Summary
Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.
Abstract
Identificación de ligandos naturales de los quimioreceptores y estudios estructurales dirigidos a la aclaración de las bases moleculares de la especificidad del ligando puede facilitarse grandemente por la producción de cantidades del miligramo de dominios de unión a ligando pura, doblado. Intentos de expresar heterologously dominios de unión a ligando periplasmic de quimioreceptores bacterianos en Escherichia coli (e. coli) a menudo resultan en su focalización en los cuerpos de inclusión. Aquí, se presenta un método para la recuperación de proteínas de cuerpos de inclusión, refolding y purificación, mediante el dominio de enlace de ligando dCACHE periplasmic de Campylobacter jejuni (C. jejuni) quimioreceptor Tlp3 como ejemplo. El enfoque implica la expresión de la proteína de interés con un escindibles sus6-etiqueta, aislamiento y solubilización de urea-mediada de cuerpos de inclusión, refolding por agotamiento de la urea y purificación mediante cromatografía de afinidad, la proteína seguido por cromatografía de retiro y exclusión de tamaño de etiqueta. La espectroscopía de dicroísmo circular se utiliza para confirmar el estado plegado de la proteína pura. Se ha demostrado que este protocolo es generalmente útil para la producción de cantidades del miligramo de dominios de unión a ligando periplasmic dCACHE de otros quimiorreceptores bacterianas en forma soluble y cristalizables.
Introduction
Quimiotaxis y motilidad han demostrado que desempeñan papeles importantes en la patogénesis del jejuni del Campylobacter promoviendo la colonización bacteriana y la invasión de los host1,2,3. Quimiotaxis permite que las bacterias lograr un ambiente óptimo para el crecimiento, como guiados por señales químicas. Este proceso implica el reconocimiento de señales químicas intracelulares y ambientales por un conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptores o transductor-como proteínas (Tlps). La mayoría quimioreceptores son proteínas embebido en la membrana con un extracytoplasmic ligando vinculante dominio (LBD), un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico de señalización, que interactúa con las proteínas de señalización citosólicas que transmiten la señal los motores flagelares4,5,6,7.
Once quimioreceptores diferentes se han identificado en el genoma de C. jejuni 4,8. Hasta la fecha, sólo algunos de estos quimioreceptores han sido caracterizados y se sabe la especificidad del ligando de Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712y Tlp1113 . Identificación de ligandos naturales de los quimioreceptores restantes en esta especie y numerosos Quimioreceptores en otras bacterias, puede facilitarse grandemente por la producción de plegado y altamente puro recombinante quimioreceptor LBDs14, 15 , 16. sin embargo, los intentos de expresar heterologously periplasmic LBDs de quimioreceptores bacterianos en Escherichia coli a menudo resultan en su focalización en los cuerpos de inclusión17,18,19 . Sin embargo, este fenómeno puede facilitar la fácil aislamiento y recuperación de la proteína en la mano. Aquí, se presenta un método para recuperación de proteína de cuerpos de inclusión, refolding y purificación, con el LBD periplasmic de la C. jejuni quimioreceptor Tlp3 como ejemplo. Este ejemplo fue elegido porque Tlp3-LBD pertenece a la familia de dCACHE20 de dominios de detección que se encuentran abundantemente en dos componentes histidina quinasas y quimiorreceptores en procariotas20,21, 22 , 23.
En este enfoque, la construcción de la expresión, basada en un vector de pET151/D-TOPO, ha sido diseñada para incorporar un N-terminal su6-etiqueta seguida de un tabaco etch virus (TEV) proteasa escote sitio para etiqueta posterior retiro19. El protocolo describe la sobreexpresión de la proteína en e. coli, el aislamiento y la urea mediada la solubilización de los cuerpos de inclusión y la proteína refolding por agotamiento de la urea. Después refolding, la muestra se purifica mediante cromatografía de afinidad, con cromatografía de retiro y exclusión de tamaño de etiqueta opcional. El estado plegado de la proteína purificada se confirma mediante espectroscopía de dicroísmo circular. Esta es una versión modificada del método que se ha desarrollado anteriormente para recuperar y purificar el LBD de un quimioreceptor diferentes, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimiento, resumido en la figura 1, rinde 10 a 20 mg de puro, sin etiquetar Tlp3-LBD por 1 L de cultivo bacteriano, con una pureza de la proteína de > 90% estimados por SDS-PAGE.
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Protocol
1. expresión de su6-Tlp3-LBD en e. coli
- Sembrar 150 mL de caldo Luria-Bertani (LB) estéril que contenga 50 ampicilina de μg mL-1 con el Plus de codón BL21 (DE3) - células RIPL transformadas con el vector de pET151/D-TOPO para la expresión de su6- Tlp3-LBD (residuos del aminoácido 42-291), y incubarlo a 37 ° C en un agitador (diámetro de la órbita, 25 mm) con 200 rpm durante la noche.
- Preparar seis matraces de Erlenmeyer de 2 L que contenga 800 mL de caldo LB estéril y la 50 μg mL-1 ampicilina. Inocular cada frasco con 20 mL del cultivo durante la noche obtenida en el paso 1.1. Incúbelos a 37 ° C con agitación continua a 200 rpm hasta la densidad óptica a 600 nm alcanza 0,6.
- Tomar 1 mL alícuota de uno de los matraces (muestra de control uninduced), utilizando una centrífuga de sobremesa (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) de la pelotilla y descarte el sobrenadante. Almacenar el pellet bacteriano a-20 ° C para posterior análisis de SDS-PAGE.
- Inducen la expresión de proteínas mediante la adición de 1 mM de β-D-thiogalactoside del isopropyl (IPTG) en cada matraz con cultura. Continuar la incubación de los frascos a 37 º C en un agitador a 200 rpm durante una 4 horas adicionales.
- La cosecha de las células por centrifugación a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
Nota: en este punto, el procedimiento se puede pausarse colocando el precipitado de células en un congelador de-80 ° C para el almacenamiento.
2. aislamiento y desnaturalización de cuerpos de inclusión
- Transferir todos los pellets de células obtenidos en el paso 1.5 a un vaso de precipitados de 250 mL y añadir 100 mL de tampón A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Permitir que las células se descongele totalmente (si es congelado) y resuspender el precipitado. Mantener la muestra en hielo a menos que se indique lo contrario.
- Pasar las células resuspendidas a través de un homogeneizador de alta presión tres veces para lyse las células y asegurar el corte completo de la DNA genomic.
- Centrifugue el lisado a 10.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Recoger una muestra de 1 mL del sobrenadante (fracción soluble) y almacenar a-20 ° C para posterior análisis de SDS-PAGE. Desechar el resto del sobrenadante y colocar el sedimento en el hielo.
Nota: Este pelotilla es color blanca (fácilmente distinguibles de las células intactas que son la sombra de brown en color) y contiene los cuerpos de inclusión. - Resuspender el precipitado de cuerpos de inclusión completamente en 20 mL de tampón helada B (pH de 10 mM Tris-HCl 8.0, fluoruro de phenylmethanesulfonyl de 0,2 mM (PMSF), de 1% Tritón X-100). Esto facilita la solubilización de la membrana y proteínas de la membrana. Vortex durante 1-2 min facilitar la resuspensión.
- Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 15 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado completamente en 20 mL de tampón helada B con un vórtex el tubo durante 1-2 min Asegúrese de que la pastilla se rompe en pequeños pedazos. Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo para facilitar la resuspensión del sedimento.
Nota: Es importante Resuspender el precipitado a fin de obtener cuerpos de inclusión libres de impurezas. - Repita el paso 2.5. Si el sobrenadante es turbio o de color, repita los pasos del 2.6 y 2.5 (en ese orden) hasta que el sobrenadante es claro e incoloro.
- Resuspender el precipitado en 20 mL de tampón helada C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) con un vórtex el tubo durante 1-2 minutos.
- Repita el paso 2.5.
- Añadir 25 mL de tampón de desnaturalización helado D (pH 8.0, urea de 8 M, de la 10 mM Tris-HCl 10 mM Ditiotreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) para disolver el precipitado de cuerpos de inclusión. Resuspender bien todo con un vórtex durante 1-2 min., o hasta que la pastilla se rompe en pequeños pedazos.
- La suspensión de la mezcla por rotación con una velocidad de rotación de 30 rpm durante 30-120 min a 4 ° C.
- Clarificar la solución de la proteína desnaturalizada por centrifugación a 30.000 x g, 4 ° C por 30 minutos, colocar el sobrenadante en el hielo y descartar el precipitado.
- Medir la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford. 24 tomar una alícuota para el análisis de gel de la SDS y coloque a-20 ° C.
Nota: en este punto, el procedimiento puede hacer una pausa por la muestra alícuotas snap-congelación en nitrógeno líquido y mantenerlo a-80 ° C para el almacenamiento.
3. proteína Refolding
- Preparar 250 mL de tampón de E (3 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0, 4 M Monoclorhidrato de L-arginina, L-Glutatión 20 mM reducido, 2 L-Glutatión oxidado mM) en un vaso de precipitados de 500 mL y enfriar el buffer hasta 4 ° C.
- Añadir 60 mg de la mezcla de la proteína desnaturalizada que contiene su6-Tlp3-LBD obtenidos en paso 2.13 a 250 mL de buffer E, agitando el búfer a 500 rpm. Incubar la mezcla repliegue a 4 ° C con agitación continua a 500 rpm por 24-48 h. La concentración final de proteína en este paso es 0,2 mg mL-1.
- Preparar 7 L de tampón A en un cubo de 8-10 L y enfriar a 4 ° C en la preparación para el siguiente paso (paso 3.4) que se llevará a cabo en 24-48 h (véase el diagrama de flujo en la figura 1).
- Sumergir un pedazo de 50 cm de tubo de diálisis de 28 mm de diámetro inflado, con peso molecular de corte de 12-14 kDa en 200 mL de sal de disodio del ácido etilendiaminotetracético 10 mM (EDTA-Na2) y caliente sobre una llama de gas hasta que hierva. Enjuagar la membrana de diálisis con 200 mL de ddH2O.
- Sujete un extremo de la membrana de diálisis con un cierre de tubos de diálisis y transferir 250 mL refolding mezcla obtenida en el paso 3.2 en el tubo de diálisis. Cerrar el extremo abierto con otra abrazadera. Comprobar la integridad de la membrana para asegurar que no haya fugas.
- Coloque el tubo de diálisis en un cubo de diálisis con el pre-enfriado 7 L del tampón preparado en el paso 3.3. Coloque un revolvimiento magnético bar, asegurando que no va a tocar el tubo de diálisis mientras que revuelve.
- Dialyse la muestra a 4 ° C con continua agitación a 500 rpm y cambiar el tampón por lo menos cuatro veces durante un período de 12 h. Después del último cambio de tampón, dejo la muestra para dialyse durante la noche.
Nota: Durante la diálisis, el exceso de urea (3 M) poco a poco se quita de la solución de la proteína desnaturalizada, que permite que la proteína a voltear. Precipitación de proteínas pesadas puede observarse al final de la diálisis. - Quite el tubo de diálisis de la cubeta y transferir su contenido a un vaso de precipitados de 500 mL. Mantener la solución de la proteína en el hielo, a menos que se indique lo contrario.
- Filtrar la solución de la proteína a través de una membrana de tamaño de poro de 0.43 μm en una botella de vidrio de 500 mL para eliminar cualquier proteína precipitada.
4. purificación de su6-etiquetado de proteínas mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados
-
Cargar y equilibrar una columna quelantes preenvasados de 5 mL.
- Conecte la columna a una bomba peristáltica, asegurando que hay no hay aire atrapado en las tuberías de conexión.
- Lavar la columna al pasar por 25-50 mL de ddH2O.
- La columna de la carga por carga 3 mL de 0.1 M NiCl2 y pasando a través de 25 mL de ddH2O.
- Equilibrar la columna con 25 mL de tampón F (buffer de carga, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazol 20 mM).
- Ajustar la muestra de proteína replegado obtenida en el paso 3.9 a la composición del tampón F añadir 2,5 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL de 5 M NaCl y 2,5 mL de 2 M soluciones imidazol.
- Cargar la muestra en la columna a una velocidad de 5 mL/min o menos y desechar el flujo a través (proteínas no Unidas).
- Lavar la columna con 50-100 mL de buffer F no específicamente proteínas de retirar y desechar el flujo a través.
- Fin de eluir su6-Tlp3-LBD con 25 mL de tampón G (tampón de elución, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, imidazol de 500 mM) y las fracciones de flujo que contiene la proteína (como determinar usando el reactivo de Bradford).
- Medir la concentración de proteína en la muestra combinada usando el ensayo de Bradford. Tomar una pequeña alícuota para análisis de SDS-PAGE y a-20 ° C.
5.6-etiqueta la eliminación usando proteasa TEV (opcional)
- Preparar y enfriar a 4 ° C, 4 L de tampón H (buffer de escote TEV, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) de glicerol, 2 mM DTT).
- Corte de aproximadamente 5-7 cm del tubo de diálisis (diámetro 2-3 cm) y sumergirlo en 200 mL de ddH2O.
- Añadir su6-tagged proteasa TEV del6-proteína etiqueta preparado en el paso 4.5 con una relación molar final 1 TEV: proteínas 8.
- Sujete un extremo de la tubería con un cierre de tubos de diálisis y llenarlo con la mezcla de proteasa proteína/TEV. Cierre el otro extremo y garantizar que no haya fugas.
- La diálisis tubo en el pre-enfriado 4 L de tampón H (desde el paso 5.1) e incube a 4 ° C con continua revolviendo durante 2 h. cambio el búfer y siguen diálisis durante la noche para permitir la reacción mediada por la TEV escote completar.
- Mientras tanto, preparar y enfriar (4 ° C) 4 L de tampón te (pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) de glicerol de 10 mM Tris-HCl) en preparación para el día siguiente.
- Después de la diálisis durante la noche, cambiar el tampón buffer que preparado en el paso 5.6 y dialyse para un más 1-2 h a 4 ° C.
- Retire el tubo de la cubeta de la diálisis, desconectar un extremo del tubo y transferir la solución de proteína a un tubo Falcon de 50 mL. Filtrar la solución a través de un filtro de la jeringuilla del tamaño del poro de 0.43 μm y mantenerlo en hielo, a menos que se indique lo contrario.
- Medir el volumen de la muestra y ajustar la concentración a la composición del tampón F Tris, NaCl e imidazol (p. ej. para 25 mL de solución de proteína en buffer J agregar 0,25 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL de 5 M NaCl y 0,25 mL de 2 M imidazol).
- Preparar una columna HiTrap quelantes HP de 5 mL como se describe en el paso 4.1.
- La muestra en la columna de carga (tasa de flujo: 5 mL/min) y recoger el flujo a través, que contiene el Tlp3-LBD sin etiquetar (residuos 42-291). Proteína uncleaved, el hendido su6-etiqueta y su6- TEV son retenidas por la columna.
- Lavar la columna con 5 mL de tampón de F (tampón de carga) para permitir a todos sin etiquetar proteína fluya a través y recoger el eluido.
- El efluente obtenido en pasos 5.11 y 5.12 y medir la concentración de proteína. Tomar una pequeña alícuota y almacenar a-20 ° C para el análisis de SDS-PAGE.
6. cromatografía exclusión de tamaño (filtración de Gel) de Tlp3-LBD
- Preparar 1 L de tampón A (pH 8.0, 150 mM NaCl de 10 mM Tris-HCl) y filtrarla con una membrana de 0.43 μm.
- Equilibrar una columna de exclusión de tamaño 26/60 con el almacenador intermediario A en un caudal de 4 mL/min.
- Concentrar la muestra de proteína obtenida en el paso 5.13 a un volumen de 3 a 4 mL con concentrador centrífugo 15 mL 10 corte kDa (4 ° C, 4.000 x g).
- Clarificar la solución de la proteína por centrifugación a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min eliminar cualquier proteína precipitada.
- Cargar la muestra en la columna de filtración de gel 26/60 previamente equilibrado. Realizar la cromatografía en tampón A en un caudal de 4 mL/min Monitor el rastro de la UV. Tlp3-LBD elutes en un volumen de retención de 210-220 mL. Las fracciones de pico de la piscina.
- Medir la concentración de proteína. Tomar una pequeña alícuota para análisis de SDS-PAGE.
7. SDS-PAGE de análisis de las muestras tomadas en diferentes etapas de purificación de proteínas
- Preparar 1 L de tampón de correr de SDS-PAGE (tampón de J), que contiene 25 mM Tris, 250 mM glicina pH 8,3 y 0.1% (p/v) sodio dodecil sulfato (SDS).
- Preparar 10 mL de 5 x buffer de carga SDS-PAGE (tampón de K), que contiene 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) de glicerol, 1 mM TDT y 0.05% bromofenol azul.
- Permiten las alícuotas recogidas durante las diferentes etapas de la purificación (pasos 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) para descongelar.
- Para cada muestra, mezclar el volumen correspondiente a 15 μg de proteína total con 2 μl de 5 x del cargamento SDS-PAGE del almacenador intermediario y ajusta el volumen a 10 μl con ddH2O.
- Calentar las muestras a 95 ° C durante 5-10 min., centrifugado a 10.000 x g por 30 s y la transferencia de las muestras en un tubo limpio.
- Preparar un gel de SDS-PAGE, con gel separador de poliacrilamida 15% (por 5 mL: 2,5 mL 30% (p/v) bis-acrilamida, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1,2 mL ddH2O, 50 μl de 10% (p/v) de SDS, 50 μl 20% (p/v) del persulfato del amonio (APS), 3 μl tetramethylethylenediamine (TEMED) y 5% de poliacrilamida gel de apilamiento (de 2 mL: 340 μL 30% (p/v) bis-acrilamida, 250 μL 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL ddH2O, 20 μl de 10% (p/v) de SDS, 20 μl 20% (p/v) APS, 2 μl de TEMED).
- Montar el aparato de electroforesis y llenar con 1 x SDS page funcionamiento tampón según recomendación del fabricante.
- Carga un marcador de peso molecular de la proteína y las muestras preparadas en paso 7.5. Realizar la electroforesis en una constante corriente de 25 mA.
- Transferir el gel a un recipiente y enjuague con ddH2O. Añadir 150 mL de azul de Coomassie coloración de la solución que contiene isopropanol al 25% (v/v), ácido acético al 10% (v/v) y 0.03% (p/v) azul brillante R-250. Coloque el recipiente sobre una plataforma horizontal de la rotación durante 30 min a temperatura ambiente.
- Enjuagar el gel con ddH2O y colocar en la solución de extracción que contiene 5% (v/v) de metanol y 7% (v/v) de ácido acético. Desteñir mientras se mezcla con una plataforma horizontal de la rotación durante 1 hora.
- El gel de la imagen y analizar.
8. circular dicroísmo (CD) espectroscopia análisis de estructura secundaria de proteínas pura replegado
- Transferencia de 0.5 - 1 mg de proteína replegada obtenida en el paso 6.6 en un tubo de diálisis y colóquelo en un balde de diálisis que contiene 5 L de tampón L (50 mM fosfato de sodio pH 7.4) preenfriado a 4 ° C. Dialyse la muestra a 4 ° C con agitación continua y realizar cambios de tampón por lo menos 3-4 más 2-4 h antes de salir de la muestra para dialyse durante la noche.
- Concentrar la solución de diálisis debido a la proteína a 0,06 mg mL-1 utilizando un concentrador centrífugo de corte de 10 kDa.
- Clarificar la solución por centrifugación a 13.000 x g, 4 ° C por 30 minutos.
- Registrar el espectro de CD lejos-UV de la muestra a 25 ° C en un rango de longitud de onda de 200-260 nm usando un spectropolarimeter con una frecuencia de barrido de 20 nm min-1. Utilizar el buffer de diálisis como un control en blanco. Repita la grabación en triplicado y generar el espectro promedio.
- Calcular el contenido de estructura secundaria por deconvoluting el CD usando el programa CDSSTR de la DichroWeb los espectros sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
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Representative Results
Expresión recombinante de su6-Tlp3-LBD en e. coli dio lugar a la deposición de la proteína en los cuerpos de inclusión. El rendimiento de la expresión de 1 L de cultivo bacteriano calculado en el paso 2.13 fue de aproximadamente 100 mg de su6-Tlp3-LBD depositado en cuerpos de inclusión. El procedimiento de aislamiento de proteínas, aquí descrito e ilustrado en la figura 1, consiste en la solubilización de los cuerpos de inclusión, refolding de la proteína y purificación mediante cromatografía de afinidad, eliminación de etiquetas y cromatografía por exclusión de tamaño y rendimientos de 10 a 20 mg de puro, sin etiquetar Tlp3-LBD por 1 L de cultivo bacteriano.
La proteína eluida de la columna de gel filtración como un pico solo, simétrico correspondiente a un volumen de retención de 220 mL (figura 2A). Cálculo del peso molecular (MW) utilizando un diagrama de calibración del registro (MW) versus volumen de retención (Vretención (mL) = 549.3 73,9 x log(MW)) disponible en el sitio de expresión de la proteína de EMBL e instalaciones centrales para purificación (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), dado el valor de 29 kDa. Este valor fue muy cercana a la calculada a partir de la secuencia del aminoácido (28,7 kDa), que sugirió eso Tlp3-LBD es un monómero en la solución.
Para evaluar el proceso de purificación, las muestras recogidas en diferentes etapas se evaluaron mediante análisis de SDS-PAGE. Como se muestra en la figura 2B, cuerpos de inclusión contienen predominantemente su6-Tlp3-LBD. Pequeñas cantidades de esta proteína también estuvieron presentes en la fracción soluble de la cultura inducida (IPTG(+)) y en la cultura uninduced (IPTG(-)) – al parecer como resultado de la expresión agujereada de la polimerasa de T7. Su6-Tlp3-LBD migra en el gel de poliacrilamida con un peso molecular aparente de 28 kDa, que es cercano al valor calculado de la secuencia de aminoácidos (31.8 kDa). El su6-extracción, cromatografía de afinidad de la etiqueta y gel pasos de filtración producidos proteína altamente pura (> 90% homogeneidad electroforética).
Para confirmar que la proteína obtenida por este procedimiento fue doblado, la estructura secundaria de su6-Tlp3-LBD se evaluó por la espectroscopia de CD. Estimación de la α-hélice y β-hoja de contenido del espectro de CD (figura 3) con CDSSTR dieron valores de β α y un 23% 31%. Estos valores fueron cercanos a los previsto a partir del análisis de secuencia utilizando el servidor de Jpred3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% α y 26% β), que indica que la proteína se recuperó de los cuerpos de inclusión de urea desnaturalizado fue doblada.
Figura 1: esquema del método presentado. Recombinante su6-Tlp3-LBD es expressd en e. coli a inducción con IPTG (véase sección 1). Después de la expresión de 4 h, las células bacterianas son cosechadas y lisis (véase sección 2). La fracción insoluble que contiene los cuerpos de inclusión (IB) se lava para la eliminación de la membrana y las impurezas de proteínas de membrana, después de que el IB se disuelven en un tampón que contiene urea en alta concentración (véase sección 2). Su6-Tlp3-LBD es replegado por dilución en búfer E seguida de diálisis exhaustiva para la eliminación gradual de la urea (sección 3). Replegado su6-Tlp3-LBD luego se purifica mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados como se describe en la sección 4. El su6-etiqueta se quita usando proteasa TEV (sección 5). Tlp3-LBD sin etiquetar es concentrado y más purificado por cromatografía de gel filtración (sección 6). Puntos de recogida de muestras para análisis de SDS-PAGE se indican con *. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: purificación de recombinante Tlp3-LBD. (A) rastro de cromatografía de exclusión de tamaño de Tlp3-LBD sin etiquetar en una columna de filtración de gel Superdex 200 HiLoad 26/60. La proteína eluida con un volumen de retención de 220 mL. (B) reducido 15% teñidos de azul de Coomassie de SDS-PAGE gel. M: marcador de peso molecular de proteína; IPTG (-): muestra de uninduced de control recogidos en el paso 1.3; IPTG (+): fracción soluble después de la inducción de IPTG (recopilada en el paso 2.3); IB: cuerpos de inclusión aislados (paso 2.13); Replegado su6-Tlp3-LBD: muestra de proteína replegado desde el paso 4.6; Sin etiquetar Tlp3-LBD: muestra de proteína obtenida en el paso 5.13; Gel filtración 1 y 2: dos fracciones del proteína pico eluida de la columna de gel filtración (paso 6.6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: espectro de dicroísmo Circular de purificados recombinante Tlp3-LBD. El espectro se registró a 25 ° C en 50 mM de fosfato de sodio pH 7.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se presenta un procedimiento sencillo para la expresión y refolding de cuerpos de inclusión de la LBD periplasmic del quimioreceptor bacteriana Tlp3. Preparación de la proteína pura implica la sobre expresión del gen pET plasmídico de e. coli, la purificación y la solubilización de los cuerpos de inclusión, refolding de la proteína desnaturalizada y su purificación por afinidad consecutiva y pasos de cromatografía por exclusión de tamaño. La desnaturalización facilitado por urea y dilución/diálisis-mediada refolding son los pasos críticos en el protocolo de optimización que a menudo es necesaria para asegurar la correcta renaturalización de la proteína que se deposita en los cuerpos de inclusión26.
Refolding de Tlp3-LBD se logró en forma de dos pasos, primero diluyendo la muestra desnaturalizada en un búfer que contiene urea y luego por dialysing la muestra contra un tampón desprovisto de él. La proteína replegada obtenida utilizando este protocolo era funcional y cristalizables18,23. Sin embargo, el método presentado tiene algunas limitaciones. Es bien sabido que carbamylation de grupos amino a menudo ocurre cuando la proteína es desnaturalizada y replegada en presencia de urea27,28,29. Esto es debido a que la urea disuelta se descompone con el tiempo y produce cianato30 que reacciona con los grupos amino de la proteína para formar un producto carbamylated estable y, en menor medida, con otros grupos funcionales31, 32. se acelera la descomposición de urea en condiciones de pH alcalino y temperatura elevada. Por lo tanto, se recomienda hacer soluciones frescas urea de alta pureza (> 99%) reactivos sólidos y realizar los pasos de la diálisis refolding a baja temperatura (4 ° C)30,33, para disminuir la formación de cianato. Por otra parte, elegir el tampón que contiene aminas primarias, tales como Tris, glicina o bicarbonato de amonio, de la mezcla de repliegue es importante para permitir la compactación de la cianato producido29,33. Otra opción es utilizar clorhidrato de la guanidina en lugar de urea, como clorhidrato de la guanidina no se ha divulgado para modificar químicamente proteínas.
Además de urea, un agente de reducción (TDT o β-mercaptoetanol) es a menudo necesaria para solubilizar los cuerpos de inclusión y evitar no nativos intra - e intermolecular disulfuro de bonos de formación manteniendo los residuos de cisteína en su estado reducido26 ,34. Tlp3-LBD tiene un enlace de disulfuro intramolecular y en el presente Protocolo, 10 mM DTT fue incorporado en el búfer de desnaturalización de los cuerpos de inclusión (paso 2.10) para facilitar la resuspensión de la proteína insoluble. Concentración de TDT se redujo entonces ~ 100 veces diluyendo la muestra en la proteína refolding buffer, seguido por el paso de la diálisis para eliminar gradualmente todos TDT. Es importante señalar que la aplicación de este procedimiento el refolding de proteínas con múltiples enlaces disulfuro de la necesidad de optimización de la concentración de oxidantes y agentes reductores(oxidada y reducida glutatión (GSSH/GSH), GSSH/DTT, cistamina/cysteamineor cistina/cisteína) promover la adecuada formación del disulfuro puentes34,35. Además, si la proteína del interés ha desapareado cisteínas que no participan en la formación del enlace de disulfuro, un agente reductor se debe agregar a todos los búferes de purificación. Predicción de los posibles puentes de disulfuro de la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede realizar varias en silico herramientas (por ejemplo, cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& subgrupo = propt).
También es probable que requieren optimización de la concentración de imidazol en la etapa de lavado 4.4 el uso del protocolo presentado para la purificación de proteínas diferentes. Como se muestra en la figura 2B (carril etiquetado IB), los cuerpos de inclusión aislados contenidas, en este caso, principalmente la proteína de interés. Si las bandas significativas adicionales están visibles en SDS PAGE gel de la muestra de IB, aumento de la concentración de imidazol en paso 4.4 será necesaria para eliminar los contaminantes, pero podría reducir la proteína rendimiento36,37. Otra opción es aplicar un degradado lineal de la concentración de imidazol y piscina las fracciones eluídas que contienen la proteína de interés.
El último paso en la purificación, cromatografía por exclusión de tamaño, proporciona los medios para estimar la masa molecular de las partículas eluídas y derivar el estado oligomérico de la proteína al mismo tiempo. Sin embargo, estimación de la masa molecular por cromatografía por exclusión de tamaño sólo es exacta para moléculas esféricas, lo que no es el caso de muchas proteínas38,39. Uno puede determinar la proteína de masa molecular y estado oligomérico con mayor precisión mediante el uso de cromatografía por exclusión de tamaño junto a la dispersión de la luz de múltiples ángulos (SEC-MALS)40 o41de Ultracentrifugación analítica. Previamente hemos confirmado que Tlp3-LBD es monomérica en solución mediante el uso de seg-MALS análisis23, y este resultado es consistente con los informes sobre otros dCACHE LBDs42,43.
El protocolo presentado, en su forma original o ligeramente modificado, se ha utilizado para doblar y purificar varios LBDs quimiorreceptor de la familia de dCACHE para rayos x estudios cristalográficos17,18,19, 23 , 42 , 44. este procedimiento puede ser generalmente útil para la producción de cantidades del miligramo de periplasmic LBDs de otros quimiorreceptores bacterianas en forma soluble y cristalizables. En cada caso separado, optimización de protocolo es probablemente necesario. Además de los puntos tratados anteriormente, óptima solubilización de los cuerpos de inclusión y refolding de la proteína puede requerir el uso de detergentes (por ejemplo SDS o N-acetil trimetil cloruro de amonio), aditivos (por ejemplo, L-arginina) y ajuste de su tiempo de concentración y de incubación en individuo refolding pasos26,34,45,46. Además, la concentración de proteína en el repliegue paso afecta significativamente el rendimiento de repliegue. Generalmente debe ser evaluado el rango de concentraciones de 1 ng mL-1 a 10 mg mL-1 . Para Tlp3-LBD, la concentración óptima de proteína en la mezcla de repliegue fue 0,2 mg mL-1.
Muy bajo rendimiento repliegue es generalmente una señal de que las condiciones de repliegue juicio distan mucho de ser óptima. Se puede esperar que el alto rendimiento es consistente con una proteína plegada, que se puede validar mediante el uso de la espectroscopia del CD (como se describe en este procedimiento). Además, crystallisability de la proteína resultante puede sugguest estado plegado de la proteína. Alternativamente, puede utilizarse un análisis funcional (si está disponible) para confirmar que la proteína se pliega. En el caso de Tlp3-LBD, por ejemplo, la proteína replegada fue demostrada para mantener su capacidad de unión a ligando, como se muestra por calorimetría isotérmica. 23
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias por sus primeros trabajos en la producción de LBD Tlp3 Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está en deuda con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS Beca doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
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