Summary
Uitbreiding van de genetische code dient als een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van een breed scala aan biologische processen, met inbegrip van eiwit acetylation. Hier tonen we een facile protocol misbruiken van deze techniek voor het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke sites in Escherichia coli cellen.
Abstract
Posttranslationele modificaties die zich bij specifieke posities van eiwitten voordoen hebben aangetoond dat het spelen een belangrijke rol in een verscheidenheid van cellulaire processen. Onder hen is omkeerbare lysine acetylation één van de meest verspreide in alle domeinen van het leven. Hoewel talrijke massa spectrometrie gebaseerde acetylome studies zijn uitgevoerd, verdere karakterisering van deze vermeende acetylation doelstellingen beperkt gebleven. Een mogelijke reden is dat het moeilijk is te genereren louter geacetyleerd eiwitten op de gewenste positie door de meeste klassieke biochemische benaderingen. Om te overwinnen deze uitdaging, is de genetische code uitbreiding techniek toegepast voor het gebruik van het paar een gemanipuleerde pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, en haar cognaat tRNA van Methanosarcinaceae soorten, direct de cotranslational opneming van acetyllysine bij de specifieke site op de proteïne van belang. Na de eerste toepassing in de studie van Histon acetylation, heeft deze aanpak acetylation studies over een verscheidenheid van eiwitten vergemakkelijkt. In dit werk toonden we een facile protocol voor de productie van site-specifically geacetyleerd eiwitten met behulp van het model bacterie Escherichia coli als host. Malate dehydrogenase werd gebruikt als een voorbeeld van de demonstratie in dit werk.
Introduction
Posttranslationele modificaties (PTMs) van eiwitten optreden na het vertaalproces en ontstaan door covalente toevoeging van functionele groepen te aminozuurresidu's, spelen een belangrijke rol in bijna alle biologische processen, met inbegrip van gene transcriptie, stressrespons, celdifferentiatie en metabolisme1,2,3. Tot op heden heeft ongeveer 400 onderscheidend geweest PTMs geïdentificeerde4. De complexiteit van het genoom en de Proteoom wordt versterkt tot een groot deel door eiwit PTMs, zoals ze reguleren de activiteit van het eiwit en de localisatie en invloed hebben op de interactie met andere moleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren, lipiden en cofactoren5.
Eiwit acetylation is in de voorhoede van PTMs studies in de laatste twee decennia6,7,8,9,10,11,12. Lysine acetylation werd het eerst ontdekt in histonen meer dan 50 jaar geleden13,14, heeft al goed onderzocht, en is bekend in meer dan 80 transcriptiefactoren, regelgevers en verschillende eiwitten15, 16,17. Studies over eiwit acetylation hebben niet alleen ons te voorzien van een dieper begrip van de regulerende mechanismen, maar ook begeleide behandelingen voor een aantal ziekten veroorzaakt door disfunctionele acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. men geloofde dat lysine acetylation alleen in eukaryoten gebeurt, maar recente studies hebben aangetoond dat eiwitten acetylation speelt ook spelen een belangrijke rol in de bacteriële fysiologie, inclusief chemotaxis, zure weerstand, activering en stabilisatie van pathogeniteit eilanden en andere virulentie gerelateerde eiwitten24,25,26,27,28,29.
Een veelgebruikte methode om biochemically karakteriseren lysine acetylation maakt gebruik van plaats-geleide mutagenese. Glutamine wordt gebruikt als een nabootsen van acetyllysine vanwege zijn vergelijkbare omvang en polariteit. Arginine is gebruikt als een niet-geacetyleerd lysine mimic, aangezien het behoudt haar positieve lading onder fysiologische omstandigheden, maar kan niet worden geacetyleerd. Echter, beide nabootsers zijn geen echte isosteres en doen niet altijd de verwachte resultaten30opbrengst. De meest rigoureuze aanpak is het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke lysine residuen, die is moeilijk of onmogelijk voor de meeste klassieke methoden als gevolg van de lage stoichiometrie van lysine acetylation in natuur7,11. Deze uitdaging heeft geweest ontrafeld door de uitbreidingsstrategie van de genetische code, waarin een gemanipuleerde pyrrolysyl-tRNA synthetase werkzaam variant van Methanosarcinaceae soorten in rekening te brengen van tRNAPyl met acetyllysine, maakt gebruik van de host translationeel machines om te onderdrukken de TECOS stop codon in het mRNA en regisseert de opneming van acetyllysine in de ontworpen positie van het doel eiwit31. Onlangs, hebben we dit systeem met een verbeterde EF-Tu-bindende tRNA32 en een bijgewerkte acetyllysyl-tRNA synthetase33geoptimaliseerd. Bovendien hebben we dit systeem van de verbeterde integratie in acetylation studies van malate dehydrogenase34 en tyrosyl-tRNA synthetase35toegepast. Hierin tonen wij het protocol voor het genereren van zuiver geacetyleerd eiwitten van het moleculaire klonen biochemische identificatie met behulp van malate dehydrogenase (MDH), die we hebben uitgebreid bestudeerd als een demonstratieve voorbeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plaats-geleide mutagenese van het Target-gen
Opmerking: MDH is uitgedrukt onder T7 promotor in de vector pCDF-1 met de oorsprong van de CloDF13 en een exemplaaraantal van 20 tot 40-34.
- Het oranje stop codon op de positie 140 in het gen te introduceren door inleidingen (toekomen primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG en omgekeerde primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), volgens de instructies van de plaats-geleide mutagenese kit.
- Versterken van de plasmide van de sjabloon met het gen van wild-type malate dehydratase en voeg de stop codon mutatie door de polymerase-kettingreactie (PCR) reactie. In het reactiemengsel, omvatten 12,5 µL van 2 X DNA polymerase enzym mix, 1,25 µL van 10 µM Forward primer, 1,25 µL van 10 µM Reverse primer, 1 µL van sjabloon DNA (20 ng/µL) (pCDF-1 plasmide met het gen van wild-type MDH), en 9 µL van nuclease-gratis water.
- PCR reactie parameters als volgt gebruiken: eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 s; 25 cycli van 10 bij 98 ° C, 30 s s bij 55 ° C, en 3 min bij 72 ° C; laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 3 minuten. Na PCR, het versterkte materiaal rechtstreeks toevoegen aan de mix Kinase-Ligase-DpnI enzym uit de kit gedurende 1 uur bij kamertemperatuur voor circularization en sjabloon verwijderen.
Opmerking: Het reactiemengsel bevat 1 µL van het PCR product, 5 µL van 2 X reactie Buffer 1 µL van 10 X Kinase-Ligase-DpnI enzym mix en 3 µL nuclease-gratis water.
- PCR reactie parameters als volgt gebruiken: eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 s; 25 cycli van 10 bij 98 ° C, 30 s s bij 55 ° C, en 3 min bij 72 ° C; laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 3 minuten. Na PCR, het versterkte materiaal rechtstreeks toevoegen aan de mix Kinase-Ligase-DpnI enzym uit de kit gedurende 1 uur bij kamertemperatuur voor circularization en sjabloon verwijderen.
- Voeg 5 µL van het mengsel van de reactie op de buis van 25 µL ontdooid bevoegde E. coli DH5α cellen uit de kit. Zorgvuldig flick van de buis te mengen, en plaats het mengsel op het ijs voor 30 min. warmte schok het mengsel bij 42 ° C gedurende 30 s en op ijs voor extra 5 min.
- Pipetteer 600 µL van kamertemperatuur Super optimale bouillon met omzettingsproducten onderdrukking (SOC) media uit de kit in het mengsel, Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten met schudden bij 250 omwentelingen per minuut, verspreid 100 µL op een lysogenie Bouillon (LB) agar bord met de overeenkomstige antibioticum , en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
- Kies 4-6 enkele kolonies in 6 mL verse LB-media met de overeenkomstige antibioticum, en bij 37 ° C na een nacht bebroeden met schudden bij 250 omwentelingen per minuut. Het uittreksel van plasmiden van elke overnachting cultuur door de plasmide zuivering kit, na handleiding van de fabrikant, dan verzenden plasmiden voor DNA rangschikkend volgens het protocol van de dienstverlener te bevestigen de stop codon mutatie op juiste posities.
- Bewaren van de stam met de juiste volgorde bij-80 ° C door het mengen van 1 mL overnachting cultuur en 300 µL 100% DMSO.
2. weergave van de geacetyleerd proteïne
- Invoegen van de genen van geoptimaliseerde acetyllysyl-tRNA synthetase33 en geoptimaliseerd tRNAPyl 32 in het pTech -plasmide. Plaats het tRNA synthetase gen onder de constitutieve lpp promotor. Plaats het tRNA-gen onder de constitutieve proK promotor34.
- Samen transformeren de expressie vector34 met het gemuteerde TAG-bevattende gen van malate dehydrogenase en het plasmide herbergen de geoptimaliseerde acetyllysine opneming systeem, in 25 µL cellen ontdooide bevoegde E. coli BL21(DE3) door warmte schok bij 42 ° C gedurende 10 s en op ijs voor extra 5 min.
- Pipetteer 600 µL van kamertemperatuur SOC media in het mengsel, Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten met schudden bij 275 t/min, 100 µL op een bord met 100 µg/mL streptomycine en 50 µg Mo/mL chlooramfenicol verspreid, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 275 omwentelingen per minuut.
- Een één kolonie van de plaat halen, en enten in 15 mL verse LB-media met 100 µg/mL streptomycine en 50 µg Mo/mL chlooramfenicol in een tube van 50 mL's nachts bij 37 ° C met schudden met de snelheid van 250 rpm. De 15 mL overnachting cultuur overbrengen naar 300 mL verse LB-media met antibiotica in een maatkolf van 1 L, en Incubeer bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
- Los acetyllysine met water te maken van 100 mM stockoplossing, bewaren bij 4 ° C. Acetyllysine van 5 mM en 20 mM nicotinamide (remmer van deacetylases) toevoegen aan de media groei wanneer absorptie 0,5 op 600 bereikt nm.
- Groeien van cellen voor een extra 1 uur bij 37 ° C, schudden bij 250 omwentelingen per minuut, dan toevoegen van 0.5 mM IPTG voor eiwit expressie, en groeien van cellen bij 25 ° C's nachts, met schudden bij 180 t/min.
Opmerking: De voorwaarden van de expressie wellicht optimalisatie voor verschillende eiwitten.
- Groeien van cellen voor een extra 1 uur bij 37 ° C, schudden bij 250 omwentelingen per minuut, dan toevoegen van 0.5 mM IPTG voor eiwit expressie, en groeien van cellen bij 25 ° C's nachts, met schudden bij 180 t/min.
- Verzamelen van cellen door centrifugatie bij 3000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten, verwijder het supernatant en wassen van cel pellets met de-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Verzamelen van gewassen cellen bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en opslaan van cel pellets bij-80 ° C.
3. de zuivering van het geacetyleerd eiwit
- Ontdooi de bevroren cel pellets op ijs, en resuspendeer met 15 mL lysis-buffermengsel (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl imidazool van 20 mM en 20 mM nicotinamide), 5 µL van β-mercaptoethanol en 1 µL Benzonase nuclease (250 eenheden).
- Breken van de cellen met het 40 kHz ultrasoonapparaat op 70% kracht output met 10 cycli van 10 s korte uitbarstingen, gevolgd door intervallen van 30 s voor koeling aan vorm ruwe extract. Centrifuge ruwe extract bij 20.000 x g gedurende 25 min bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof filteren met de membraanfilter van 0,45 µm, en laadt in een kolom met 1 mL van nikkel-nitrilotriacetic zuur (Ni-NTA) hars geëquilibreerd met 20 mL water en 20 mL lysisbuffermengsel.
Opmerking: Cellen kunnen ook worden uitgesplitst milde detergentia, als ultrasoonapparaat niet beschikbaar is. - Was de kolom met 20 mL was buffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl imidazool van 50 mM en 20 mM nicotinamide) en Elueer vervolgens met 2 mL elutie buffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl imidazool 150 mM en 20 mM nicotinamide).
- Desalt de elutie breuk met ontzouten buffer (25 mM Tris pH 7,8 en 10 mM NaCl) door de kolom PD-10, die volgt op de handleiding van de fabrikant. Meten van de concentratie van de eluted proteïne door volgens de instructies van de kwantitatieve analyse van Bradford eiwitreagens. Het desalted eiwit is klaar voor verdere experimenten.
Opmerking: Breng 50% glycerol voorraad van het eiwit en houden in-80 ° C voor opslag.
4. Biochemische karakterisering van het geacetyleerd eiwit
-
SDS-pagina en massa spectrometrie analyses.
- Denatureren eiwitten met het natrium dodecyl sulfaat (SDS) monster buffer (5 µL eiwitSteekproef met 2 µL 4 X SDS monster buffer) in een tube 2 mL bij 105 ° C gedurende 5 minuten, Centrifugeer het mengsel bij 2000 x g gedurende 10 s, belasting op de 4-20% natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel electroph oresis (SDS-PAGE) gel en run bij 200 V voor 30 min.
- Wassen van de gel met gedestilleerd water en schud zachtjes gedurende 5 min, werkwijze 3 keer herhalen. Negeren van het water en de gel vlek met Coomassie blue vlek voor 1 h met zacht schudden. De vlek de gel met gedestilleerd water, schud voorzichtig voor 30 min, en herhaal dit-vlekken 3 keer.
- Knippen van de band op 33 kDa op de Coomassie blue gebeitste SDS-pagina gel, en stuur het naar massaspectrometrie voorzieningen of bedrijven om te bevestigen dat de acetyllysine werd opgenomen op de ontworpen positie.
Opmerking: Het protocol van massaspectrometrie analyse volgde de eerdere experiment34.
-
Westelijke bevlekken
- De SDS-pagina gel met hetzelfde protocol in stap 4.1 worden uitgevoerd. Geniet na de gel worden uitgevoerd, de gel met de overdracht buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 en 20% methanol) gedurende 15 minuten.
- Activeren van een 0,2 µm, 7 x 8,5 cm Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan met methanol voor 1 min, en spoel met overdracht buffer vóór de voorbereiding van de transfer-sandwich.
Opmerking: Methanol is gevaarlijk in geval van contact met de huid, oogcontact, ingestie of inhalatie. Ernstige overmatige blootstelling kan resulteren in de dood. - Controleer de sandwich van de overdracht van de kathode naar de anode (spons, filtreerpapier, SDS-pagina gel, PVDF membraan, filtreerpapier en spons). Zet de stack in de tank van de overdracht, draaien op constante stroom van 350 mA voor 45 min.
Opmerking: Transfertijd wellicht optimalisatie. - Wassen van het membraan PVDF met 25 mL Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween-20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,6) buffer voor 5 min met zacht schudden. Het blokkeren van het membraan met 5% bovien serumalbumine (BSA) in de buffer TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer het membraan met HRP-geconjugeerde acetyllysine-antilichaam met een eindconcentratie van 1 µg/mL verdund met 5% BSA in TBST bij 4 ° C's nachts met zacht schudden.
Opmerking: Voor snellere resultaten, kon deze stap worden uitgevoerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. De verdunning van antilichaam wellicht optimalisatie. - Wassen het membraan met 20 mL TBST buffer voor 5 min met zacht schudden, herhaal de stap 4 keer. Het substraat Chemoluminescentie toepassen door het membraan door het volgen van de instructies van de fabrikant. Vangen het signaal met een charge - coupled apparaat (CCD) camera gebaseerde imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De opbrengst van geacetyleerd MDH eiwit was 15 mg per 1 L cultuur, terwijl dat van wild-type MDH 31 mg per 1 L cultuur was. Gezuiverde eiwitten werden geanalyseerd door SDS-pagina, zoals aangegeven in Figuur 1. De wild-type MDH werd gebruikt als een positieve controle34. Het eiwit gezuiverd uit cellen herbergen van het acetyllysine (AcK) opneming systeem en het mutant mdh -gen, maar zonder AcK in groei media, werd gebruikt als een negatieve controle. Lysine acetylation van gezuiverde eiwitten werd ontdekt door Westelijke Bevlekkende met behulp van het acetyllysine-antilichaam zoals afgebeeld in Figuur 2. De acetylation van het residu van lysine 140 in de malate dehydrogenase werd bevestigd door tandem massaspectrometrie analyse zoals afgebeeld in Figuur 3.
De volgorde van de eiwitten van MDH eiwit (het fragment voor tandem MS analyse is vetgedrukt):
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
De volgorde van de eiwitten van geoptimaliseerde acetyllysyl-tRNA synthetase33:
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
De germinale genetische identiteit van geoptimaliseerde tRNAPyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA
Figuur 1 : The Coomassie blue gebeitste SDS-pagina gel van gezuiverde full-length MDH en de variant van de AcK-bevattende. De dezelfde hoeveelheid elutie breuken op de SDS-pagina geladen waren gel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Het westelijke bevlekken van gezuiverde wild-type MDH en de variant van de AcK-bevattende. De dezelfde hoeveelheid elutie breuken waren geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : LC-MS/MS analyse van AcK-bevattende MDH variant. De tandem massaspectrum van de peptide (residuen 135-142) AGVYDKACNK uit gezuiverde geacetyleerd MDH variant. KAC duidt AcK opneming. De partiële sequentie van de peptide bevattende de AcK kan worden gelezen uit de geannoteerde b of y ion-reeks. Gecompenseerde pieken waren in het rood. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De genetische opneming van noncanonical aminozuren (ncAAs) is gebaseerd op de onderdrukking van een toegewezen codon, meestal de amber stop codon TECOS36,37,38,39, van het tRNA ncAA-in rekening gebracht die bevatten de overeenkomstige anticodon. Zoals bekend de TECOS codon is erkend door de release factor-1 (RF1) bij bacteriën, en het kan ook worden onderdrukt door in de buurt van cognaat tRNAs van hosts door canonieke aminozuren (burgerluchtvaartautoriteiten) in rekening gebracht zoals lysine en tyrosine40,41. Dus, de efficiëntie van ncAA opneming op de TECOS codon afhangt van de concurrentie tussen ncAA-charged tRNAs en RF1, en de zuiverheid van ncAA opneming is afhankelijk van de concurrentie tussen ncAA-charged tRNAs en cAA-in rekening gebracht in de buurt van cognaat tRNAs. Lage rendement en zuiverheid van het doel geacetyleerd eiwit kunnen worden veroorzaakt door de efficiëntie van de lage opneming van de orthogonale paar ingevoerd in de cellen van de gastheer. Dit probleem kan worden opgelost door de verhoging van de concentratie van acetyllysine in de media, en met behulp van onlangs geoptimaliseerd acetyllysine opname systemen, die de onderdrukking van de codon TECOS met 58 keer32,33 stegen, zowel de efficiëntie en de zuiverheid van de opneming van de acetyllysine zal worden verbeterd. Als aangegeven in Figuur 1 en eiwit rendementen te vergelijken, de efficiëntie van de opneming van de acetyllysine was ongeveer 50%, en er was geen detecteerbare eiwit gezuiverd van cellen herbergen de AcK opneming systeem en het gemuteerde gen van MDH, maar zonder AcK in groei media, die de hoge zuiverheid van de opneming van de acetyllysine aangegeven. Bovendien, massaspectrometrie analyse ook toonde geen elke burgerluchtvaartautoriteiten op positie 140 van MDH, waarmee wordt aangegeven van de homogeniteit van de opneming van acetyllysine.
Er zijn twee belangrijkste beperkingen van deze aanpak. Ten eerste vanwege de concurrentie van de acetyllysine-charged tRNA met beide RF1 en cAA-in rekening gebracht in de buurt van cognaat tRNAs zoals hierboven beschreven, op dit moment, het maximum aantal acetyllysine residuen die gelijktijdig kunnen worden opgenomen in een enkel proteïne is drie 33,42. Ten tweede, cellen hebben andere soorten deacetylases, die nicotinamide weerstaan en bepaalde doel eiwitten kan deacetylate. Die eiwitten oplopen dus niet 100% acetylation op specifieke locaties. Onlangs, hebben we een thio-acetyllysine opneming systeem dat kan worden gebruikt als een niet-deacetylable analoog van acetyllysine43opgericht, dus dit systeem zou een goede alternatieve aanpak in dit geval.
Zoals eerder vermeld, is de klassieke aanpak van biochemically karakteriseren lysine acetylation met behulp van plaats-geleide mutagenese. Glutamine wordt gebruikt als een nabootsen van acetyllysine, en arginine wordt gebruikt als een niet-geacetyleerd lysine nabootsen. Echter beide nabootsers zijn niet echt isosteres, en nog altijd niet de verwachte resultaten30doen opbrengst. De uitbreidingsstrategie van de genetische code kan genereren homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke lysine residuen, die is de meest rigoureuze manier om geacetyleerd eiwitten te karakteriseren.
De genetische opneming systeem voor acetyllysine is afgeleid van het paar pyrrolysyl-tRNA synthetase varianten, en hun cognaat tRNA van Methanosarcinaceae soorten, die ook bekend staat als orthogonale in eukaryoten44. Eerdere studies hebben aangetoond dat dit systeem kan worden toegepast in de cellen van zoogdieren en bepaalde dieren voor eiwit acetylation studies39, dus dit protocol kan worden uitgebreid tot zoogdiercellen en zelfs dieren voor bredere toepassingen in medische onderzoek en industrie. Dit protocol is bovendien ook in wezen hetzelfde protocol gebruikt op te nemen van de verschillende soorten ncAAs, vergend een eenvoudige wijziging aan de orthogonale paar ingevoerd in de cellen van de gastheer.
De acetyl groep verwijderen lysine deacetylases (KDACs) uit het residu geacetyleerd lysine in eiwitten45. De Sir-type CobB is het alleen bekende deacetylase in E. coli, die kan worden geremd door nicotinamide27. Dus, om te voorkomen dat de deacetylation van geacetyleerd eiwit gegenereerd tijdens de celgroei en eiwitreiniging, 20 tot 50 mM nicotinamide moet worden toegevoegd in zowel de media van de groei en de zuivering buffers. Zodra gezuiverd, is acetylation van lysine residuen relatief stabiel vanwege het ontbreken van deacetylase. Ten tweede, te verlagen van de achtergrond van niet-specifieke acetylation op andere residuen van lysine in het eiwit, de BL21 (DE3) stam werd gebruikt als de expressie-stam, als gevolg van de aanzienlijk lager niveau van eiwit acetylation dan gebruikte K12 afkomstige stammen46 . Zoals blijkt uit Figuur 2, had de wild-type MDH uitgedrukt uit BL21(DE3) cellen geen detecteerbare acetylation door het westelijke bevlekken. Dit is een andere belangrijke factor om de zuiverheid van acetylation in het target-eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH (AI119813), het opstarten van de Universiteit van Arkansas en de award van Arkansas Biosciences Instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
References
- Krishna, R. G., Wold, F.
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M.
- Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
- Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T.
- Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
- Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
- Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
- Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
- Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
- Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
- Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
- Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
- You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
- Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E.
- Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
- Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
- Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
- Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
- Jones, J. D., O'Connor, C. D.
- Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
- Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
- Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
- Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
- Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M.
- Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
- Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
- Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D.
- O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
- Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
- O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
- Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
- Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
- Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
- Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).
