Esegua il gel di SDS-PAGE con lo stesso protocollo al punto 4.1. Dopo il gel di eseguire, immergere il gel con il buffer di trasferimento (25 mM Tris, glicina 192 mM, pH 8.3 e 20% metanolo) per 15 min.
    2. Attivare un 0,2 µm, membrana di 7 x 8,5 cm polivinilidene difluoruro (PVDF) con metanolo per 1 min e sciacquare con tampone di trasferimento prima di preparare il panino di trasferimento.
      Nota: Il metanolo è pericoloso in caso di contatto con la pelle, contatto con gli occhi, ingestione o inalazione. Sovresposizione severa può provocare la morte.
    3. Fare il panino di trasferimento dal catodo all'anodo (spugna, carta da filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, carta da filtro e spugna). Mettere la pila in carro armato di trasferimento, eseguito a corrente costante di 350 mA per 45 min.
      Nota: Tempo di trasferimento potrebbe bisogno di ottimizzazione.
    4. Lavare la membrana PVDF con 25 mL Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.6) buffer per 5 minuti con agitazione delicata. Bloccare la membrana con 5% di albumina di siero bovino (BSA) nel buffer TBST per 1 h a temperatura ambiente.
    5. Incubare la membrana con acetyllysine-anticorpo HRP-coniugato con una concentrazione finale di 1 µ g/mL diluito con 5% BSA in TBST a 4 ° C durante la notte con agitazione delicata.
      Nota: Per risultati più veloci, questo passaggio potrebbe essere eseguita a temperatura ambiente per 1 h. La diluizione dell'anticorpo può avere bisogno di ottimizzazione.
    6. Lavare la membrana con 20 mL di tampone TBST per 5 minuti con agitazione delicata, ripetere il passo 4 volte. Applicare il substrato di chemiluminescenza per la membrana seguendo le istruzioni del produttore. Catturare il segnale con un imager di macchina fotografica a base di charge coupled device (CCD).

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Representative Results

La resa di proteina acetilata di MDH era 15 mg al cultura L 1, mentre quello di selvaggio-tipo MDH era 31 mg / cultura 1 L. Le proteine purificate sono state analizzate da SDS-PAGE, come illustrato nella Figura 1. Il selvaggio-tipo MDH è stato usato come un controllo positivo34. La proteina purificata dalle cellule che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine (AcK) e il gene mutante mdh , ma senza AcK in mezzi di sviluppo, è stata utilizzata come controllo negativo. Acetilazione di lisina delle proteine purificate è stato rilevato usando macchiante occidentale l'anticorpo acetyllysine come mostrato in Figura 2. L'acetilazione del residuo di lisina 140 nella malato deidrogenasi è stata confermata dall'analisi di spettrometria di massa tandem come mostrato nella Figura 3.

La sequenza della proteina della proteina MDH (il frammento per analisi MS tandem è in grassetto):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

La sequenza della proteina di ottimizzato acetyllysyl-tRNA sintetasi33:

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

La sequenza del gene del tRNA ottimizzatoPyl 32:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
Figura 1 : The Coomassie blu-macchiato gel di SDS-PAGE di MDH full-length purificata e la sua variante AcK-contenente. Gli stessi volumi di eluizione frazioni sono state caricate su SDS-PAGE gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Il western blot di MDH purificata di tipo selvatico e la sua variante contenenti AcK. Sono stati caricati gli stessi volumi di frazioni di eluizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Analisi LC-MS/MS di variante di AcK-contenente MDH. Lo spettro massa tandem di peptide (residui 135-142) AGVYDKACNK da variante acetilata purificata di MDH. KAC denota AcK incorporazione. La sequenza parziale del peptide contenente l'AcK può essere letto dalla serie dello ione y o b con annotazioni. Abbinati cime erano in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La costituzione genetica degli aminoacidi noncanonical (ncAAs) si basa sulla soppressione di un codone assegnato, per lo più la fermata ambra codone UAG36,37,38,39, dal tRNA ncAA-pagano contenente l'anticodone corrispondente. Come è noto, il codone UAG viene riconosciuto dalla release factor-1 (RF1) nei batteri, e può anche essere soppressa da vicino cognate tRNAs da host praticati da aminoacidi canoniche (cAAs) come la lisina e la tirosina40,41. Così, l'efficienza dell'incorporazione di ncAA al codone UAG dipende la competizione tra carica ncAA tRNAs e RF1, mentre la purezza dell'incorporazione di ncAA si basa sulla competizione tra tRNAs ncAA-carica e carica di cAA vicino tRNAs cognate. Bassa resa e purezza della proteina bersaglio acetilato può essere causati dall'efficienza di incorporazione bassa della coppia ortogonale introdotta in cellule dell'ospite. Questo problema potrebbe essere risolto aumentando la concentrazione di acetyllysine nei media, e utilizzando recentemente ottimizzato sistemi di incorporazione di acetyllysine, che sono aumentate la soppressione di codone UAG 58 volte32,33, entrambi sarà migliorate l'efficienza e la purezza dell'incorporazione di acetyllysine. Come illustrato nella Figura 1 e confrontando i rendimenti della proteina, l'efficienza di incorporazione di acetyllysine era circa il 50% e non c'era nessun rilevabile della proteina purificata dalle cellule che harboring il sistema di incorporazione di AcK e il gene mutante di MDH, ma senza AcK in media di crescita, che ha indicato l'elevata purezza della incorporazione di acetyllysine. Inoltre, analisi di spettrometria di massa anche non hanno mostrato alcun cAAs posizione 140 di MDH, che indica l'omogeneità di incorporazione del acetyllysine.

Ci sono due principali limitazioni di questo approccio. In primo luogo, a causa della concorrenza di tRNA acetyllysine-addebitato con entrambi RF1 e carica di cAA vicino cognate tRNAs descritto in precedenza, attualmente, il numero massimo dei residui di acetyllysine che possono essere incorporate simultaneamente in una singola proteina è tre 33,42. In secondo luogo, le cellule hanno altri tipi di deacetilasi, che resistono nicotinammide e possono deacetilano determinate proteine bersaglio. Così, quelle proteine non possono raggiungere il 100% acetilazione in siti specifici. Recentemente, abbiamo istituito un sistema di incorporazione di thio-acetyllysine che può essere utilizzato come un analogo non-deacetylable di acetyllysine43, così questo sistema potrebbe essere un buon approccio alternativo in questo caso.

Come accennato prima, l'approccio classico per caratterizzare biochimicamente acetilazione di lisina è mediante mutagenesi sito-diretta. Glutamina è usata come un mimo di acetyllysine e arginina è utilizzata come un mimo di lisina non-acetilati. Tuttavia, entrambi imita non è veri isosteri e non sempre danno i risultati attesi30. La strategia di espansione del codice genetico potrebbe generare in modo omogeneo acetilati proteine ai residui di lisina specifico, che è il modo più rigoroso per caratterizzare le proteine acetilati.

Il sistema di costituzione genetica per acetyllysine è stato derivato dalla coppia di pyrrolysyl-tRNA sintetasi varianti e loro cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , che sono anche conosciute per essere ortogonali in eucarioti44. Studi precedenti hanno dimostrato che questo sistema potrebbe essere applicato in cellule di mammifero e certi animali per proteina acetilazione studi39, così il presente protocollo potrebbe essere esteso a cellule di mammiferi e persino animali per applicazioni più ampie nel settore medicale ricerca e industria. Inoltre, questo protocollo è anche essenzialmente lo stesso protocollo utilizzato per incorporare diversi tipi di ncAAs, rendendo necessaria una semplice modifica alla coppia ortogonale introdotta in cellule dell'ospite.

Lisina deacetilasi (KDACs) rimuovere il gruppo acetile dal residuo di lisina acetilato in proteine45. Il sirtuin-tipo CobB è il deacetylase soltanto ben noto in e. coli, che può essere inibito da nicotinammide27. Così, per evitare la deacetilazione della proteina acetilata generata durante la crescita delle cellule e purificazione della proteina, nicotinamide 20 a 50 mM dovrebbe essere aggiunto in entrambi i mezzi di crescita e purificazione buffer. Una volta purificato, acetilazione dei residui di lisina è relativamente stabile a causa della mancanza di deacetilasi. In secondo luogo, per abbassare lo sfondo di acetilazione aspecifico presso altri residui di lisina della proteina, la BL21 (DE3) ceppo è stato usato come il ceppo di espressione, a causa del livello significativamente più basso di acetilazione di proteine rispetto ai ceppi K12-derivati comunemente utilizzati46 . Come illustrato nella Figura 2, il selvaggio-tipo MDH espresso dalle cellule BL21 (DE3) non avuto nessun acetilazione rilevabile mediante western blotting. Questo è un altro fattore importante per aumentare la purezza dell'acetilazione nella proteina bersaglio.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal NIH (AI119813), lo start-up presso la University of Arkansas e il premio dall'Arkansas Biosciences Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

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References

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Immunologia problema 130 acetilazione di proteina modificazione post-traduzionale espansione del codice genetico noncanonical aminoacidi malato deidrogenasi biologia sintetica
Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in <em>Escherichia Coli</em>
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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

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