Summary
Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.
Abstract
Identificatie van de natuurlijke liganden van chemoreceptors en structurele studies gericht op opheldering van de moleculaire basis van de specificiteit van het ligand kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van milligram bedragen van pure, gevouwen ligand bindende domeinen. Misbruik van geïnfecteerd express periplasmische ligand bindende domeinen van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) vaak resulteren in hun gericht op integratie-organen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van opneming organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische dCACHE ligand bindend domein van Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. De aanpak omvat uitdrukking van de proteïne van belang met een cleavable zijn6-tag, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen, eiwit uiteinde door ureum uitputting en zuivering door middel van de chromatografie van de affiniteit, gevolgd door tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De circulair dichroïsme spectroscopie wordt gebruikt voor het bevestigen van de gevouwen staat voor het pure eiwit. Het is aangetoond dat dit protocol in het algemeen nuttig voor productie van milligram bedragen van dCACHE periplasmische ligand bindende domeinen van andere bacteriële chemoreceptors in de vorm van een oplosbare en crystallisable is.
Introduction
Chemotaxis en motiliteit is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de pathogenese van Campylobacter jejuni door bacteriële kolonisatie en invasie van de host1,2,3te bevorderen. Chemotaxis kan bacteriën toewerken naar een optimale omgeving voor de groei, als geleid door chemische signalen. Dit proces omvat erkenning van intracellulaire en milieu chemische signalen door een aantal eiwitten genoemd chemoreceptors of transducer-achtige eiwitten (Tlps). De meeste chemoreceptors zijn membraan-embedded eiwitten met een extracytoplasmic ligand bindend domein (LBD), een transmembraan domein en een cytoplasmatische seingeving domein, de laatste van die samenwerkt met de cytosolische signalering eiwitten die het signaal zenden motoren aan de flagellar4,5,6,7.
Elf verschillende chemoreceptors er zijn geïdentificeerd in de C. jejuni genoom4,8. Tot op heden, slechts enkele van deze chemoreceptors hebben gekenmerkt en de specificiteit van de ligand van Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, en Tlp11-13 is bekend. Identificatie van de natuurlijke liganden van de resterende chemoreceptors in deze soort, en talrijke chemoreceptors in andere bacteriën, kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van gevouwen en zeer zuiver recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. uitspreken geïnfecteerd periplasmische LBDs van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli vaak resulteren in hun doelgerichtheid in de integratie-organen17,18,19 . Niettemin, dit fenomeen kan vergemakkelijken eenvoudig isolatie en herstel van het eiwit in de hand. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van integratie-organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische LBD van de C. jejuni chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. In het volgende voorbeeld werd gekozen omdat Tlp3-LBD behoort tot de dCACHE familie20 van teledetectie domeinen die overvloedig in tweecomponenten histidine kinases en chemoreceptors in prokaryoten20,21, gevonden zijn 22 , 23.
In deze benadering de constructie voor de expressie, op basis van een pET151/D-TOPO vector, is ontworpen om het nemen van een N-terminal zijn-6-label, gevolgd door een tabak etch virus (TEV) protease breukzijde, voor latere tag verwijdering19. Het protocol beschrijft eiwit overexpressie in E. coli, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen en eiwit uiteinde van ureum uitputting. Volgende uiteinde, het monster wordt gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit, met optionele tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De gevouwen staat van het gezuiverde eiwit wordt bevestigd met behulp van circulair dichroïsme spectroscopie. Dit is een gewijzigde versie van de methode die eerder is ontwikkeld om te herstellen en zuiveren van de LBD van een verschillende chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Deze procedure, samengevat in Figuur 1, levert 10-20 mg zuivere, niet-gecodeerde Tlp3-LBD per 1 liter van bacteriële cultuur, met een zuiverheid van de proteïnen van > 90% zoals geraamd door SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. weergave van zijn6-Tlp3-LBD bij E. coli
- Inoculeer 150 mL steriele Luria Bertani (LB) bouillon met 50 µg mL-1 ampicilline met BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL cellen getransformeerd met de pET151/D-TOPO vector voor de uitdrukking van zijn6- Tlp3-LBD (aminozuurresidu's 42-291), en het bij 37 ° C in een shaker (orbit diameter, 25 mm) met 200 t/min na een nacht bebroeden.
- Bereiden van zes 2 L conische kolven met 800 mL steriele de pond-Bouillon en 50 µg mL-1 ampicilline. Inoculeer elke kolf met 20 mL van de overnachting cultuur stap 1.1 verkregen. Incubeer hen bij 37 ° C met continue schudden bij 200 rpm tot de optische dichtheid op 600 nm uithoeken 0.6.
- Neem een 1 mL aliquoot van één van de kolven (uninduced controlemonster), pellet met behulp van een benchtop centrifuge (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) en de vloeistof wordt weggeworpen. De bacteriële pellet bij-20 ° C voor latere analyse van de SDS-pagina worden opgeslagen.
- Induceren eiwit expressie door 1 mM van isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) toe te voegen aan elke maatkolf met cultuur. Blijven de kolven bij 37 ° C in een shaker bij 200 t/min voor een extra 4 h aan het broeden.
- Oogst van de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
Opmerking: op dit punt, de procedure kan worden onderbroken door het plaatsen van de cel pellet in een vriezer-80 ° C voor opslag.
2. isolatie en denaturatie van integratie-organen
- Overdracht van al de cel korrels verkregen uit stap 1.5 naar een bekerglas van 250 mL en voeg 100 mL buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). De cellen te ontdooien volledig (indien bevroren) toestaan en resuspendeer de pellet. Houd het monster op ijs, tenzij anders aangegeven.
- Doorgeven van de geresuspendeerde cellen tot een hogedruk homogenisator driemaal lyse de cellen en zorgen voor volledige schuintrekken van genomic DNA.
- Centrifugeer het lysate bij 10.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Een monster van 1 mL van het supernatans (oplosbare fractie) verzamelen en opslaan bij-20 ° C voor latere analyse van de SDS-pagina. Gooi de rest van het supernatant en plaats de pellet op ijs.
Opmerking: Deze pellet is wit van kleur (gemakkelijk te onderscheiden van ongebroken cellen die de schaduw van bruin in kleur) en integratie instanties bevat. - Resuspendeer de pellet opneming organen grondig in 20 mL ijskoud buffer B (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 1% Triton X-100). Dit vergemakkelijkt het oplossen van het membraan en membraaneiwitten. Vortex voor 1-2 min op steun resuspensie.
- Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
- Resuspendeer de pellet grondig in 20 mL ijskoud buffer B door vortexing de buis voor de 1-2 min. Zorg ervoor dat de pellet is onderverdeeld in kleine stukjes. Pipetteer het monster op en neer op de steun van de pellet resuspensie.
Opmerking: Het is belangrijk dat resuspendeer de pellet grondig met het oog op opneming organen vrij van onzuiverheden. - Herhaal stap 2.5. Als de bovendrijvende vloeistof troebel of gekleurd is, herhaal stap 2.6 en 2.5 (in die volgorde) totdat het supernatans is helder en kleurloos.
- Resuspendeer de pellet in 20 mL ijskoud buffer C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) door vortexing de buis gedurende 1-2 minuten.
- Herhaal stap 2.5.
- Voeg 25 mL ijskoud denatureren buffer D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M ureum, van 10 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) te ontbinden de opneming organen-pellet. Resuspendeer grondig door vortexing gedurende 1-2 minuten, of totdat de pellet is onderverdeeld in kleine stukjes.
- Mix de schorsing door axiale rotatie met een snelheid van de rotatie van 30 rpm gedurende 30-120 minuten bij 4 ° C.
- Verduidelijken de gedenatureerde proteïne oplossing door centrifugatie bij 30.000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten, plaatst u het supernatant op ijs en negeren de pellet.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van de analyse van Bradford. 24 Neem een aliquoot gedeelte voor SDS-gel analyse en plaats het bij-20 ° C.
Opmerking: op dit punt, de procedure kan worden onderbroken door module-diepvriezen het aliquoted monster in vloeibare stikstof en bewaar deze bij-80 ° C voor opslag.
3. eiwit uiteinde
- Bereiden van 250 mL buffer E (3 M ureum, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.4 M L-arginine monohydrochloride, 20 mM verlaagd L-glutathione, 2 mM geoxideerde L-glutathion) in een bekerglas van 500 mL en cool de buffer tot 4 ° C.
- Toevoegen van 60 mg gedenatureerde proteïne mix met zijn6-Tlp3-LBD verkregen in stap 2.13 tot 250 mL buffer E, terwijl de buffer roeren bij 500 omwentelingen per minuut. Incubeer de refolding mix bij 4 ° C met continue roeren bij 500 omwentelingen per minuut gedurende 24-48 uur. In deze stap de laatste eiwitconcentratie is 0,2 mg mL-1.
- 7 L voor buffer A in een 8-10 L emmer voor te bereiden en afkoelen tot 4 ° C in voorbereiding voor de volgende stap (stap 3.4), die in de 24-48 h plaatsvinden zal (Zie het stroomdiagram in Figuur 1).
- Dompel een ~ 50 cm stuk van dialyse buis 28 mm opgeblazen diameter, met molecuulgewicht licht-donkerscheiding op 12-14 kDa in 200 mL 10 mM ethyleendiamminetetra zuur Dinatrium zout (EDTA-Na2) en het over een gasvlam verhit tot koken. Spoel het membraan van de dialyse met 200 mL van ddH2O.
- Ene uiteinde van het membraan van de dialyse met een sluiting dialyse slang klem en breng de 250 mL uiteinde mengsel in stap 3.2 in de dialyse-buis verkregen. Sluit het open einde met een andere klem. Controleer de integriteit van het membraan om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn.
- Plaats de buis dialyse in een emmer van de dialyse met de vooraf gekoelde 7 L van buffer A bereid in stap 3.3. Plaats een magnetische roer bar, ervoor te zorgen dat het niet de dialyse-buis tijdens het roeren raken zal.
- Dialyse het monster bij 4 ° C met aanhoudende roeren bij 500 t/min en wijzigen van de buffer minstens vier maal een periode van 12 h. Na de laatste wijziging van de buffer, laat het monster om 's nachts dialyse.
Opmerking: Tijdens de dialyse, de overmaat van ureum (~-3 M) is geleidelijk aan verwijderd uit de gedenatureerde proteïne-oplossing, waarmee het eiwit te refold. Zware eiwit neerslag waarneembaar aan het einde van de dialyse. - Verwijder de dialyse-buis uit de emmer en breng de inhoud in een bekerglas van 500 mL. Bewaar de oplossing van de eiwitten op het ijs, tenzij anders aangegeven.
- Filtreer de oplossing van de eiwitten door middel van een 0,43 µm membraan voor de grootte van de poriën in een 500 mL glazen fles te verwijderen elke neergeslagen eiwitten.
4. zuivering van zijn6-gelabeld eiwit met behulp van de chromatografie van de affiniteit van de geïmmobiliseerde metaalion
-
Opladen en equilibreer een voorverpakte chelaatvormers kolom 5 mL.
- De kolom verbinden met een peristaltische pomp, om ervoor te zorgen dat er geen lucht gevangen in de aansluitende buis.
- Was de kolom door het passeren van 25-50 mL ddH2O.
- De kolom kosten door 3 mL 0,1 M NiCl2 laden en vervolgens passeren 25 mL ddH2O.
- De kolom met 25 mL buffer F (laden buffer, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) equilibreer.
- Pas de refolded eiwitSteekproef in stap 3.9 aan de samenstelling van buffer F verkregen door toevoeging van 2.5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl en 2,5 mL 2 M imidazool stamoplossingen.
- Het laden van het monster op de kolom op een tarief van 5 mL/min of minder en negeren de doorstroming (niet-afhankelijke eiwitten).
- Was de kolom met 50-100 mL buffer F verwijderen niet-specifiek afhankelijke eiwitten en negeren de doorstroming.
- Elueer zijn6-Tlp3-LBD met 25 mL buffer G (elutie buffer, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) en zwembad de doorstroming breuken die de eiwitten (zoals bepaald met behulp van het reagens Bradford) bevatten.
- Het meten van de eiwitconcentratie in de gepoolde monster met behulp van de analyse van Bradford. Neem een kleine hoeveelheid voor SDS-pagina analyse en plaats bij-20 ° C.
5. zijn6-label verwijderen met behulp van TEV Protease (optioneel)
- Bereiden en koelen tot 4 ° C, 4 L van buffer H (TEV decollete buffer, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol, 2 mM DTT).
- Snijden van ongeveer 5-7 cm van dialyse leidingen (diameter 2-3 cm) en dompel het in 200 mL ddH2O.
- Toevoegen van zijn6-gelabeld TEV protease aan het zijn6-label eiwit bereid in stap 4.5 naar een definitieve molaire verhouding 1 TEV: 8 eiwit.
- Één uiteinde van de buis met een sluiting dialyse slang klem en vul deze met het mengsel van eiwit/TEV protease. Sluit het andere uiteinde, en zorg dat er geen lekken.
- Plaats de dialyse buisvideo in de vooraf gekoelde 4 L van buffer H (uit stap 5.1) en Incubeer het bij 4 ° C met continue roeren gedurende 2 h. verandering de buffer en dialyse 's nachts blijven toestaan dat de reactie van de TEV-gemedieerde decolleté te voltooien.
- In de tussentijd bereiden en koel van (4 ° C) 4 L van buffer ik (10 mM Tris-HCl pH 8.0, van 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol) ter voorbereiding van de volgende dag.
- Na de overnachting dialyse, wisselen de buffer aan buffer die ik bereid in stap 5.6 en dialyse voor een verdere h 1-2 bij 4 ° C.
- Verwijderen van de buis van de dialyse-emmer, unclip één uiteinde van de buis en breng de eiwit-oplossing over in een 50 mL Falcon buis. Filtreer de oplossing door een 0,43 µm porie grootte spuit filter en bewaar deze op het ijs, tenzij anders vermeld.
- Meten van de hoeveelheid van het monster en de Tris, NaCl en imidazol concentratie op de samenstelling van buffer F aan te passen (b.v. voor 25 mL van eiwit oplossing in buffer J 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl en 0,25 mL 2 M imidazool toevoegen).
- Bereid een 5 mL HiTrap chelaat HP kolom zoals beschreven in stap 4.1.
- Laden van het monster op de kolom (debiet: 5 mL/min) en het verzamelen van de doorstroming, waarin de niet-gecodeerde Tlp3-LBD (residuen 42-291). Uncleaved eiwit, het gekloofd zijn6-label en zijn6- TEV worden bewaard door de kolom.
- Was de kolom met 5 mL buffer F (laden buffer) zodat alle niet-gecodeerde eiwit doorstromen en verzamelen van het eluaat.
- Zwembad het eluaat verkregen in stappen 5.11 en 5.12 en meten van de eiwitconcentratie. Neem een kleine hoeveelheid en opslaan bij-20 ° C voor analyse van de SDS-pagina.
6. size-exclusion Chromatography (Gel filtratie) van Tlp3-LBD
- Bereiden 1 L voor buffer A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, van 150 mM NaCl) en filteren met behulp van een membraan 0,43 µm.
- Equilibreer een kolom grootte-uitsluiting 26/60 met buffer A een snelheid van 4 mL/min.
- Concentreren de eiwitSteekproef verkregen in stap 5.13 met een volume van 3-4 mL, 15 mL centrifugaal concentrator met een 10 kDa cut-off (4 ° C, 4000 x g).
- Verduidelijken de eiwit-oplossing door centrifugatie bij 13.000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten te verwijderen elke neergeslagen eiwitten.
- Het laden van het monster op de vooraf equilibrated 26/60 gel filtratie kolom. Chromatografie in buffer A op een debiet van 4 mL/min. Monitor de UV-trace uitvoeren. Tlp3-LBD GC op een retentievolume van 210-220 mL. Zwembad de piek breuken.
- Meet de eiwitconcentratie. Nemen een kleine hoeveelheid voor SDS-pagina-analyse.
7. SDS-pagina analyse van monsters verzameld in verschillende stadia van eiwitreiniging
- 1 L voor SDS-pagina lopende buffer (buffer J) voor te bereiden, met 25 mM Tris, 250 mM glycine pH 8.3 en 0,1% (g/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS).
- Voorbereiden van 10 mL 5 x SDS-pagina laden buffer (buffer K), bevattende 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, 10% (m/v) SDS, 50% (v/v) glycerol, 1 mM DTT en 0,05% bromophenol blauw.
- De aliquots verzameld tijdens de verschillende stappen van de zuivering toestaan (stappen 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) te ontdooien.
- Voor elk monster, meng het volume dat overeenkomt met 15 µg totaal eiwit met 2 µL van 5 x SDS-pagina laden van de buffer, en pas het volume aan 10 µL met ddH2O.
- Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 5-10 min, draai ze bij 10.000 x g gedurende 30 s en overdracht de monsters in een schone buis.
- Bereiden van een SDS-pagina gel, met behulp van 15% polyacrylamide scheiden gel (voor 5 mL: 2,5 mL 30% (g/v) bis-acrylamide, 1,2 mL 1.5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µL 10% (m/v) SDS, 50 µL ammoniumnitraat van 20% (m/v) persulfate (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) en 5% polyacrylamide stapelen van gel (voor 2 mL: 340 µL 30% (g/v) bis-acrylamide, 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µL 10% (m/v) SDS, 20 µL 20% (m/v) APS, 2 µL TEMED).
- Monteren van de Elektroforese van het apparaat en vul deze met 1 x SDS-pagina uitgevoerd buffer volgens de aanbeveling van de fabrikant.
- Een eiwit molecuulgewicht marker en de monsters bereid in stap 7.5 laden. Voer de Elektroforese bij een constante stroom van 25 mA.
- Breng de gel in een container en spoel het na met ddH2O. toevoegen 150 mL van de Coomassie Blue kleurstofoplossing met 25% (v/v) isopropanol, 10% (v/v) azijnzuur en 0,03% (m/v) briljant blauw R-250. Plaats de container op een horizontale rotatie platform gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de gel met ddH2O en plaats in de destaining oplossing met 5% (v/v) methanol en 7% (v/v) azijnzuur. Destain tijdens het mixen met behulp van een horizontale rotatie platform voor 1 h.
- Beeld van de gel en analyseren.
8. circulair dichroïsme (CD) spectroscopie analyse van secundaire structuur van refolded Pure eiwitten
- Overdracht van 0,5 - 1 mg refolded eiwit verkregen in stap 6.6 in een buis van dialyse en plaats deze in een emmer van de dialyse met 5 L buffer L (50 mM natriumfosfaat pH 7.4), precooled tot 4 ° C. Dialyse het monster bij 4 ° C met continue roeren en het uitvoeren van ten minste 3-4 buffer wijzigingen meer dan 2-4 uur voor vertrek van de steekproef om 's nachts dialyse.
- De oplossing van de dialysed eiwitten voor 0.06 mg mL-1 met behulp van een 10 kDa cut-off centrifugaal concentrator concentreren.
- Verhelder de oplossing door centrifugatie bij 13.000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Het opnemen van de ver-UV-CD spectrum van het monster bij 25 ° C op een golflengtebereik van 200-260 nm met behulp van een spectropolarimeter met een scanfrequentie van 20 nm min-1. Gebruik de dialyse-buffer als een blanco-controle. Opname in drievoud herhalen en de gemiddelde spectrum te genereren.
- Bereken de inhoud van de secundaire structuur door de deconvoluting van de CD sever spectra met behulp van het programma van de CDSSTR van de DichroWeb25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recombinante uitdrukking van zijn6-Tlp3-LBD bij E. coli resulteerde in eiwit depositie in integratie-organen. De opbrengst van de expressie van 1 L van bacteriecultuur berekend in stap 2.13 was ongeveer 100 mg zijn6-Tlp3-LBD gestort in integratie-organen. De eiwit isolatie procedure, die hier worden beschreven en geïllustreerd in Figuur 1, bestaat uit het oplossen van opneming en eiwit uiteinde en zuivering, door middel van de chromatografie van de affiniteit, tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie , en levert 10-20 mg zuivere, niet-gecodeerde Tlp3-LBD per 1 liter van bacteriecultuur.
Het eiwit geëlueerd uit de gel-filtratie-kolom als een enkele, symmetrische piek die overeenkomt met een retentievolume van 220 mL (figuur 2A). Berekening van het molecuulgewicht (MW) met behulp van een complot van de kalibratie van log (MW) versus retentievolume (Vretentie (mL) = 549.3-73,9 x log(MW)) beschikbaar op de website EMBL eiwit expressie en zuivering Core faciliteit (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), leverde de waarde van 29 kDa. Deze waarde is zeer dicht bij die berekend op basis van de volgorde van aminozuur (28.7 kDa), die suggereerde dat Tlp3-LBD een monomeer in oplossing.
Om te beoordelen het zuiveringsproces, werden monsters die bij de verschillende stappen geëvalueerd met behulp van SDS-pagina-analyse. Zoals aangetoond in figuur 2B, integratie-organen die overwegend zijn6-Tlp3-LBD. Kleine hoeveelheden van dit proteïne waren ook aanwezig in de oplosbare fractie van de geïnduceerde cultuur (IPTG(+)), en in de uninduced cultuur (IPTG(-)) – blijkbaar als gevolg van de lekkende uitdrukking van de T7 polymerase. Zijn6-Tlp3-LBD gemigreerd op het polyacrylamidegel met een schijnbare molecuulgewicht van 28 kDa, die dicht bij de waarde berekend op basis van de volgorde van de aminozuur (31.8 kDa). Het zijn6-tag verwijdering, chromatografie van de affiniteit en gel filtratie stappen leverde zeer zuivere proteïne (> 90% elektroforetische homogeniteit).
Om te bevestigen dat het eiwit verkregen door deze procedure was gevouwen, de secundaire structuur van zijn6-Tlp3-LBD werd beoordeeld door CD spectroscopie. Schatting van de α-helix en de inhoud van de β-blad uit de CD-spectrum (Figuur 3) met behulp van CDSSTR gaf waarden van 31% α en 23% β. Deze waarden werden dicht bij die voorspeld op grond van de sequentieanalyse met behulp van de Jpred3-server (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% α en 26% β), die aangeeft dat het eiwit hersteld van de ureum-gedenatureerd integratie-organen was gevouwen.
Figuur 1: schematische van onderhavige methode. Recombinant zijn6-Tlp3-LBD is expressd in E. coli bij inductie met IPTG (zie punt 1). Na 4 uur expressie, bacteriële cellen worden geoogst en lysed (zie punt 2). De onoplosbare breuk met de integratie-organen (IB) wordt gewassen voor verwijdering van het membraan en membraan eiwitten verontreinigingen, waarna de IB worden opgelost in een buffer met ureum in hoge concentraties (zie punt 2). Zijn6-Tlp3-LBD is refolded door verdunning in buffer E gevolgd door uitputtende dialyse voor geleidelijke ureum verwijdering (sectie 3). Refolded zijn6-Tlp3-LBD wordt dan gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van de geïmmobiliseerdet metaalion zoals beschreven in sectie 4. Het zijn6-label is verwijderd met behulp van TEV protease (sectie 5). Niet-gecodeerde Tlp3-LBD is geconcentreerd en verder gezuiverd door gel filtratie chromatografie (punt 6). Punten voor het verzamelen van monsters voor analyse van de SDS-pagina worden aangegeven met *. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: zuivering van recombinante Tlp3-LBD. (A) grootte-uitsluiting chromatografie spoor van niet-gecodeerde Tlp3-LBD op een Superdex 200 HiLoad 26/60 gel filtratie kolom. Het eiwit met een retentievolume van 220 mL geëlueerd. (B) verlaagd 15% SDS-pagina Coomassie Blue gebeitste gel. M: eiwit molecuulgewicht marker; IPTG (-): uninduced controlemonster verzameld in stap 1.3; IPTG (+): oplosbare fractie na IPTG inductie (verzameld in stap 2.3); IB: geïsoleerde opneming organen (stap 2.13); Refolded zijn6-Tlp3-LBD: refolded eiwitSteekproef uit stap 4.6; Niet-gecodeerde Tlp3-LBD: eiwitSteekproef verkregen in stap 5.13; Gel filtratie 1 en 2: twee breuken van de piek van de eiwitten uit de gel-filtratie kolom (stap 6.6) geëlueerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: circulair dichroïsme spectrum van gezuiverd recombinante Tlp3-LBD. Het spectrum werd opgenomen bij 25 ° C in 50 mM natriumfosfaat pH 7.4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een eenvoudige procedure voor expressie en het uiteinde van de organen van de opneming van de periplasmatische LBD van de bacteriële chemoreceptor Tlp3 wordt gepresenteerd. Voorbereiding van het pure eiwit gaat om overmatige expressie van het huisdier-plasmide-gecodeerde gen in E. coli, zuivering en oplossen van integratie-organen, uiteinde van de gedenatureerde proteïne en haar zuivering door de opeenvolgende affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie stappen. De ureum-vergemakkelijkt denaturatie- en verdunning/dialyse-gemedieerde uiteinde zijn de kritische stappen in het protocol, optimalisatie van die vaak nodig is om de juiste renaturatie van het eiwit gestort in integratie organen26.
Uiteinde van Tlp3-LBD werd bereikt op een wijze in twee stappen, eerst door verdunning van het gedenatureerde monster in een buffer met ureum, en vervolgens door het monster tegen een buffer verstoken van het dialysing. Het refolded eiwit, verkregen met behulp van dit protocol was functionele en crystallisable18,23. De onderhavige methode heeft echter enkele beperkingen. Het is algemeen bekend dat carbamylation van amino groepen treedt vaak op als eiwitten is gedenatureerd en in aanwezigheid van ureum27,28,29refolded. Dit is vanwege het feit dat de opgeloste ureum met tijd ontleedt en cyanaat30 die reageert met de eiwitten amino groepen produceert te vormen van een stabiel carbamylated product en, voor een gering gedeelte, met andere functionele groepen31, 32. de ontbinding van ureum wordt versneld onder voorwaarden van alkalische pH en hoge temperatuur. Dus, het is aangeraden om verse ureum oplossingen van ultrazuiver (> 99%) vaste reagens, en het uitvoeren van de stappen van de uiteinde/dialyse bij lage temperatuur (4 ° C)30,33, om te verminderen cyanaat vorming. Bovendien, het kiezen van de buffer met primaire amines, zoals Tris, glycine of Ammoniumbicarbonaat, voor de refolding mix is belangrijk is dat de opruiming van de geproduceerde cyanaat29,33. Andere optie is het gebruik van guanidine waterstofchloride in plaats van ureum, zoals guanidine hydrochloride is niet gemeld aan eiwitten chemisch te wijzigen.
Naast ureum, een reducerende agent (DTT of β-mercaptoethanol) is vaak nodig om solubilize integratie-organen en om te voorkomen dat niet-inheemse intra- en intermoleculaire bisulfide obligaties vorming door het behoud van de cysteïne-residuen in hun verlaagde staat van26 ,34. Tlp3-LBD heeft een intramoleculaire Zwavelbrug, en in dit protocol, 10 mM DTT werd opgenomen in de opname organen denaturatie buffer (stap 2.10) om te helpen de resuspensie van de onoplosbare eiwitten. DTT concentratie werd dan verminderd met ~ 100 vouwen door verdunning van het monster in het uiteinde van de buffer, gevolgd door de dialyse stap geleidelijk verwijderen alle DTT eiwit. Het is belangrijk op te merken dat de toepassing van deze procedure op het uiteinde van eiwitten met meerdere disulfide bindingen wellicht optimalisatie van de concentratie van zowel oxiderende en reducerende agentia (bijvoorbeeld geoxideerd en gereduceerd glutathion (GSSH/GSH), GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor cystine/cysteïne) ter bevordering van goede vorming van disulfide bruggen34,35. Bovendien, als de proteïne van belang heeft cysteines die niet bij disulfide binding vorming betrokken zijn ongepaarde, een reducerende agent moet worden toegevoegd aan alle zuivering buffers. Voorspelling van de potentiële disulfide bruggen van het aminozuur opeenvolging van een eiwit kan worden uitgevoerd met behulp van verscheidene in silico hulpmiddelen (bijvoorbeeld cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& subgroep = propt).
Het gebruik van de gepresenteerde protocol voor zuivering van verschillende eiwitten is ook waarschijnlijk nodig van de optimalisatie van de concentratie van imidazool tijdens het wassen stap 4.4. Zoals aangegeven in figuur 2B (lane geëtiketteerd IB), de geïsoleerde integratie-organen bevatte, in dit geval, overwegend de proteïne van belang. Als extra belangrijke bands zichtbaar op SDS-pagina gel van het IB-monster zijn, verhoging van de concentratie van de imidazool in stap 4.4 zal moeten verwijderen van de verontreinigingen, maar eiwit opbrengst36,37zou kunnen verminderen. Andere optie is om een lineair verloop van imidazool concentratie toepassen en bundelen van de eluted breuken die de proteïne van belang bevatten.
De laatste stap in het zuiveren, grootte-uitsluiting chromatografie, met de opdracht msiexec gelijktijdig schatten de moleculaire massa van de eluted deeltjes en ontlenen de oligomere staat van het eiwit. Schatting van de molecuulmassa door grootte-uitsluiting chromatografie is echter alleen nauwkeurig voor sferische moleculen, die is niet het geval voor veel eiwitten38,39. Kan men bepalen het eiwit molecuulmassa en oligomere staat met een hogere nauwkeurigheid met behulp van grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (SEC-MALS)40 of analytische ultracentrifugatie41. Wij hebben eerder bevestigd dat Tlp3-LBD monomeer in oplossing met behulp van de SEC-MALS analyse23, en dit resultaat overeen met de verslagen over andere dCACHE LBDs42,43 komt.
Het voorgestelde protocol, is in zijn oorspronkelijke of enigszins gewijzigde vorm, gebruikt om te refold en te zuiveren van verschillende chemoreceptor-LBDs uit de familie van de dCACHE voor X-ray kristallografische studies17,18,19, 23 , 42 , 44. deze procedure nuttig kan zijn in het algemeen voor productie van milligram hoeveelheden periplasmische LBDs van andere bacteriële chemoreceptors in de vorm van een oplosbare en crystallisable. In elk afzonderlijk geval is protocolverbetering waarschijnlijk nodig. Naast de punten hierboven besproken, optimale oplossen van integratie-organen en eiwit uiteinde kan vereisen het gebruik van wasmiddelen (b.v. SDS of N-acetyl trimethyl ammoniumchloride), additieven (bijvoorbeeld L-arginine) en aanpassing van hun concentratie en incubatie tijd in individuele stappen26,34,45,46uiteinde. Voorts de eiwitconcentratie in de refolding stap grote invloed op het refolding rendement. Het bereik van de concentraties van 1 ng mL-1 aan-1 mL 10 mg moet in het algemeen worden getest. Voor Tlp3-LBD was de optimale concentratie van eiwitten in de refolding mix 0,2 mg mL-1.
Extreem lage opbrengst van het uiteinde is meestal een teken dat de proef refolding voorwaarden verre van optimaal zijn. Men kan verwachten dat hoge opbrengst is in overeenstemming met een gevouwen proteïne, die kan worden gevalideerd met behulp van CD-spectroscopie (zoals beschreven in deze procedure). Bovendien kunnen crystallisability van het resulterende eiwit sugguest van het eiwit gevouwen staat. Anderzijds kan een functionele test (indien beschikbaar) worden gebruikt om te bevestigen dat het eiwit gevouwen is. In het geval van Tlp3-LBD, bijvoorbeeld de refolded proteïne bleek te behouden haar ligand-bindend vermogen, zoals blijkt uit isothermische calorimetrie. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Yu C. Liu voor zijn vroege werk over de Tlp3-LBD productie. Mayra A. Machuca is dank verschuldigd aan Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS voor een doctoraal beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R.
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).
