Summary
프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.
Abstract
Chemoreceptors와 겨냥 한 ligand 특이성의 분자 기준의 구조 연구의 자연 ligands의 밀리 그램 양의 순수 하 고, 접힌 ligand 바인딩 도메인의 생산에 의해 크게 촉진 수 있습니다. Heterologously의 대장균 (대장균) 박테리아 chemoreceptors periplasmic ligand 바인딩 도메인을 자주 표현 하려고 포함 시체에 그들의 타겟팅에 발생. 여기, 메서드 포함 시체, refolding와 정화, Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3의 periplasmic dCACHE ligand 바인딩 도메인을 사용 하 여 예를 들어에서 단백질 복구를 위해 제공 됩니다. 접근 포함를 쪼갤와 관심사의 단백질의 표현을 그의6-태그, 격리 및 요소 중재 solubilisation 포함 시체, 친화성 크로마토그래피에 의하여 요소 고갈, 그리고 정화에 의해 refolding 단백질 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 따라. 원형이 색 성 분광학은 순수 단백질의 접힌된 상태를 확인 하는 데 사용 됩니다. 그것은이 프로토콜은 일반적으로 밀리 그램 양의 dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인의 가용성과 crystallisable 형태로 다른 세균성 chemoreceptors의 생산 하는 데 유용 증명 되었습니다.
Introduction
Chemotaxis 및 운동 성 세균성 식민 및 호스트1,2,3의 내 습을 홍보 함으로써 Campylobacter jejuni 병 인에 중요 한 역할을 보여왔다. 화학 신호에 의해 유도 chemotaxis 박테리아를 성장 위한 최적의 환경으로 이동할 수 있습니다. 이 프로세스는 불린다 chemoreceptors, 단백질 또는 트랜스듀서와 같은 단백질 (Tlps)의 집합에 의해 세포내 및 환경 화학 신호의 인식 포함 됩니다. 대부분 chemoreceptors는 바인딩 도메인 (LBD), 막 횡단 도메인 및 세포질 신호 도메인, 후자는 신호를 전송 하는 신호 cytosolic 단백질 상호 작용 하는 extracytoplasmic ligand 단백질 막 포함 하는 flagellar 모터4,5,,67.
11 다른 chemoreceptors C. jejuni 게놈4,8에서 확인 되었습니다. 날짜 하려면, 이러한 chemoreceptors의 일부 특징 되어 있다 그리고 Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, Tlp1113 의 리간드 특이 알려져 있다. 이 종에서 나머지 chemoreceptors 그리고 다른 박테리아에 수많은 chemoreceptors의 자연 ligands의 접힌 및 매우 순수한 재조합 chemoreceptor LBDs14, 의 생산에 의해 크게 촉진 될 수 있다 15 , 그러나 16., heterologously 대장균 세균성 chemoreceptors의 periplasmic LBDs를 자주 표현 하려고 포함 시체17,18,19로 그들의 대상으로 발생 . 그럼에도 불구 하 고,이 현상을 수 용이 하 게 쉬운 격리 및 복구 단백질의 손에. 여기, 메서드 포함 시체에서 단백질 복구, refolding와 정화, 예를 들어 periplasmic LBD의 C. jejuni chemoreceptor Tlp3 사용 하 여 제공 됩니다. 이 예제에서는 Tlp3 LBD 풍부 하 게 2 분 히스티딘 kinases와 원핵생물20,21, chemoreceptors에 있는 감지 영역의 dCACHE 가족20 에 속하기 때문에 선정 되었다 22 , 23.
이 방법에서는, pET151/D-이동 벡터에 따라 식 구문 통합 N 맨끝 그의6설계 되었습니다-태그 뒤에 담배 엣지 후속 태그 제거19에 대 한 바이러스 (TEV) 효소 분열 사이트. 프로토콜은 단백질 overexpression을 대장균, 격리 및 포함 몸과 요소 고갈에 의해 refolding 단백질의 solubilisation 중재 하는 요소에 설명 합니다. Refolding, 다음 샘플은 선택적 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하 고 있다. 순화 된 단백질의 접힌된 상태는 원형이 색 성 분광학을 사용 하 여 확인 됩니다. 이것은 이전 복구 하 고 다른 chemoreceptor, 헬리코박터 파일로리 TlpC19의 LBD 정화 개발 된 방법의 수정 된 버전. 이 절차는 그림 1에서 요약의 단백질 순수성을 가진 세균성 문화의 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 10-20 밀리 그램 생성 > 90 %SDS 페이지 예상된.
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Protocol
1. 표현의 그의6-Tlp3- 대장균 에 LBD
- 50 µ g mL-1 암 피 실린 BL21 Codon 플러스 (DE3)를 포함 하는 메 마른 Luria Bertani (파운드) 국물의 150 mL 접종-RIPL 셀 그의6의 표현에 대 한 pET151/D-이동 벡터와 변형-Tlp3-LBD (아미노산 잔류물 42-291), 그리고 품 어 그것 통 (궤도 직경, 25 m m)에 37 ° C에서 200 rpm으로 하룻밤.
- 포함 하는 살 균 파운드 국물과 50 µ g mL-1 암 피 실린의 800 mL 6 2 L 삼각 플라스 크를 준비 합니다. 야간 문화 단계 1.1에서에서 얻은 20 mL와 함께 각 플라스 크 예방 600 nm에 도달 0.6에서 광학 밀도까지 200 rpm에서 연속 떨고와 37 ° C에서 그들을 품 어.
- 1 mL aliquot 펠 릿 벤치탑 원심 분리기 (13000 x g, 4 ° C, 10 분)를 사용 하 여 플라스 크 (uninduced 컨트롤 샘플) 중 하나에서 고는 상쾌한 삭제. 이후 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 세균성 펠 릿을 저장 합니다.
- 1mm 이소프로필 β-D-thiogalactoside (IPTG)의 문화 각 플라스 크에 추가 하 여 단백질 발현을 유도. 추가 4 h 200 rpm에서 통에 37 ° C에서 플라스 크 배양을 계속 한다.
- 4 ° C에서 15 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 하 고는 상쾌한 삭제.
참고:이 시점에서 절차 수 있습니다 수 일시 중지-80 ° C 냉장고 저장용으로 셀 펠 릿을 배치 하 여.
2. 절연 및 포함 시체의 변성
- 250 mL 비 커에 1.5 단계에서 얻은 하는 모든 셀 펠 릿 전송 및 버퍼 A의 100 mL (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl) 추가. 완전히 (경우 냉동) 해 동, 세포를 허용 하 고 resuspend는 펠 릿. 달리 명시 되지 않는 한 얼음 샘플을 유지.
- 세 번 하는 세포를 lyse genomic DNA의 완전 한 전단 고압 균질 화를 통해 resuspended 세포를 전달 합니다.
- 4 ° c.에 15 분 동안 10000 x g에서 lysate 원심 상쾌한 (녹는 분수)의 1 mL 샘플을 수집 하 고 후속 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 그것을 저장. 상쾌한의 나머지를 취소 하 고 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
참고:이 펠 릿은 색상에 흰색 (손상 되지 않은 세포는 갈색의 그늘에서 쉽게 구별할 수 색에) 포함 시체를 포함. - 철저 하 게 20 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 B에에서 포함 시체 펠 릿 resuspend (10 mM Tris HCl pH 8.0, 0.2 m m phenylmethanesulfonyl 불 (PMSF), 1% 트라이 톤 X-100). 이 용이 막 및 막 단백질의 solubilisation. 1-2 분 물의 resuspension 원조 소용돌이.
- 원심에서 4 ° C에서 15 분 동안 10000 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
- Vortexing 1-2 분 펠 릿 작은 조각으로 나누어져 확인에 대 한 튜브에 의해 철저 하 게 20 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 B에에서 펠 릿을 resuspend. 피펫으로 물의 resuspension 펠 릿을 아래로 샘플.
참고: 그것은 불순물에서 무료 포함 시체를 철저 하 게 펠 릿을 resuspend 하는 것이 중요입니다. - 2.5 단계를 반복 합니다. 인지는 상쾌한 흐린 색의 반복 단계 2.6 2.5 (순서 대로)는 상쾌한까지 명확 하 고 무색입니다.
- Vortexing 1-2 분에 대 한 튜브에 의해 (10 mM Tris HCl pH 8.0 0.2 밀리미터 PMSF) 얼음 처럼 차가운 버퍼 C 20 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 2.5 단계를 반복 합니다.
- 25 mL의 얼음 변성 버퍼 D (10 mM Tris HCl pH 8.0, 8 M 요소, 10 m m dithiothreitol (DTT), 0.2 밀리미터 PMSF) 포함 시체 펠 릿을 해산을 추가 합니다. 1-2 분, 또는 펠 릿은 작은 조각으로 부 러 때까지 vortexing에 의해 철저 하 게 resuspend.
- 혼합 4 ° c.에 30-120 분 30 rpm의 회전 속도와 축 회전에 의해 서 스 펜 션
- 30000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리에 의해 변성된 단백질 해결책을 명확히는 상쾌한 얼음에 놓고는 펠 릿을 삭제 합니다.
- Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 24 SDS 젤 분석을 위한 약 수 고-20 ° c.에 그것을 배치합니다
참고:이 시점에서, 절차 스냅 어 aliquoted 샘플 액체 질소에 의해 일시 중지 될 수 및 스토리지-80 ° C에서 그것을 유지.
3. 단백질을 Refolding
- 250 mL의 버퍼 E (3m 우 레 아, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 0.4 M L-아르기닌 monohydrochloride, 20 mM 감소 L-티, 2 mM 산화 L 티) 500 mL 비 커에 준비 하 고 4 ° c.까지 버퍼를 냉각
- 그의6을 포함 하는 변성된 단백질 혼합의 60 mg을 추가-Tlp3-LBD 500 rpm에서 버퍼를 교 반 하면서 단계 버퍼 E의 2.13 ~ 250 mL에서에서 얻은. 연속 교 반 24-48 h에 대 한 500 rpm으로 4 ° C에서 refolding 믹스를 품 어. 이 단계에서 최종 단백질 농도 0.2 mg mL-1.
- 8-10 L 물통에 버퍼 A의 7 L를 준비 하 고 24-48 h에서 열린다 다음 단계 (단계 3.4)에 대 한 준비에 4 ° C까지 냉각 ( 그림 1의 순서도 참조).
- 28mm 비정상적된 직경, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 disodium 소금 (EDTA-없음2) 200 mL에 12-14 kDa에 분자량 컷오프의 투 석 튜브의 ~ 50 cm 조각 담가 그리고 끓는 때까지 가스 불꽃을 통해 그것을 열. 린스의 ddH2오 200 mL와 함께 투 석 막
- 투 석 배관 폐쇄와 함께 투 석 막의 한쪽 끝을 클램프와 혼합물 분리 튜브에 3.2 단계에서 얻은 refolding 250 mL를 전송. 다른 클램프와 오픈 엔드를 닫습니다. 아무 누출 확인 막의 무결성을 확인 하십시오.
- 버퍼 A 단계 3.3에서에서 준비 미리 냉각 7 l 투 양동이에 투 관을 놓습니다. 바, 그것은 감동 하는 동안 투 석 튜브를 만지지 것입니다 보장 자기 저 어를 놓습니다.
- 500 rpm에서 교 반 계속 4 ° C에서 샘플을 dialyse 하 고 적어도 4 시간 동안 12 h의 버퍼를 변경 합니다. 마지막 버퍼 변경 후 샘플 dialyse 하룻밤을 둡니다.
참고: 투 석, 동안 요소 (3 M)의 초과 점차적으로 제거 refold를 단백질 수 변성된 단백질 해결책에서. 투 석의 끝에 무거운 단백질 강 수를 관찰할 수 있습니다. - 통에서 분리 튜브를 제거 하 고 500 mL 비 커에 그 내용을 전송. 달리 명시 되지 않는 한 얼음, 단백질 해결책을 유지.
- 어떤 침전 된 단백질 제거를 500 mL 유리병에 0.43 µ m 기 공 크기 세포 막을 통해 단백질 해결책을 필터링 합니다.
4. 그의6의 정화-단백질 Immobilised 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 태그
-
충전 하 고 equilibrate 5 mL prepacked chelating 열.
- 연동 펌프, 공기 연결 튜브에 갇혀 있다는 것을 보장 하는 열을 연결 합니다.
- DdH2오의 25-50 mL를 통해 전달 하 여 열을 씻어
- 0.1 m M NiCl2 의 3 mL 로드 다음 25 mL ddH2오의를 통해 전달 하 여 열을 충전
- (로딩 버퍼, 20 mM Tris HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 이미 20 m m)의 버퍼 F 25 mL와 열 equilibrate
- 1 M Tris HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl의 그리고 2 M 이미 재고 솔루션의 2.5 mL 2.5 mL을 추가 하 여 버퍼 F 구성이 3.9 단계에서 얻은 refolded 단백질 견본을 조정 합니다.
- (언바운드 단백질) 5 mL/min의 속도 흐름을 통해 삭제에 열에 샘플을 로드 합니다.
- 50-100 mL 비 특히 바인딩된 단백질을 통해 흐름 삭제 F 버퍼의 열을 씻어.
- 그의6elute-Tlp3-버퍼 G 25 mL (차입 버퍼, 20 mM Tris HCl 500 mM NaCl, 이미 500 m m)와 LBD 풀 흐름을 통해 분수 (Bradford 시 약을 사용 하 여 결정)로 단백질을 포함 하 고.
- Bradford 분석 실험을 사용 하 여 풀링된 샘플의 단백질 농도 측정 합니다. SDS 페이지 분석 및 장소-20 ° c.에 aliquot 작은 걸릴
5. 그의6-태그 TEV 프로 테아 제 (옵션)를 사용 하 여 제거
- 준비, 그리고 4 ° c, (TEV 분열 버퍼, 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) 글리세롤, 2mm DTT) 버퍼 H의 4 L 냉각.
- 투 석 배관의 대략 5-7 cm 컷 (직경 2-3cm) ddH2오 200 mL에 젖어
- 그의6추가-태그 TEV 프로 테아 제는 그의6-1 TEV에 마지막 어 금 니 비율 4.5 단계에서 태그 단백질 준비: 8 단백질.
- 투 석 배관 폐쇄와 함께 튜브의 한쪽 끝을 클램프 고 단백질/TEV protease 혼합물으로 채우십시오. 다른 쪽 끝을 닫고 아무 누출 확인 합니다.
- 장소는 투 석 (에서 단계 5.1) 버퍼 H의 사전 냉각된 4 L로 튜브 및 연속으로 4 ° C에서 그것을 품 어 2 h. 변경 된 버퍼에 대 한 교 반 하 고 TEV 중재 분열 반응은 완료 있도록 하룻밤 투를 계속 합니다.
- 한편, 준비 하 고 멋진 (4 ° C) 4 L 버퍼의 난 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 m m NaCl, 1% (v/v) 글리세롤) 다음 날에 대 한 준비.
- 야간 투 석 후 단계 5.6에서에서 준비 하는 버퍼를 버퍼를 교환 하 고 추가 1-2 h 4 ° c.에 대 한 dialyse
- 투 통에서 튜브를 제거 하 고 튜브의 한쪽 끝을 unclip 50ml 팔 콘 튜브에 단백질 해결책을 전송. 달리 명시 하지 않는 한, 얼음에 계속 및 0.43 µ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
- 샘플의 볼륨을 측정 하 고 버퍼 F 구성이 트리 스, NaCl 및 이미 농도 조정 (예: 버퍼 J에에서 단백질 해결책의 25 ml 1 M Tris HCl pH 8.0, 5 M NaCl의 1.75 mL의 0.25 mL 및 2 M 이미 0.25 mL 추가).
- 4.1 단계에 설명 된 대로 5 mL HiTrap 킬레이트 화 HP 열을 준비 합니다.
- 열에 샘플을 로드 (흐름 율: 5 mL/min)는 흐름-이 통해, 포함 된 Tlp3 LBD (잔류물 42-291) 수집. Uncleaved 단백질, 쪼개진는 그의6-태그와 그의6-TEV는 열에 의해 유지 됩니다.
- 씻어 열 5 mL 버퍼 F (로딩 버퍼)을 통과 하는 eluate 수집 모든 태그가 없는 단백질을 허용.
- 수영장은 eluate 5.11, 5.12 단계에서 얻은 고 단백질 농도 측정 한다. 작은 aliquot 고 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 그것을 저장.
6. 크기 배제 크로마토그래피 (젤 여과) Tlp3 LBD의
- 버퍼 A의 1 L (10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl)을 준비 하 고 0.43 µ m의 멤브레인을 사용 하 여 필터링 합니다.
- 4 mL/min의 유량에서 버퍼 A 26/60 크기 제외 열 equilibrate
- 5.13 10 kDa 컷오프 (4 ° C, 4000 x g)와 15 mL 원심 집중 장치를 사용 하 여 3-4 mL의 볼륨에 단계에서 얻은 단백질 견본을 집중 한다.
- 13000 x g, 어떤 침전 된 단백질 제거를 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 단백질 해결책을 명확히 합니다.
- 미리 equilibrated 26/60 젤 여과 열에 샘플을 로드 합니다. 모니터는 UV 트레이스 4 mL/분의 유량에서 버퍼 A에에서 크로마토그래피를 수행 합니다. Tlp3 LBD 210-220 mL의 보존 볼륨에서 elutes. 피크 분수 풀.
- 단백질 농도 측정 합니다. 받아 작은 SDS 페이지 분석을 위한 aliquot.
7. 단백질 정화의 다양 한 단계에서 수집 된 샘플의 SDS 페이지 분석
- SDS 페이지 실행 버퍼 (버퍼 J) 1 리터를 준비, 25 m m를 포함 하는 트리 스, 250mm 글리신 pH 8.3 및 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 (SDS).
- SDS 페이지 로딩 버퍼 (버퍼 K) x 5의 10 mL를 준비, 0.25 M Tris HCl pH 6.8을 포함, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) 글리세롤, 1mm DTT, 그리고 0.05 %bromophenol 블루.
- 정화의 다른 단계 동안 수집 된 aliquots를 허용 (1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6 단계) 해 동.
- 각 샘플에 대 한 SDS 페이지 로딩 버퍼, 볼륨을 조정 ddH2오 10 µ L 5 x 2 µ L로 전체 단백질의 15 µ g에 해당 하는 볼륨을 혼합
- 5-10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열, 30 s 및 전송에 대 한 10000 x g에서 회전 깨끗 한 관으로 샘플.
- SDS 페이지 젤, 15 %polyacrylamide 젤 분리를 사용 하 여 준비 (5 mL: 2.5 mL 30% (w/v) 두번째-아크릴, 1.2 mL에 대 한 1.5 M Tris HCl pH 8.8, 1.2 mL ddH2O, 50 µ L 10% (w/v) SDS, 50 µ L 20% (w/v) 암모늄 persulfate (AP), 3 µ L tetramethylethylenediamine (TEMED) 그리고 5 %polyacrylamide 젤 스태킹 (아크릴-2 mL: 340 µ L 30% (w/v) 두번째에 대 한 250 µ L 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µ L 10% (w/v) SDS, 20 µ L 20% (w/v) AP, 2 µ L TEMED).
- 전기 기구를 조립 하 고 제조자의 권고에 따라 버퍼를 실행 하는 SDS 페이지 x 1 입력.
- 단백질 분자량 마커 단계 7.5에서에서 준비 하는 샘플을 로드 합니다. 25의 정 전류에서 전기 영동을 수행 mA.
- 용기에 젤을 전송 하 고 25% (v/v) 소 프로 파 놀, 10% (v/v) 초 산 및 0.03% (w/v) 화려한 블루 R-250 포함 하는 솔루션 얼룩 Coomassie 파란의 ddH2오 추가 150 mL와 함께 그것을 씻어. 실 온에서 30 분 동안 수평 회전 플랫폼에서 컨테이너를 놓습니다.
- DdH2O 젤 린스 고 destaining 솔루션 5% (v/v) 메탄올과 7% (v/v) 초 산을 포함 합니다. 1 시간에 대 한 수평 회전 플랫폼을 사용 하 여 혼합 하는 동안 destain.
- 젤 이미지 그리고 분석.
8. 원형이 색 성 (CD) 분광학 분석의 이차 구조 refolded 순수 단백질의
- 0.5-1mg 6.6 분리 튜브에 단계에서 얻은 refolded 단백질의 전송 및 5의 L 버퍼 L (50 m m 인산 나트륨 pH 7.4), 4 ° c precooled를 포함 하는 투 석 양동이 연속 교 반으로 4 ° C에서 샘플 dialyse 및 적어도 3-4 버퍼 변경 샘플 dialyse 하룻밤을 떠나기 전에 2-4 h 이상.
- 0.06 밀리 그램 mL-1 10 kDa 컷오프 원심 집중 장치를 사용 하 여 dialysed 단백질 해결책 집중.
- 13000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히 합니다.
- 25 ° C와 20 nm 분-1의 스캔 속도 spectropolarimeter를 사용 하 여 200-260 nm의 파장 범위에서 샘플의 멀리 UV CD 스펙트럼을 기록 합니다. 투 석 버퍼를 사용 하 여 빈 컨트롤. 3 중에 녹음을 반복 하 고 평균된 스펙트럼을 생성.
- 계산 하는 이차 구조 콘텐츠 CD를 deconvoluting 하 여 스펙트럼은 DichroWeb에서 CDSSTR 프로그램을 사용 하 여 서버25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
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Representative Results
그의6의 재조합 표현-Tlp3-포함 시체 증 착 단백질 귀착되 었 다 대장균 에 LBD. 세균성 문화 단계 2.13에서에서 계산의 1 l 식 수율은 약 100mg의 그의6-Tlp3-LBD 포함 시체에 있는 예금. 여기서 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 단백질 격리 절차 포함, 단백질을 refolding 몸과 정화 친화성 크로마토그래피, 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피의 solubilisation의 구성 10-20 밀리 그램의 세균성 문화 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 수익률.
단백질 220 mL (그림 2A)의 보존 볼륨에 해당 하나, 대칭 피크로 젤 여과 열에서 eluted. 고정 볼륨 대 로그 (MW)의 교정 플롯을 사용 하 여 분자량 (MW)의 계산 (V보존 (mL) = 549.3 73.9 x log(MW)) EMBL 단백질 표정과 정화 핵심 시설 웹사이트 (http://www.embl.de/에서 사용할 수 pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), 29 kDa의 가치를 얻지 못했다. 이 값은 매우 가까이 제안 하는 아미노산 서 열 (28.7 kDa)에서 계산 그 Tlp3 LBD 솔루션에서 단위체 이다.
정화 과정을 평가 하기 위해 다른 단계에서 수집 된 샘플은 SDS 페이지 분석을 사용 하 여 평가 했다. 그림 2B에서 같이, 포함 시체 포함 주로 그의6-Tlp3-LBD. 이 단백질의 적은 양을 유도 문화 수용 성 부분에도 있었으나 (IPTG(+)), 그리고 uninduced 문화 (IPTG(-))-T7 중 합 효소의 새 식으로 인해 분명히. 그의6-Tlp3-LBD 아미노산 시퀀스 (31.8 kDa)에서 계산 된 값에 가까운 28 kDa의 명백한 분자량과 polyacrylamide 젤에 마이그레이션. 그의6-태그 제거, 친화성 크로마토그래피와 젤 여과 단계 높은 순수 단백질이 나왔고 (> 90% 전기 이동 동질성).
이 절차에 의해 얻어진 단백질 되었는지 확인 하려면 접혀, 그의6의 이차 구조-Tlp3-LBD CD 분광학에 의해 평가 되었다. Α-나선 및 CDSSTR를 사용 하 여 CD 스펙트럼 (그림 3)에서 β-시트 콘텐츠의 31% 23% α와 β의 값을 했다. 이러한 값 요소 변성 포함 시체에서 발견 단백질은 접혀 나타내는 Jpred3 서버 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% 26%와 α β)를 사용 하 여 시퀀스 분석에서 예측 그 가까이 했다.
그림 1: 제시 방법의 도식. 재조합 그의6-Tlp3-LBD와 IPTG (참조 섹션 1) 유도 시 대장균 에서 expressd 이다. 4 h 식 후 세균 세포 수확 하 고 lysed (섹션 2 참조). 불용 성 분수 포함 시체 (IB)을 포함 하는 멤브레인 및 막 단백질 불순물, 이후는 IB는 높은 농도 (섹션 2 참조)에서 요소를 포함 하는 버퍼에 용 해의 제거를 위한 세척 된다. 그의6-Tlp3-LBD 버퍼 E 점진적 요소 제거 (제 3)에 대 한 철저 한 투 석 다음에 희석 하 여 refolded. 그의6refolded-Tlp3-섹션 4에서에서 설명한 대로 LBD 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 다음입니다. 그의6-태그 TEV 프로 테아 제 (5 단원)을 사용 하 여 제거 됩니다. 태그 Tlp3 LBD는 집중 하 고 추가 젤 여과 크로마토그래피 (6 단원)에 의해 정화. SDS 페이지 분석을 위해 샘플의 컬렉션에 대 한 포인트 표시 됩니다 *. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 재조합 Tlp3 LBD의 정화. (A) Superdex 200 HiLoad 26/60 젤 여과 열에 태그 Tlp3 LBD의 크기 배제 크로마토그래피 추적. 단백질 220 mL의 보존 볼륨 eluted. (B) SDS 페이지 Coomassie 파란 얼룩이 젤 15% 감소. M: 단백질 분자량 마커; IPTG (-): uninduced 컨트롤 샘플 수집 단계 1.3; IPTG 유도 (2.3 단계에서 수집); 후 IPTG (+): 수용 성 분수 IB: 절연된 포함 시체 (2.13 단계); 그의6refolded-Tlp3-LBD: 단계 4.6;에서 refolded 단백질 샘플 태그 Tlp3 LBD: 단백질 샘플 단계 5.13;에서 얻은 젤 여과 1과 2: 젤 여과 열 (단계 6.6)에서 eluted 단백질 피크에서 두 분수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 원형이 색 성 스펙트럼의 정화 재조합 Tlp3 LBD. 스펙트럼은 50mm 나트륨 인산 염 pH 7.4에에서 25 ° C에서 기록 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
식 및 세균성 chemoreceptor Tlp3의 periplasmic LBD의 포함 시체에서 refolding 간단한 절차 제공 됩니다. 순수 단백질의 준비- 대장균, 정화 및 포함 시체, solubilisation 애완 동물 플라스 미드 인코딩 유전자 표현 포함 연속 선호도 의해 변성된 단백질의 정화의 refolding 및 크기 배제 크로마토그래피 단계입니다. 촉진 하는 요소 변성 및 refolding 희석/투 석-중재 최적화는 종종 포함 시체26에 입금 하는 단백질의 적절 한 renaturation 보장 하는 데 필요한 프로토콜에서 중요 한 단계입니다.
먼저 요소를 포함 하는 버퍼에 변성된 샘플을 희석 한 다음 여 그것 없는 버퍼에 대 한 샘플을 dialysing Tlp3 LBD의 refolding 2 단계 방식으로 달성 되었다. 이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 refolded 단백질 기능 및 crystallisable18,23이었다. 그러나, 제시 방법에는 몇 가지 제한이 있습니다. 그것은 잘 알려진 단백질 변성 우 레 아27,,2829존재 refolded 때 아미노 그룹의 그의 carbamylation가 종종 발생 합니다. 이것은 녹은 요소 시간 궤 란 하 고 생성 안산30 단백질 아미노산 그룹 안정적인 carbamylated 제품을 형성 하 고, 작은 범위, 다른 기능 그룹31, 를 반응 하는 사실 때문 이다 32. 알칼리 성 pH 및 온도 조건 하에서 우 레 아의 분해 가속. 그래서, 그것에서 초순 신선한 요소 솔루션을 만드는 것이 좋습니다 (> 99%) 고체 시 약, 안산 형성을 줄이기 위해 낮은 온도 (4 ℃),3033, refolding/투 석 단계를 수행. 또한, 주 아민, 트리, 등을 포함 하는 버퍼를 선택 글리신 또는 refolding 믹스에 대 한 염화 중 탄산염이 중요 생산된 안산29,33의 청소 수 있도록 합니다. 다른 옵션은 요소, 대신 guanidine 염 산 염을 사용 하는 guanidine 염 산 염은 화학적으로 단백질 수정에 보고 되지입니다.
우 레 아, 뿐만 아니라 원제 (DTT 또는 β-mercaptoethanol)는 종종 포함 시체를 solubilize 고 기본이 아닌 내부-및 intermolecular 이황화 방지 하기 위해 감소 된 상태로26 시스테인 잔류물을 유지 하 여 대형 채권 ,34. Tlp3 LBD는 하나의 intramolecular 이황화 결합, 그리고이 프로토콜, 불용 성 단백질의 DTT는 물의 resuspension 원조를 포함 시체 변성 버퍼 (단계 2.10)에 통합 되었다 10 밀리미터에서에서. DTT 농도 다음 버퍼, 점차적으로 모든 DTT를 제거 하는 투 석 단계 다음을 refolding 단백질으로 샘플을 diluting 하 여 ~ 100 배에 의해 감소 되었다. 이 절차의 응용 프로그램 여러 이황화 결합 단백질을 refolding 산화와 감소 시키는 대리인 (예: 산화와 감소 티 (GSSH/GSH)의 농도의 최적화를 할 수 있습니다 주의 하는 것이 중요 하다 GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor cystine/시스테인) 이황화의 적절 한 형성을 촉진 하 교량34,35. 게다가, 관심사의 단백질에는 짝이 없는 시스테인 이황화 결합 형성에 관여 하지 않습니다, 경우는 원제 모든 정수 버퍼에 추가 되어야 합니다. 단백질의 아미노산 시퀀스에서 잠재적인 이황화 다리의 여러 철에 도구를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 (예: cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& 하위 그룹 propt =).
다른 단백질의 정화에 대 한 제시 프로토콜을 사용 하 여 세척 단계 4.4 이미의 농도의 최적화 요구 또한 높습니다. 그림 2B 와 같이 (레인 IB를 표시), 격리 포함 시체에에서 포함 된,이 경우 주로 관심의 단백질. 경우 추가적인 중요 한 밴드 SDS 페이지 젤 IB 샘플 단계 4.4에서에서 이미 농도 증가의 오염 물질을 제거 하는 데 필요한 것입니다 하지만 단백질 수율36,37을 줄일 수 있습니다 볼 수 있습니다. 다른 옵션은 이미 농도의 선형 그라디언트를 적용 하 고 관심사의 단백질을 포함 하는 eluted 분수 풀입니다.
정화, 크기 배제 크로마토그래피의 마지막 단계 동시에 eluted 입자의 분자 질량을 예측 하 고 단백질의 oligomeric 상태를 파생 하는 수단을 제공 합니다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분자 질량의 추정이입니다만 구형 분자에 대 한 정확 하지 많은 단백질38,39에 대 한 경우. 하나는 단백질을 확인할 수 있습니다 분자 질량 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용 하 여 높은 정확도 oligomeric 상태 다 각 산란 (초-MALS)40 또는 분석 ultracentrifugation41를 결합. 우리 이전 Tlp3 LBD는 초 MALS 분석23를 사용 하 여 솔루션에서 단위체 그리고이 결과 다른 dCACHE LBDs42,43에 대 한 보고서와 일치를 확인 했습니다.
제시 프로토콜, 원본 또는 약간 수정 된 형태로 사용 되었습니다 refold x 선 결정학 연구17,,1819, dCACHE 가족에서 여러 chemoreceptor LBDs 정화 하 23 , 42 , 44.이 절차는 일반적으로 가용성과 crystallisable 형태로 다른 세균성 chemoreceptors의 periplasmic LBDs 밀리 그램 양의 생산을 위해 유용할 수 있습니다. 각 별도 경우, 프로토콜 최적화 가능성이 필요 합니다. 위에서 설명한 포인트 이외에 포함 시체와 단백질을 refolding 최적의 solubilisation 세제 (예: SDS 또는 N-아 세 틸 유통 염화 암모늄)의 사용을 요구할 수 있습니다 (예: L-아르기닌) 첨가제 및 단계26,34,,4546refolding 개인에 그들의 농도 및 부 화 시간의 조정. 또한, refolding 단계에서 단백질 농도 refolding 수익률을 크게 영향을 줍니다. 10 mL-1 를 1 ng mL-1 에서 농도의 범위는 일반적으로 테스트 해야 합니다. Tlp3 LBD refolding 믹스에 단백질의 최적 농도 0.2 mg mL-1이었다.
매우 낮은 refolding 수익률 일반적으로 재판 refolding 조건을 최적의 멀리는 표시 이다.입니다. 하나는 높은 수율 (이 절차에 설명 된) 대로 CD 분광학을 사용 하 여 유효성을 검사할 수 있는 접힌된 단백질와 일치 하는 것을 기대할 수 있습니다. 또한, 결과 단백질의 crystallisability sugguest 단백질의 접힌된 상태를 수 있습니다. 또는, 기능 분석 결과 (사용 가능한 경우) 단백질 접혀 확인을 사용할 수 있습니다. Tlp3 LBD의 경우 예를 들어 refolded 단백질 표시 했다 그것의 ligand 바인딩 능력 유지 등온 열 량에 의해 표시 된 대로. 23
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 그의 초기 작품 Tlp3 LBD 생산에 대 한 유 C. Liu를 감사합니다. Mayra A. Machuca 딸 Admistrativo 데 많은, 기술과 전자 Innovación COLCIENCIAS 박사 장학금에 대 한 빚을입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
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