Summary
Genetisk kode utvidelse fungerer som et kraftig verktøy for å studere en rekke biologiske prosesser, herunder protein acetylation. Her viser vi en lettvinte protokoll for å utnytte denne teknikken for å generere homogent acetylated proteiner ved bestemte områder i Escherichia coli celler.
Abstract
Post-translasjonell endringer som oppstår på bestemte plasseringer av proteiner har vist å spille viktige roller i en rekke cellulære prosesser. Blant dem er reversibel lysin acetylation en av de mest distribuerte inne alle domenen av livet. Selv om flere masse massespektrometri-baserte acetylome studier er utført, ytterligere er karakteristikk av disse antatte acetylation mål begrenset. En mulig årsak er at det er vanskelig å generere rent acetylated proteiner på ønsket plassering ved de fleste klassiske biokjemiske tilnærminger. For å overvinne denne utfordringen, brukes genetiske koden ekspansjon teknikken for å bruke paret en utviklet pyrrolysyl-tRNA synthetase variant og dens beslektet tRNA fra Methanosarcinaceae arter, til direkte cotranslational inkorporering av acetyllysine i det bestemte området i protein av interesse. Etter første søknad i studiet av histone acetylation, har denne tilnærmingen tilrettelagt acetylation studier på en rekke proteiner. I dette arbeidet viste vi en lettvinte protokoll for å produsere site-specifically acetylated proteiner ved hjelp av modellen bakterien Escherichia coli som vert. Malate dehydrogenase ble brukt som en demonstrasjon eksempel i dette arbeidet.
Introduction
Post-translasjonell endringer (PTMs) proteiner oppstår etter oversettelsesprosessen, og oppstår kovalente tillegg av funksjonelle grupper til aminosyre rester, spiller viktige roller i nesten alle biologiske prosesser, herunder genet transkripsjon, stressrespons, differensiering og metabolisme1,2,3. Hittil om 400 særegne vært PTMs identifisert4. Intrikate genomet og proteom forsterkes i stor grad av protein PTMs, som de regulerer protein aktivitet og lokalisering, og påvirker samspill med andre molekyler som proteiner, atomer syren, lipider og kofaktorer5.
Protein acetylation har vært i forkant av PTMs studier i de siste to tiårene6,7,8,9,10,11,12. Lysin acetylation ble først oppdaget i histones mer enn 50 år siden13,14, har blitt godt gransket, og er kjent i mer enn 80 transkripsjonsfaktorer, regulatorer og ulike proteiner15, 16,17. Studier på protein acetylation har ikke bare gitt oss en dypere forståelse av dens forskrifter mekanismer, men også veiledet behandlinger for en rekke sykdommer forårsaket av dysfunksjonelle acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. det ble antatt at lysin acetylation skjer bare i eukaryoter, men nyere studier har vist at protein acetylation spiller også nøkkelroller i bakteriell fysiologi, inkludert chemotaxis, acid motstand, aktivisering og stabilisering av virusets øyer og andre virulens relaterte proteiner24,25,26,27,28,29.
En vanlig metode å karakterisere biokjemisk lysin acetylation bruker nettstedet-rettet mutagenese. Glutamin er brukt som en etterligne av acetyllysine på grunn av sin liknende størrelse og polaritet. Arginine er brukt som en ikke-acetylated lysin etterligne, siden den opprettholder sitt positive ladningen under fysiologiske forhold, men kan ikke være acetylated. Men begge imiterer er ikke ekte isosteres og alltid gir ikke de forventede resultater30. Den strengeste tilnærmingen er å generere homogent acetylated proteiner på bestemte lysin rester, som er vanskelig eller umulig for mest klassiske metodene på grunn av den lave støkiometri av lysin acetylation i naturen7,11. Denne utfordringen har vært unraveled av den genetiske kode ekspansjon strategien, som sysselsetter en utviklet pyrrolysyl-tRNA synthetase variant fra Methanosarcinaceae Art å lade tRNAPyl med acetyllysine, utnytter verten translasjonsforskning maskiner å undertrykke UAG stoppe codon i mRNA og dirigerer inkorporering av acetyllysine i designet plasseringen av målet protein31. Vi har nylig optimalisert dette systemet med en forbedret EF-Tu-bindende tRNA32 og en oppgradert acetyllysyl-tRNA synthetase33. Videre har vi brukt dette forbedret innlemmelse systemet i acetylation studier malate dehydrogenase34 og tyrosyl-tRNA synthetase35. Her viser vi protokollen for å generere rent acetylated proteiner fra molekylær kloning til biokjemisk identifisering ved hjelp av malate dehydrogenase (MDH), som vi har mye studert som en demonstrativt eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stedet rettet mutagenese av målet genet
Merk: MDH er uttrykt under T7 arrangøren i pCDF-1 vektoren CloDF13 opprinnelse og kopiere flere 20 til 4034.
- Introdusere den oransje stopp codon der 140 i genet av primere (videresende primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG og reversere primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), følge instruksjonen av området-rettet mutagenese kit.
- Forsterke mal plasmider inneholder genet av vill-type malate dehydratase, og sett stopp codon mutasjon polymerase kjedereaksjon (PCR) reaksjon. I reaksjonsblandingen, inkluderer 12.5 µL av 2 X DNA polymerase enzym blanding, 1,25 µL av 10 µM frem primer, 1,25 µL av 10 µM omvendt primer, 1 µL av DNA (20 ng/µL) (pCDF-1 plasmider inneholder genet av vill-type MDH), og 9 µL nuclease uten vann.
- Bruker PCR reaksjon parametere som følger: første rødsprit 98 ° c for 30 s; 25 sykluser av 10 s på 98 ° C, 30 s ved 55 ° C og 3 min ved 72 ° C; endelig utvidelse ved 72 ° C i 3 minutter. Etter PCR, legge til forsterket materialet direkte Kinase-Ligase-DpnI enzym mix fra kit 1t ved romtemperatur for circularization og mal fjerning.
Merk: Reaksjonsblandingen inneholder 1 µL av PCR produkt, 5 µL av 2 X reaksjon Buffer, 1 µL av 10 X Kinase-Ligase-DpnI enzym blanding og 3 µL nuclease uten vann.
- Bruker PCR reaksjon parametere som følger: første rødsprit 98 ° c for 30 s; 25 sykluser av 10 s på 98 ° C, 30 s ved 55 ° C og 3 min ved 72 ° C; endelig utvidelse ved 72 ° C i 3 minutter. Etter PCR, legge til forsterket materialet direkte Kinase-Ligase-DpnI enzym mix fra kit 1t ved romtemperatur for circularization og mal fjerning.
- Legge til 5 µL av reaksjonen blanding til tube 25 µL tint kompetent E. coli DH5α celler fra kit. Forsiktig sveip røret å blande og plasser blandingen på is 30 min. varme sjokk blandingen på 42 ° C for 30 s og sted på is ytterligere 5 min.
- Pipetter 600 µL av romtemperatur Super Optimal buljong med Catabolite undertrykkelse (SOC) media fra kit i blandingen, ruge på 37 ° C for 60 min med skjelvende på 250 rpm, spre 100 µL på en lysogeny kjøttkraft (LB) agar tallerken med det tilsvarende antibiotikumet , og ruge over natten på 37 ° C med skjelvende på 250 rpm.
- Velg 4-6 enkelt kolonier i 6 mL frisk LB media med det tilsvarende antibiotikaet, og ruge på 37 ° C over natten med skjelvende på 250 rpm. Pakk ut plasmider fra hver natten kultur av plasmider rensing kit, følger produsentens håndbok, så sende plasmider for DNA sekvensering etter protokollen for å bekrefte stopp codon mutasjon på riktige posisjoner.
- Lagre belastningen med riktig rekkefølge på-80 ° C ved å blande 1 mL natten kultur og 300 µL 100% DMSO.
2. uttrykk for Acetylated Protein
- Sett inn gener optimalisert acetyllysyl-tRNA synthetase33 og optimalisert tRNAPyl 32 i pTech plasmider. Plass tRNA synthetase genet under konstituerende lpp arrangøren. Plass tRNA genet under konstituerende proK promoter34.
- Co transformere uttrykk vektor34 inneholder muterte TAG inneholder genet av malate dehydrogenase og plasmider skjuler optimalisert acetyllysine innlemmelse systemet, i 25 µL tinte kompetent E. coli BL21(DE3) celler av heten støt ved 42 ° C for 10 s og sted på is ytterligere 5 min.
- Pipetter 600 µL romtemperatur SOC medier i blandingen, ruge på 37 ° C for 60 min med skjelvende på 275 rpm, spre 100 µL på en tallerken med 100 µg/mL streptomycin og 50 µg/mL chloramphenicol og ruge over natten på 37 ° C med skjelvende på 275 rpm.
- Plukk opp en enkelt koloni fra platen og vaksinere i 15 mL frisk LB media med 100 µg/mL streptomycin og 50 µg/mL chloramphenicol i en 50 mL tube overnatting på 37 ° C med skjelvende med 250 rpm hastighet. Overføre 15 mL overnatting kulturen til 300 mL frisk LB medier med antibiotika i en 1 L bolle og ruge på 37 ° C med skjelvende på 250 rpm.
- Oppløse acetyllysine med vann for å lage 100 mM lagerløsning, lagre på 4 ° C. Legge til 5 mM acetyllysine og 20 mM nikotinamid (inhibitor av deacetylases) til vekst medier når absorbansen når 0,5 på 600 nm.
- Vokse celler for en ekstra 1 h ved 37 ° C, rister på 250 rpm, så Legg 0,5 mM IPTG for protein uttrykk, og vokse celler ved 25 ° C over natten, med skjelvende på 180 rpm.
Merk: Uttrykket betingelsene må optimalisering for ulike proteiner.
- Vokse celler for en ekstra 1 h ved 37 ° C, rister på 250 rpm, så Legg 0,5 mM IPTG for protein uttrykk, og vokse celler ved 25 ° C over natten, med skjelvende på 180 rpm.
- Samle celler ved sentrifugering 3000 x g på 4 ° C i 15 min, forkaste nedbryting og vaske celle pellets med fosfat-bufret saltvann (PBS) bufferen (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4137 mM NaCl, 2.7 mM KCl). Samle vasket celler på 10 000 x g ved 4 ° C i 5 min forkaste nedbryting og lagre celle pellets på-80 ° C.
3. rensing av Acetylated Protein
- Tine frossen celle pellets på is, og å suspendere med 15 mL lyseringsbuffer (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl 20 mM imidazole og 20 mM nikotinamid), 5 µL av β-mercaptoethanol og 1 µL Benzonase nuclease (250 enheter).
- Bryte celler ved 40 kHz sonication på 70% strøm utgang med 10 sykluser av 10 s korte støt, etterfulgt av intervaller på 30 s kjøling til skjemaet rå ekstrakt. Sentrifuger rå ekstrakt 20.000 x g for 25 min på 4 ° C. Filtrere nedbryting 0,45 µm membran filteret og laste inn i en kolonne som inneholder 1 mL av nikkel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) harpiks equilibrated med 20 mL vann og 20 mL lyseringsbuffer.
Merk: Cellene kan også deles av milde vaskemidler, hvis sonication ikke er tilgjengelig. - Vask kolonnen med 20 mL vaskebuffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole og 20 mM nikotinamid), og deretter elute med 2 mL elueringsbufferen (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl 150 mM imidazole og 20 mM nikotinamid).
- Desalt tilsettes brøken med avsalte buffer (25 mM Tris pH 7,8 og 10 mM NaCl) av kolonnen PD-10 etter produsentens håndbok. Måle konsentrasjonen av eluted protein ved å følge instruksjonen av Bradford protein analysen reagensen. Avsalte protein er klar for ytterligere eksperimenter.
Merk: Gjøre 50% glyserol lager av protein, og holde-80 ° C for lagring.
4. biokjemiske karakterisering av Acetylated Protein
-
SDS side og masse massespektrometri analyser.
- Denature proteiner med natrium dodecyl sulfate (SDS) eksempel buffer (5 µL protein utvalget med 2 µL 4 X SDS eksempel buffer) i en 2 mL tube på 105 ° C i 5 min, sentrifuge blandingen 2000 x g for 10 s, Last på 4-20% natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel electroph oresis (SDS-side) gel, og kjøre på 200 V for 30 min.
- Vask gel med destillert vann og riste forsiktig i 5 minutter, gjenta prosessen 3 ganger. Forkaste vannet og flekken gel med Coomassie blå flekken 1t med mild risting. De flekken gel med destillert vann, riste forsiktig for 30 min, og gjenta dette de flekken 3 ganger.
- Klipp bandet 33 kDa på Coomassie blå-farget SDS side gel, og sende det til massespektrometri fasiliteter eller selskaper for å bekrefte at acetyllysine ble innlemmet i designet posisjon.
Merk: Protokollen for massespektrometri analyse fulgte de forrige eksperiment34.
-
Vestlige Blotting
- Kjør SDS side gel med samme protokoll i trinn 4.1. Etter gel kjører, suge gel med overføring bufferen (25 mM Tris, 192 mM glysin, pH 8.3 og 20% metanol) i 15 min.
- Aktivere en 0,2 µm, 7 cm x 8,5 cm polyvinylidene difluoride (PVDF) membran med metanol for 1 min, og skyll med overføring buffer før forberede overføringen sandwich.
Merk: Metanol er farlig ved hudkontakt, øyekontakt, inntak eller innånding. Alvorlige over-eksponering kan føre til døden. - Gjøre overføring sandwich fra katoden til anode (svamp, filter papir, SDS side gel, PVDF membran, filter papir og svamp). Legges stabelen i overføring, kjøre konstant strøm av 350 mA i 45 minutter.
Merk: Overføringstiden må optimalisering. - Vask PVDF membranen med 25 mL Tris-bufret saltvann, 0,1% mellom 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7.6) bufferen for 5 min med mild risting. Blokkere membranen med 5% Bovine serum albumin (BSA) i TBST buffer 1t ved romtemperatur.
- Inkuber membranen med HRP-konjugerte acetyllysine-antistoff med en siste konsentrasjon av 1 µg/mL fortynnet med 5% BSA i TBST på 4 ° C over natten med mild risting.
Merk: For raskere resultat, kan dette trinnet utføres i romtemperatur 1t. Fortynning av antistoff må optimalisering. - Vask membranen med 20 mL TBST buffer i 5 min med mild risting, gjentar du trinn 4 ganger. Gjelde chemiluminescence underlaget membranen ved å følge instruksjonene fra produsenten. Fange signalet med en kostnad - sammen enhet (CCD) kamera-baserte imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avkastningen av acetylated MDH protein ble 15 mg per 1 L kultur, av vill-type MDH 31 mg per 1 L kultur. Renset proteiner ble analysert av SDS side som vist i figur 1. Vill-type MDH ble brukt som en positiv kontroll34. Protein renset fra celler skjuler acetyllysine (AcK) inkorporering systemet og mutant mdh genet, men uten bekreftelser i vekst medier, ble brukt som en negativ kontroll. Lysin acetylation renset proteiner ble oppdaget av vestlige blotting bruker acetyllysine-antistoffer som vist i figur 2. Acetylation av lysin rester 140 i malate dehydrogenase ble bekreftet av tandem massespektrometri analyse som vist i Figur 3.
Protein sekvensen av MDH protein (fragmentet for tandem MS analyse er i fet skrift):
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
Protein sekvensen optimalisert acetyllysyl-tRNA synthetase33:
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
Gene sekvensen av optimalisert tRNAPyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA
Figur 1 : The Coomassie blå-farget SDS side gel renset full lengde MDH og dens AcK-inneholder variant. De samme mengder elueringsrør fraksjoner ble lastet opp på siden SDS-gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Den vestlige blotting renset vill-type MDH og dens AcK-inneholder variant. De samme mengder elueringsrør fraksjoner var lastet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : LC--MS-/ MS analyse av bekreftelser inneholder MDH variant. Tandem mass spekteret av peptid (rester 135-142) AGVYDKACNK fra renset acetylated MDH variant. KAC angir AcK innlemmelse. Delvis sekvensen av peptid som inneholder AcK kan leses fra kommenterte b eller y ion serien. Matchet toppene var i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk inkorporering av noncanonical aminosyrer (ncAAs) er basert på undertrykkelse av en tilordnet codon, hovedsakelig den oransje stopp codon UAG36,37,38,39, av ncAA-ladet tRNA som inneholder de tilsvarende anticodon. Som er kjent, UAG codon er anerkjent av det løslate faktor-1 (RF1) i bakterier, og det kan også være undertrykt nær beslektet tRNAs fra vertene av kanoniske aminosyrer (cAAs) som lysin og tyrosin40,41. Så, effektiviteten av ncAA innlemmelse i UAG codon avhenger konkurransen mellom ncAA-ladet tRNAs og RF1, mens renheten av ncAA innlemmelse avhengig av konkurransen mellom ncAA-ladet tRNAs og cAA-ladet nær beslektet tRNAs. Lav avkastning og renhet av målet acetylated protein kan være forårsaket av lav innlemmelse effektiviteten av ortogonale par introdusert i verten cellene. Dette problemet kan løses ved å øke konsentrasjonen av acetyllysine i media, og bruker nylig optimalisert acetyllysine innlemmelse systemer, som økt UAG codon undertrykkelse av 58 ganger32,33, både effektivitet og renhet acetyllysine selskap vil bli bedre. Som vist i figur 1 og sammenligne protein avkastning, effektiviteten av acetyllysine innlemmelse var ca 50%, og det var ingen synlig protein renset fra celler skjuler AcK innlemmelse systemet og muterte genet av MDH, men uten spor i vekst medier, som angitt av høy renhetsgrad acetyllysine selskap. Videre viste massespektrometri analyse også ikke noen cAAs på posisjon 140 MDH, som indikerer homogenitet av acetyllysine innlemmelse.
Det er to viktigste begrensninger av denne tilnærmingen. Først på grunn av konkurransen i acetyllysine-ladet tRNA med både RF1 og cAA-ladet nær beslektet tRNAs beskrevet ovenfor, for tiden maksimalt antall acetyllysine rester som samtidig kan inkluderes i en enkelt protein er tre 33,42. Dernest har celler andre typer deacetylases, som motstå nikotinamid og kan deacetylate visse mål proteiner. Så, de proteinene kan ikke nå 100% acetylation ved bestemte områder. Nylig, har vi etablert en deg selv thio-acetyllysine innlemmelse system som kan brukes som en ikke-deacetylable analog til acetyllysine43, dermed dette systemet kan være en god alternativ tilnærming i dette tilfellet.
Som nevnt før, bruker den klassiske tilnærmingen til biokjemisk karakterisere lysin acetylation nettstedet-rettet mutagenese. Glutamin er brukt som en etterligne av acetyllysine og arginine er brukt som en ikke-acetylated lysin etterligne. Men begge imiterer er ikke ekte isosteres, og alltid gir ikke de forventede resultater30. Den genetiske kode ekspansjon strategien kan generere homogent acetylated proteiner på bestemte lysin rester, som er den strengeste måten å karakterisere acetylated proteiner.
Genetisk innlemmelse systemet for acetyllysine ble avledet fra to pyrrolysyl-tRNA synthetase varianter, og deres beslektet tRNA fra Methanosarcinaceae arter som er kjent for å være ortogonale i eukaryoter44. Tidligere studier har vist at dette systemet kan brukes i pattedyrceller og enkelte dyr for protein acetylation studies39, dermed presentere protokollen kan utvides pattedyrceller og selv dyr for større programmer i medisinsk forskning og industri. Videre, denne protokollen er også i hovedsak den samme protokollen som brukes til å inkludere forskjellige typer ncAAs, nødvendiggjør en enkel endring ortogonale paret introdusert i verten cellene.
Lysin deacetylases (KDACs) fjerne gruppen acetyl fra acetylated lysin rester i proteiner45. Sirtuin-typen CobB er de bare kjente deacetylase i E. coli som kan bli hemmet av nikotinamid27. Så, for å forhindre deacetylation acetylated protein genereres under cellevekst og protein rensing, 20 til 50 mM nikotinamid bør legges i både vekst medier og rensing buffere. Når renset, er acetylation av lysin rester relativt stabil på grunn av manglende deacetylase. Dernest lavere bakgrunnen uspesifikke acetylation på andre lysin rester i protein, BL21 ble (DE3) belastningen brukt som uttrykk belastningen, grunnet det betydelig lavere nivået av protein acetylation enn vanlige K12-avledet stammer46 . Som vist i figur 2, hadde vill-type MDH uttrykt fra BL21(DE3) cellene ingen synlig acetylation av vestlige blotting. Dette er en annen viktig faktor å øke renheten av acetylation i målet protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH (AI119813), oppstart fra University of Arkansas, og award fra Arkansas biovitenskap Instituttet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
References
- Krishna, R. G., Wold, F.
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M.
- Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
- Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T.
- Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
- Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
- Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
- Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
- Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
- Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
- Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
- Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
- You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
- Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E.
- Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
- Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
- Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
- Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
- Jones, J. D., O'Connor, C. D.
- Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
- Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
- Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
- Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
- Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M.
- Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
- Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
- Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D.
- O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
- Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
- O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
- Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
- Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
- Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
- Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).
