Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/57092
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

Summary

En procedure er præsenteret for hvorved man genfolder af dCACHE periplasmic ligand bindende domæne af Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 fra inklusion organer og rensning at give milligram mængde af protein.

Abstract

Identifikation af naturlige ligander chemoreceptors og strukturelle undersøgelser med henblik på udredning af det molekylære grundlag af ligand specificitet kan lettes meget af produktionen af milligram beløb af ren, foldede ligand bindende domæner. Forsøg på at heterologously express periplasmic ligand bindende domæner af bakteriel chemoreceptors i Escherichia coli (E. coli) ofte resultere i deres målretning i inklusion organer. Her præsenteres en metode for protein recovery fra inklusion organer, hvorved man genfolder og rensning, ved hjælp af periplasmic dCACHE ligand bindende domæne af Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som eksempel. Metoden indebærer udtryk for protein af interesse med en cleavable hans6-tag, isolering og urinstof-medieret opløsning af inklusion organer, protein, hvorved man genfolder af urinstof udtynding og rensning ved affinitet kromatografi, efterfulgt af tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi. Cirkulær dichroism spektroskopi bruges til at bekræfte den foldede tilstand af ren protein. Det er blevet påvist, at denne protokol er generelt nyttigt for produktion af milligram mængder af dCACHE periplasmic ligand bindende domæner af andre bakterielle chemoreceptors i en opløselig og crystallisable form.

Introduction

Chemotaxis og motilitet har vist sig at spille en vigtig rolle i Campylobacter jejuni patogenesen ved at fremme bakteriel kolonisering og invasion af vært1,2,3. Chemotaxis giver mulighed for bakterier til at gå i retning af et optimalt miljø for vækst, som styres af kemiske signaler. Denne proces indebærer anerkendelse af intracellulære og miljømæssig kemiske signaler ved et sæt af proteiner kaldes chemoreceptors eller transducer-lignende proteiner (Tlps). De fleste chemoreceptors er membran-embedded proteiner med en extracytoplasmic ligand bindende domæne (LBD), en transmembrane domæne og et cytoplasmatisk signalsystemer domæne, hvor sidstnævnte interagerer med de cytosole signalsystemer proteiner, der sender signalet til flagellaternes motors4,5,6,7.

Elleve forskellige chemoreceptors er blevet identificeret i C. jejuni genom4,8. Til dato, kun nogle af disse chemoreceptors har været præget og ligand specificiteten af Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, og Tlp1113 er kendt. Identifikation af naturlige ligander af de resterende chemoreceptors i denne art, og talrige chemoreceptors i andre bakterier, kan lettes meget af produktionen af foldede og meget ren rekombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. imidlertid forsøg på at heterologously express periplasmic LBDs af bakteriel chemoreceptors i Escherichia coli ofte resultere i deres målretning i inklusion organer17,18,19 . Ikke desto mindre kan dette fænomen lette let isolation og inddrivelse af protein i hånden. Her præsenteres en metode for protein recovery fra inklusion organer, hvorved man genfolder og rensning, ved hjælp af den periplasmic LBD af C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som eksempel. I dette eksempel blev valgt, fordi Tlp3-LBD tilhører dCACHE familien20 af sensing domæner, som findes talrigt i to-komponent histidin kinaser og chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.

I denne tilgang, udtryk konstruktion, baseret på en pET151/D-TOPO vektor, har været udviklet til at inkorporere en N-terminale hans6-tag efterfulgt af en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang site, for efterfølgende tag fjernelse19. Protokollen beskriver protein overekspression i E. coli, isolation og urinstof-medieret opløsning af inklusion organer, og protein, hvorved man genfolder af urinstof udtynding. Efter, hvorved man genfolder, prøven er renset af affinitet kromatografi, med valgfri tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi. Foldede staten af oprenset protein er bekræftet ved hjælp af cirkulære dichroism spektroskopi. Dette er en modificeret udgave af den metode, der tidligere er udviklet til at restituere sig og rense LBD af en anden chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Denne procedure, sammenfattet i figur 1, udbytter 10-20 mg ren, ukodede Tlp3-LBD per 1 L bakteriekultur, med protein renhed > 90% som anslået af SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. angivelse af hans6-Tlp3-LBD i E. coli

  1. Podes 150 mL i sterile Luria-Bertani (LB) bouillon indeholdende 50 µg mL-1 ampicillin med BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL celler omdannet med pET151/D-TOPO vektor for udtryk for hans6- Tlp3-LBD (aminosyrerester 42-291), og Inkuber det ved 37 ° C i en shaker (orbit diameter, 25 mm) med 200 rpm natten over.
  2. Forberede seks 2 L Erlenmeyerkolben kolber indeholdende 800 mL sterilt LB bouillon og 50 µg mL-1 ampicillin. Podes hver kolbe med 20 mL af overnight kultur fik i trin 1.1. Inkuber dem ved 37 ° C med kontinuerlig ryster på 200 rpm indtil den optisk tæthed på 600 nm når 0,6.
  3. Tag en 1 mL alikvot fra en af kolberne (uninduced kontrolprøve), pellet ved hjælp af en benchtop centrifuge (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) og supernatanten. Gemme den bakterielle pellet ved-20 ° C for efterfølgende SDS-PAGE analyse.
  4. Fremkalde protein udtryk ved at tilføje 1 mM af isopropylalkohol β-D-thiogalactoside (IPTG) til hver kolbe med kultur. Fortsætte inkubere kolberne ved 37 ° C i en shaker på 200 rpm for en yderligere 4 h.
  5. Høste cellerne ved centrifugering ved 5.000 x g i 15 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
    Bemærk: på dette tidspunkt, proceduren kan være midlertidigt ved at placere cellen pellet i et-80 ° C fryser til opbevaring.

2. isolering og denaturering af inklusion organer

  1. Overføre alle celle pellets fremstillet i trin 1,5 til et 250 mL baegerglas og tilsaettes 100 mL buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Tillader cellerne at tø helt (hvis frosset) og resuspenderes. Hold prøve på is, medmindre andet er angivet.
  2. Passere de resuspenderede celler gennem en højtryks stomacher tre gange til lyse celler og sikre fuldstændig klipning af genomisk DNA.
  3. Der centrifugeres i lysate på 10.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Indsamle en 1 mL prøve af supernatanten (opløselige brøkdel) og opbevar den ved-20 ° C for efterfølgende SDS-PAGE analyse. Kassér resten af supernatanten og placere pelleten på is.
    Bemærk: Denne pellet er hvide i farve (let kan skelnes fra ubrudt celler, som er nuance af brunt i farven) og indeholder optagelse organer.
  4. Resuspenderes optagelse organer grundigt i 20 mL iskold buffer B (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM phenylmethanesulfonyl fluorid (PMSF), 1% Triton X-100). Dette letter opløsning af membran og Membranproteiner. Vortex for 1-2 min til at støtte resuspension.
  5. Der centrifugeres prøve på 10.000 x g i 15 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
  6. Knyt resuspenderes grundigt i 20 mL iskold buffer B af vortexing rør i 1-2 min. Kontroller at pellet er opdelt i små stykker. Med pipette overfoeres prøven op og ned til støtte pellet resuspension.
    Bemærk: Det er vigtigt at resuspenderes grundigt for at opnå inklusion organer fri for urenheder.
  7. Gentag trin 2,5. Hvis supernatanten er uklar eller farvet, Gentag trin 2.6 og 2,5 (i nævnte rækkefølge) indtil supernatanten er klar og farveløs.
  8. Resuspenderes i 20 mL iskold buffer C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) af vortexing rør i 1-2 min.
  9. Gentag trin 2,5.
  10. Tilsættes 25 mL iskold denaturering buffer D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M urinstof, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) for at opløse optagelse organer pellet. Resuspend grundigt af vortexing for 1-2 min, eller indtil pelleten er opdelt i små stykker.
  11. Bland suspensionen af aksial rotation med en rotation sats på 30 rpm for 30-120 min. ved 4 ° C.
  12. Afklare den denaturerede proteiner løsning ved centrifugering ved 30.000 x g, 4 ° C i 30 min, placere supernatanten opbevares på is og kassér pelleten.
  13. Måle proteinkoncentration ved hjælp af Bradford assay. 24 tage en alikvot for SDS-gel analyse og placere den på-20 ° C.
    Bemærk: på dette tidspunkt, proceduren kan blive afbrudt af snap-frysning aliquoted prøven i flydende nitrogen og holde det ved-80 ° C til opbevaring.

3. protein hvorved man genfolder

  1. Forberede 250 mL buffer E (3 M urinstof, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,4 M L-arginin monohydrochlorid, 20 mM reduceret L-Glutathion, 2 mM oxideret L-Glutathion) i et 500 mL bægerglas og cool buffer ned til 4 ° C.
  2. Tilføje 60 mg af denatureret protein blanding der indeholder hans6-Tlp3-LBD fremstillet i trin 2.13 til 250 mL buffer E, mens omrøring bufferen på 500 rpm. Inkubér refolding mix ved 4 ° C med kontinuerlig omrøring på 500 rpm i 24-48 timer. Den endelige proteinkoncentration i dette trin er 0,2 mL-1.
  3. Forberede 7 L buffer A i en 8-10 L spand og køle det ned til 4 ° C i forberedelse til den næste trin (trin 3,4), der finder sted i 24-48 h (Se rutediagrammet i figur 1).
  4. Fordybe en ~ 50 cm stykke af dialyse slangen af oppustede 28 mm i diameter, med molekylevægt cut-off på 12-14 kDa i 200 mL af 10 mM ethylendiamintetra syre dinatriumsalt (EDTA-Na2) og varme den over en gasflamme indtil kogende. Skyl dialyse membran med 200 mL af Hedeselskabet2O.
  5. Klemme ene ende af dialyse membran med en dialyse slanger lukning og overføre de 250 mL, hvorved man genfolder blandingen opnået i trin 3.2 ind i dialyse rør. Luk den åbne ende med en anden klemme. Tjekke integriteten af membran til at sørge for der er ingen lækager.
  6. Dialyse røret anbringes i en dialyse spand med den pre afkølede 7 L buffer a forberedt i trin 3.3. Placer en magnetisk røre bar, at sikre, at det ikke vil røre ved dialyse slangen under omrøring.
  7. Dialyse prøve ved 4 ° C med vedvarende omrøring på 500 rpm og ændre bufferen mindst fire gange over en periode på 12 timer. Efter den seneste ændring af buffer, forlade prøven for at dialyse natten over.
    Bemærk: Under dialyse fjernes overskydende af urinstof (~ 3 M) gradvist fra den denaturerede proteiner løsning, der giver protein til refold. Tunge protein nedbør kan observeres i slutningen af dialyse.
  8. Fjern dialyse røret fra spanden og overføre indholdet i et 500 mL bægerglas. Holde protein løsning på is, medmindre andet er angivet.
  9. Filtrer protein løsning gennem en 0,43 µm pore størrelse membran i en 500 mL glasflaske til at fjerne enhver bundfaldne proteiner.

4. rensning af hans6-mærkede Protein ved hjælp af immobiliseret Metal Ion affinitet kromatografi

  1. Opkræve og Blandingen henstår en 5 mL færdigpakkede chelaterende kolonne.
    1. Tilslutte kolonnen til en peristaltisk pumpe, sikre, at der er ingen luft fanget i de forbinder rør.
    2. Kolonnen udvaskes ved at passere gennem 25-50 mL af Hedeselskabet2O.
    3. Opkræve kolonnen lastning 3 mL af 0,1 M NiCl2 og derefter på gennemrejse 25 mL af Hedeselskabet2O.
    4. Blandingen henstår kolonnen med 25 mL buffer F (loading bufferen, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol).
  2. Justere refolded protein prøven fremstillet i trin 3,9 til sammensætningen af buffer F ved tilsætning af 2,5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl og 2,5 mL 2 M imidazol stamopløsninger.
  3. Læg prøven på kolonnen med en sats på 5 mL/min. eller mindre og kassér gennemstrømnings-(ubundet proteiner).
  4. Kolonnen udvaskes med 50-100 mL buffer F at fjerne ikke-specifikt bundet proteiner og kassér gennemstrømnings.
  5. Elueres hans6-Tlp3-LBD med 25 mL buffer G (eluering buffer, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) og pool gennemstrømnings-fraktioner indeholder protein (som bestemt ved hjælp af Bradford reagens).
  6. Mål koncentrationen af protein i de poolede prøve ved hjælp af Bradford assay. Tag en lille alikvot for SDS-PAGE analyse og sted på-20 ° C.

5. hans6-tag fjernelse af at bruge TEV Protease (valgfri)

  1. Forberede og køle ned til 4 ° C, 4 L af buffer H (TEV kavalergang buffer, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol, 2 mM DTT).
  2. Skære ca 5-7 cm af dialyse slangen (diameter 2-3 cm) og fordybe den i 200 mL af Hedeselskabet2O.
  3. Tilføj hans6-tagged TEV protease til hans6-tag protein forberedt i trin 4.5 til en sidste molar forholdet 1 TEV: 8 protein.
  4. Klemme ene ende af slangen med en dialyse slanger lukning og fyld den med protein/TEV protease blanding. Lukke anden enden og sikre, at der er ingen lækager.
  5. Sted i dialyse ind i den pre Vandkølet 4 L af buffer H (fra trin 5.1) og inkuberes det ved 4 ° C med kontinuerlig omrøring i 2 h. ændring bufferen og fortsætte dialyse natten at tillade TEV-medieret kavalergang reaktion til at fuldføre.
  6. I mellemtiden forbereder og køle (4 ° C) 4 L af buffer jeg (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol) som forberedelse til den næste dag.
  7. Efter de natten dialyse, udveksle buffer til buffer jeg forberedt i trin 5.6 og dialyse i en yderligere 1-2 timer ved 4 ° C.
  8. Fjerne røret fra dialyse spanden, unclip ene ende af røret og protein opløsning overføres til en 50 mL Falcon tube. Opløsningen filtreres gennem et 0,43 µm pore størrelse sprøjte filter og holde den på is, medmindre andet er angivet.
  9. Måle volumen af prøven og justere Tris, NaCl og imidazol koncentrationen i buffer F sammensætning (f.eks. for 25 mL af protein løsning i buffer Jørgensen tilføje 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl og 0,25 mL 2 M imidazol).
  10. Forbered en 5 mL HiTrap chelaterende HP kolonne, som beskrevet i trin 4.1.
  11. Læg prøven på kolonnen (strømningshastighed: 5 mL/min) og indsamle den gennemstrømning, som indeholder de ukodede Tlp3-LBD (resterne 42-291). Uncleaved protein, den kløvet sin6-tag og hans6- TEV beholdes af kolonnen.
  12. Kolonnen udvaskes med 5 mL buffer F (loading bufferen) for at tillade alle ukodede protein til at flyde gennem og Eluatet opsamles.
  13. Pool eluat fremstillet i trin 5.11 5.12 og måle proteinkoncentration. Tag en lille alikvot og opbevar den ved-20 ° C for SDS-PAGE analyse.

6. størrelse-udelukkelse kromatografi (Gel filtrering) af Tlp3-LBD

  1. Forberede 1 L buffer A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) og filtrere den ved hjælp af en 0,43 µm membran.
  2. Blandingen henstår en 26/60 størrelse-udelukkelse kolonne med buffer A med en væskehastighed på 4 mL/min.
  3. Koncentrere protein prøven opnåede i trin 5.13 til et volumen på 3-4 mL med 15 mL centrifugal koncentrator med en 10 kDa cut-off (4 ° C, 4000 x g).
  4. Klarlægge protein løsning ved centrifugering ved 13.000 x g, 4 ° C i 30 min til at fjerne enhver bundfaldne proteiner.
  5. Læg prøven på kolonnen pre afbalancerede 26/60 gel filtrering. Udføre kromatografi i buffer A med en væskehastighed på 4 mL/min. overvåge UV spore. Tlp3-LBD eluerer på en opbevaring volumen på 210-220 mL. Pool peak fraktioner.
  6. Måle proteinkoncentration. Tag en lille alikvot for SDS-PAGE analyse.

7. SDS-PAGE analyse af prøver, der opsamlet på forskellige stadier af Protein oprensning

  1. Forberede 1 L af SDS-PAGE kører buffer (buffer Jørgensen), der indeholder 25 mM Tris, 250 mM glycin pH 8.3 og 0,1% (w/v) sodium dodecyl sulfat (SDS).
  2. Forberede 10 mL af 5 x SDS-PAGE loading bufferen (buffer K), der indeholder 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) glycerol, 1 mM DTT og 0,05% bromophenol blå.
  3. Tillader de delprøver, der indsamles under de forskellige trin i rensning (trin 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) at tø.
  4. For hver prøve, bland den mængde, der svarer til 15 µg af total protein med 2 µL af 5 x SDS-side loading buffer, og justere lydstyrken til 10 µL med ddH2O.
  5. Opvarme prøverne ved 95 ° C i 5-10 min, spin dem på 10.000 x g for 30 s og overførsel prøver i en ren rør.
  6. Forberede en SDS-PAGE gel, bruger 15% polyacrylamid adskille gel (til 5 mL: 2,5 mL 30% (w/v) bis-acrylamid, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µL 10% (w/v) SDS, 50 µL 20% (w/v) ammonium persulfat (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) og 5% polyacrylamid stabling gel (til 2 mL: 340 µL 30% (w/v) bis-acrylamid, 250 µL 1 M Tris pH 6,8, 1,37 mL ddH2O, 20 µL 10% (w/v) SDS, 20 µL 20% (w/v) APS, 2 µL TEMED).
  7. Samle apparatet elektroforese og fyld den med 1 x SDS side kører buffer som pr fabrikantens anbefaling.
  8. Indlæse et protein molekylvægt markør og prøver forberedt i skridt 7,5. Udføre elektroforese på en konstant strøm af 25 mA.
  9. Overføre gel i en beholder og skyl det med ddH2O. tilføje 150 mL Coomassie blå farvning løsning indeholdende 25% (v/v) isopropanol, 10% (v/v) eddikesyre og 0,03% (w/v) strålende blå R-250. Beholderen anbringes på en vandret rotation platform for 30 min ved stuetemperatur.
  10. Skyl gel med ddH2O og Placer i den destaining løsning indeholdende 5% (v/v) metanol og 7% (v/v) eddikesyre. Destain mens blanding ved hjælp af en vandret rotation platform for 1 h.
  11. Billede gel og analysere.

8. cirkulære Dichroism (CD) spektroskopi analyse af sekundærstruktur af refolded ren Protein

  1. Overføre 0,5 - 1 mg af refolded protein fremstillet i trin 6.6 ind i en dialyse rør og anbringer dem i en dialyse spand med 5 liter buffer L (50 mM natriumfosfat pH 7,4), forkølede til 4 ° C. Dialyse prøve ved 4 ° C med kontinuerlig omrøring og udføre mindst 3-4 buffer ændringer over 2-4 h inden de forlader prøven for at dialyse natten over.
  2. Koncentrere dialysed protein løsningen til 0,06 mg mL-1 ved hjælp af en 10 kDa cut-off centrifugal koncentrator.
  3. Afklare løsningen ved centrifugering ved 13.000 x g, 4 ° C i 30 min.
  4. Optage langt-UV CD spektrum af prøven ved 25 ° C over en bølgelængde række 200-260 nm ved hjælp af en spectropolarimeter med en scanning af 20 nm min-1. Brug dialyse buffer som et tomt kontrolelement. Gentag optagelse i tre eksemplarer og generere den gennemsnit spektrum.
  5. Beregne sekundærstruktur indhold af deconvoluting CD spectra ved hjælp af programmet CDSSTR fra DichroWeb sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant udtryk for hans6-Tlp3-LBD i E. coli resulterede i protein deposition i inklusion organer. Udtrykket udbyttet fra 1 L af bakteriekulturen beregnet i trin 2.13 var ca. 100 mg hans6-Tlp3-LBD deponeret i inklusion organer. Protein isolation procedure, beskrevet her og illustreret i figur 1, består af opløsning af inklusion organer, hvorved man genfolder protein og rensning, affinitet kromatografi, tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi , og udbytter 10-20 mg ren, ukodede Tlp3-LBD pr. 1 liter bakteriekulturen.

Protein elueres af kolonnen gel-filtrering som en enkelt, symmetrisk top, der svarer til en opbevaring volumen på 220 mL (figur 2A). Beregning af molekylevægt (MW) ved hjælp af en kalibrering plot af log (MW) versus opbevaring volumen (Vopbevaring (mL) = 549.3-73,9 x log(MW)) tilgængelige på webstedet EMBL Protein udtryk og rensning Core facilitet (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), viste værdien af 29 kDa. Denne værdi var meget tæt på, beregnes fra aminosyre-sekvensen (28,7 kDa), som foreslog at Tlp3-LBD er en monomer i løsning.

For at evaluere rensningsprocessen, blev prøver indsamlet på forskellige trin evalueret ved hjælp af SDS-PAGE analyse. Som vist i figur 2B, inklusion organer overvejende indeholdt hans6-Tlp3-LBD. Små mængder af dette protein var også til stede i de opløselige brøkdel af den inducerede kultur (IPTG(+)), og i den uninduced kultur (IPTG(-)) – tilsyneladende som følge af det utætte udtryk for T7-polymerase. Hans6-Tlp3-LBD overført på polyacrylamid gel med en tilsyneladende molekylevægt af 28 kDa, som er tæt på værdien beregnes fra aminosyresekvens (31,8 kDa). Den hans6-tag fjernelse, affinitet kromatografi og gel filtrering skridt givet meget ren protein (> 90% elektroforese homogenitet).

At bekræfte, at protein fremstillet ved denne procedure blev foldet, sekundær struktur af hans6-Tlp3-LBD blev evalueret af CD spektroskopi. Estimering af α-helix og β-plade indhold fra CD spektrum (figur 3) ved hjælp af CDSSTR gav værdier af 31% α og 23% β. Disse værdier var tæt på dem forudsagt fra Sekvensanalyse ved hjælp af Jpred3 server (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% α og 26% β), der angiver, at protein inddrives fra urinstof-denatureret optagelse organer blev foldet.

Figure 1
Figur 1: skematisk af præsenteret metode. Rekombinant hans6-Tlp3-LBD er expressd i E. coli på induktion med IPTG (Se afsnit 1). Efter 4 h udtryk, bakterieceller er høstet og mængden (Se afsnit 2). Den uopløselige fraktion indeholdende optagelse organer (IB) er vasket for fjernelse af membran og membran proteiner urenheder, hvorefter IB er opløst i en buffer, som indeholder urinstof i høj koncentration (Se afsnit 2). Hans6-Tlp3-LBD er refolded af fortynding i buffer E efterfulgt af udtømmende dialyse for gradvis urinstof fjernelse (afsnit 3). Refolded hans6-Tlp3-LBD er derefter renset af immobiliserede metal ion affinitet kromatografi som beskrevet i afsnit 4. Den hans6-tag er fjernet ved hjælp af TEV protease (afsnit 5). Ukodede Tlp3-LBD er koncentreret og yderligere renset ved gel filtrering kromatografi (afsnit 6). Point til indsamling af prøver til SDS-PAGE analyse angives med *. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: oprensning af rekombinante Tlp3-LBD. (A) størrelse-udelukkelse kromatografi spor af ukodede Tlp3-LBD på en Superdex 200 HiLoad 26/60 gel filtrering kolonne. Protein elueret med en opbevaring volumen på 220 mL. (B) reduceret 15% SDS-PAGE Coomassie blå-farvede gel. M: protein molekylvægt markør; IPTG (-): uninduced kontrolprøve indsamlede i trin 1.3; IPTG (+): opløselige brøkdel efter IPTG induktion (indsamlede i trin 2.3); IB: isolerede optagelse organer (trin 2.13); Refolded hans6-Tlp3-LBD: refolded protein prøve fra trin 4.6; Ukodede Tlp3-LBD: protein prøven opnåede i trin 5.13; Gel filtrering 1 og 2: to brøker fra protein peak elueres af kolonnen gel-filtrering (trin 6.6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: cirkulær dichroism spektrum af renset rekombinante Tlp3-LBD. Spektret blev indspillet ved 25 ° C i 50 mM natriumfosfat pH 7,4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En enkel procedure for udtryk og hvorved man genfolder optagelse ligene af den bakterielle chemoreceptor Tlp3 periplasmic LBD er præsenteret. Forberedelse af ren protein indebærer overdreven udtryk for pET-plasmid-kodede genet i E. coli, rensning og opløsning af inklusion organer, hvorved man genfolder af den denaturerede proteiner og dets rensning af de på hinanden følgende affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi trin. Urea-faciliteret denaturering og fortynding/dialyse-medieret hvorved man genfolder er de kritiske trin i protokollen, optimering hvoraf er ofte nødvendige for at sikre den korrekte genopretning af protein deponeret i inklusion organer26.

Hvorved man genfolder af Tlp3-LBD blev opnået i en to-trins måde, først ved fortynding denatureret prøven i en buffer, som indeholder urinstof, og derefter dialysing prøve mod en buffer det. Refolded protein fremstillet ved hjælp af denne protokol var funktionelle og crystallisable18,23. Den præsenterede metode har imidlertid visse begrænsninger. Det er velkendt, at carbamylation af amino grupper ofte opstår når protein er denatureret og refolded i tilstedeværelse af urea27,28,29. Det er grund, at den opløste urinstof nedbrydes med tiden og producerer cyanate30 det reagerer med proteiner amino grupper til at danne en stabil et karbamyleret produkt og i mindre omfang, med andre funktionelle grupper31, 32. nedbrydning af urea er accelereret under basisk pH og forhøjet temperatur. Så det anbefales at gøre frisk urinstof løsninger fra laves (> 99%) solid reagens, og fremgangsmåde hvorved man genfolder/dialyse ved lav temperatur (4 ° C)30,33, for at mindske cyanate dannelse. Desuden, at vælge den buffer, der indeholder primære aminer, såsom Tris, glycin eller ammoniumbicarbonat for den refolding mix er vigtigt at give scavenging producerede cyanate29,33. Anden mulighed er at bruge guanidin hydrochlorid i stedet for urinstof, som guanidin hydrochlorid ikke er blevet rapporteret til kemisk ændre proteiner.

Urinstof, reduktionsmiddel (DTT eller β-mercaptoethanol) er ofte nødvendigt at solubilize optagelse organer og for at forhindre ikke-hjemmehørende intra- og intermolekylære disulfid obligationer dannelse ved at opretholde cystein restkoncentrationer i deres nedsatte staten26 ,34. Tlp3-LBD har én intramolekylære disulfid obligation, og i denne protokol, 10 mM DTT blev indarbejdet i inklusion organer denaturering buffer (trin 2.10) at støtte ophvirvling af uopløselige protein. DTT koncentration blev derefter nedsat med ~ 100 fold ved fortynding af prøven i det protein, hvorved man genfolder buffer, efterfulgt af trinnet dialyse gradvist fjerne alle DTT. Det er vigtigt at bemærke, at anvendelsen af denne procedure på hvorved man genfolder af proteiner med flere disulfid obligationer kan have brug for optimering af koncentrationen af både oxiderende og Reducerende stoffer (fx oxideret og reduceret glutathion (GSSH/GSH), GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor cystin/cystein) til at fremme ordentlig dannelsen af disulfid broer34,35. Desuden, hvis protein af interesse har uparrede cysteines, der ikke er involveret i disulfid obligation dannelse, en reduktionsmiddel bør føjes til alle rensning buffere. Forudsigelse af de potentielle disulfidbroer fra aminosyresekvensen for et protein kan udføres ved hjælp af flere i siliciummangan værktøjer (f.eks. cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& undergruppe = propt).

Brugen af præsenteres protokollen til rensning af forskellige proteiner sandsynligvis også kræver optimering af koncentrationen af imidazol under trinnet vask 4.4. Som vist i figur 2B (lane mærket IB), de isolerede optagelse organer indeholdt, i denne omgang, overvejende protein af interesse. Hvis yderligere betydelige bands er synlige på SDS side gel i eksemplet IB, øger imidazol koncentrationen i trin 4.4 vil være forpligtet til at fjerne forurenende stoffer, men kan reducere protein udbytte36,37. Anden mulighed er at anvende en lineær gradient imidazol koncentration og pool eluted fraktioner, der indeholder protein af interesse.

Det sidste trin i rensning, størrelse-udelukkelse kromatografi, giver mulighed for at samtidig vurdere de eluted partikler molekylvægt og udlede den oligomere stat af protein. Estimering af molekylvægt af størrelse-udelukkelse kromatografi er imidlertid kun præcis for kugleformede molekyler, der er ikke tilfældet for mange proteiner38,39. Man kan bestemme proteinet molekylmasse og oligomere stat med højere nøjagtighed ved hjælp af størrelse-udelukkelse kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)40 eller analytisk ultracentrifugering41. Vi har tidligere bekræftet, at Tlp3-LBD er monomere i løsning ved hjælp af SEK-MALS analyse23, og dette resultat er i overensstemmelse med rapporterne om andre dCACHE LBDs42,43.

Præsenteres protokollen, har i sin oprindelige eller lidt ændret form, været brugt til refold og rense flere chemoreceptor LBDs fra familien dCACHE for X-ray krystallografiske undersøgelser17,18,19, 23 , 42 , 44. denne procedure kan være generelt nyttige for produktion af milligram mængder af periplasmic LBDs af andre bakterielle chemoreceptors i en opløselig og crystallisable form. I hvert enkelt tilfælde, er protocol optimization sandsynligvis nødvendig. Ud over de punkter, der er diskuteret ovenfor, optimal opløsning af inklusion organer og hvorved man genfolder protein kan kræve brug af detergenter (f.eks. SDS eller N-acetyl trimethyl ammoniumklorid), tilsætningsstoffer (f.eks. L-Arginin) og justering af deres koncentration og inkubering tid i enkelte hvorved man genfolder trin26,34,45,46. Derudover påvirker proteinkoncentration i trinnet refolding væsentligt det refolding udbytte. Rækken af koncentrationer fra 1 ng mL-1 til 10 mg mL-1 bør generelt testes. For Tlp3-LBD var den optimale koncentration af protein i refolding mix 0,2 mL-1.

Ekstremt lav hvorved man genfolder udbytte er normalt et tegn på, at de retssag refolding betingelser er langt fra optimal. Man kan forvente, at højt udbytte er sammenhængende foldet protein, som kan valideres ved hjælp af CD spektroskopi (som beskrevet i denne procedure). Desuden kan crystallisability af den resulterende protein sugguest proteinets foldet tilstand. Alternativt, en funktionel analyse (hvis tilgængelig) kan bruges til at bekræfte, at proteinet er foldet. I forbindelse med Tlp3-LBD, f.eks viste refolded protein sig at bevare dets ligand-bindende evne, som det fremgår af isotermisk kalorimetri. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Yu C. Liu for sit tidlige arbejde med Tlp3-LBD produktion. Mayra A. Machuca står i gæld til lejlighed Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS for et ph.d.-stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).

Tags

Biokemi spørgsmålet 130 Chemotaxis chemoreceptor transducer-lignende protein ligand sensing domæne dCACHE hvorved man genfolder
Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Machuca, M. A., Roujeinikova, A.… More

Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter