Summary
Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.
Abstract
Chemoreceptors ve yapısal çalışmaların ligand özgüllük moleküler temeli aydınlatma amaçlı doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde saf, katlanmış ligand bağlayıcı etki alanları miligram miktarda üretim tarafından kolaylaştırılabilir. Heterologously periplasmic ligand bağlayıcı etki bakteriyel chemoreceptors Escherichia coli (e.coli) sık sık ifade etmek için girişimleri kendi dahil bedenlere hedefleme neden. Burada, bir yöntem dahil organları, onun refolding ve arıtma periplasmic dCACHE ligand bağlayıcı etki Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3, örnek olarak kullanarak, protein kurtarma için sunulmaktadır. Yaklaşım ifade ilgi ile bir yarilabilir protein içerir onun6-etiketi, yalıtım ve dahil organlarının solubilisation üre-aracılı protein üre tükenmesi ve arıtma benzeşme Kromatografi ile refolding etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından takip. Dairesel dichroism spektroskopisi saf protein katlanmış durumunu doğrulamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı genellikle dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki alanından diğer bakteriyel chemoreceptors çözünür ve crystallisable miligram miktarda üretim için yararlıdır kanıtlanmıştır.
Introduction
Kemotaksis ve motilite bakteri kolonizasyonu ve ana bilgisayar1,2,3işgali teşvik ederek Campylobacter jejuni patogenezinde önemli rol oynamaya gösterilmiştir. Kemotaksis kimyasal sinyalleri tarafından güdümlü olarak bakteri büyüme için en iyi bir ortam doğru taşımak izin verir. Bu işlem chemoreceptors olarak adlandırdığı proteinler veya dönüştürücü gibi proteinler (TIPS) kümesi tarafından tanınması hücre içi ve çevresel kimyasal ipuçları içerir. Çoğu chemoreceptors proteinler membran katıştırılmış bağlayıcı etki alanı (yakın), bir transmembran ve ikincisi olan sinyal iletimi sitozolik sinyalizasyon proteinler ile etkileşim bir sitoplazmik sinyal verme etki alanı, bir extracytoplasmic ligand ile vardır kamçılı motorlar4,5,6,7.
Onbir farklı chemoreceptors C. jejuni genom4,8' tespit edilmiştir. Bugüne kadar bu chemoreceptors yalnızca bazılarını tanımlanabilecek ve Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712ve13 Tlp11 ligand özgüllük bilinmektedir. Bu türler içinde kalan chemoreceptors ve çok sayıda chemoreceptors diğer bakterilerde doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde katlanmış ve son derece saf rekombinant chemoreceptor LBDs14, üretim tarafından kolaylaştırılabilir 15 , 16. ancak, girişimleri heterologously Escherichia coli bakteri chemoreceptors periplasmic LBDs sık sık ifade etmek için neden kendi dahil organları17,18,19 hedefleme . Yine de, bu olay kolay yalıtım ve kurtarma protein el kolaylaştırabilir. Burada, protein kurtarma dahil organları, refolding ve arıtma, C. jejuni chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın bir örnek olarak kullanarak bir yöntem sunulur. Çünkü, iki bileşenli histidin kinaz ve prokaryotlar20,21, chemoreceptors bol bol bulunan algılama etki alanlarının dCACHE aile20 Tlp3-yakın ait bu örnek seçildi 22 , 23.
Bu yaklaşım, pET151/D-TOPO vektör üzerinde alarak ifade inşa bir N-terminal onun6dahil etmek için dizayn edilmiştir-etiket bir tütün tarafından takip etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi, sonraki etiketi kaldırma19. E. coli, yalıtım ve dahil organları ve üre tükenmesi tarafından refolding protein solubilisation üre-aracılı protein overexpression protokolünü açıklar. Refolding, aşağıdaki örnekte benzeşimi Kromatografi, isteğe bağlı etiket kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile tarafından saf. Saf protein katlanmış durumunu dairesel dichroism spektroskopisi kullanılarak doğrulanır. Bu daha önce yeniden elde etmek ve farklı bir chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19yakın arındırmak için geliştirilen yöntem değiştirilmiş bir sürümü var. Şekil 1' de özetlenmiştir bu yordamı, saf, etiketsiz Tlp3-yakın bakteri kültürü, 1 litre başına 10-20 mg protein saflığı verimleri > SDS-sayfa tarafından tahmini olarak % 90'ı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın
- 150 mL steril Luria-Bertani (LB) suyu 50 µg mL-1 Ampisilin ile BL21-kodon-Plus (DE3) içeren aşılamak - RIPL hücreleri ile ifade onun6pET151/D-TOPO vektör dönüşüm - Tlp3-yakın (amino asit kalıntıları 42-291), ve Bu bir shaker (yörünge çapı, 25 mm) 37 ° C'de 200 d / gecede kuluçkaya.
- 800 mL steril LB suyu ve 50 µg mL-1 Ampisilin içeren altı 2 L Erlenmeyer şişe hazırlayın. Her şişesi 20 mL adım 1.1 den elde edilen gecede kültür ile aşılamak. Onları 37 ° C'de sürekli 200 devir / dakikada 600 nm ulaşır 0.6, optik yoğunluk kadar sallayarak ile kuluçkaya.
- 1 mL şişe (uninduced denetimi örneğini), bir benchtop santrifüj (13.000 x g, 4 ° C, 10 dk) kullanarak Pelet birinden aliquot almak ve süpernatant atın. Bakteriyel Pelet sonraki SDS-sayfa analizi için-20 ° C'de depolayın.
- Protein ifade her şişeyi kültürü ile 1 mM lik izopropil β-D-thiogalactoside (IPTG) ekleyerek teşvik. Şişeler için bir ek 4 h 200 devirde bir shaker 37 ° C'de kuluçka devam edin.
- Hücreleri tarafından Santrifüjü 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika, hasat ve süpernatant atın.
Not: Bu noktada,-80 ° C dondurucu depolama içine hücre Pelet yerleştirerek yordamı duraklatılmış.
2. izolasyon ve denatürasyon dahil organlarının
- 250 mL kabı 1.5. adımda elde edilen tüm hücre topakları nakletmek ve 100 mL (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl) arabelleği A eklemek. Eğer tamamen (dondurulmuş) çözülme hücrelere izin ve Pelet resuspend. Örnek buz üzerinde aksi belirtilmedikçe tutun.
- Yüksek basınç homogeniser ile resuspended hücreleri hücreleri parçalayıcı ve tam genomik DNA kesme emin olmak için üç kez geçmek.
- Lysate, 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi 1 mL örnek süpernatant (çözünür kesir) toplamak ve -20 ° c daha sonraki SDS-sayfa analiz için saklayın. Süpernatant geri kalanı atın ve Pelet Buza koyun.
Not: Bu Pelet renk beyazdır (kahverengi gölgesinde olan kırılmamış hücrelerden ismi renkli) ve dahil organları içerir. - Dahil organları Pelet buz gibi soğuk arabellek B iyice 20 mL resuspend (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM phenylmethanesulfonyl florür (PMSF), % 1 Triton X-100). Bu solubilisation membran ve membran proteinlerinin kolaylaştırır. Resuspension yardım etmek 1-2 min için girdap.
- Örneği ' 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Pelet buz gibi soğuk arabellek B iyice 20 mL vortexing 1-2 dk. Pelet küçük parçalara ayrılır sağlamak için tüp tarafından resuspend. Damlalıklı yukarı ve aşağı Pelet resuspension yardımcı olmak için örnek.
Not: İyice organları eklenmesi kirleri ücretsiz almak için Pelet resuspend önemlidir. - 2.5 arasındaki adımları yineleyin. Süpernatant bulutlu veya renkli 2.6 ve (bu sırayla) 2.5 süpernatant kadar adımları yineleyin ise, açık ve renksiz.
- Vortexing 1-2 min için tüp tarafından Pelet buz gibi soğuk arabellek C 20 ml (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM PMSF) resuspend.
- 2.5 arasındaki adımları yineleyin.
- 25 dahil organları Pelet çözülmeye mL buz gibi denaturing arabellek D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M üre, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM PMSF) ekleyin. İyice vortexing kadar Pelet küçük parçalara ayrılır veya 1-2 min için tarafından resuspend.
- Mix süspansiyon tarafından 30-120 dk 4 ° C'de 30 RPM dönüş hızı ile eksenel dönme
- Santrifüjü 30.000 x g, 30 dk için 4 ° C de tarafından denatüre protein çözüm açıklamak, süpernatant Buza koyun ve Pelet atın.
- Bradford tahlil kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek. 24 SDS-jel analiz için bir aliquot alıp -20 ° C'de yerleştirin
Not: Bu noktada, yordamı ek-bölünmemeli örnek sıvı azot donma tarafından durduruldu ve depolama için-80 ° C'de tutun.
3. protein Refolding
- 250 mL arabelleği E (3 M üre, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.4 M L-Arginin monohydrochloride, 20 mM azaltılmış L-glutatyon, 2 mM oksitlenmiş L-glutatyon) 500 mL ölçek hazırlamak ve arabellek 4 ° c kadar serin
- Onun6içeren denatüre protein karışımı 60 mg eklemek-Tlp3-yakın 500 rpm'de arabellek karıştırarak arabellek E, 2.13-250 mL. adımda elde. Sürekli karıştırarak için 24-48 h 500 RPM ile 4 ° C'de mix refolding kuluçkaya. Bu adımda son protein konsantrasyonu 0.2 mg mL-1olduğunu.
- 7 L 8-10 L kovası A arabellekte hazırlamak ve bir sonraki adım (Adım 3.4) için 24-48 h gerçekleşecek hazırlık 4 ° C aşağı soğumaya (akış çizelgesi Şekil1 bakınız).
- Bir ~ 50 cm adet diyaliz hortumunun 28 mm şişirilmiş çapının, molekül ağırlığı kesme, 12-14 kDa 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuzu (EDTA-Na2) 200 mL içine sokmak ve gaz alev üzerinde kaynar kadar ısı. Durulama diyaliz membran ile GKD2O. 200 mL
- Diyaliz boru kapatma ile diyaliz membran bir ucunu kelepçe ve 250 mL karışımı adım 3.2 diyaliz tüp içine elde refolding transfer. Açık ucu başka bir kelepçe ile kapatın. Sızıntı yok emin olmak için membran bütünlüğünü denetleyin.
- 3.3. adımda hazırlanan tampon a önceden soğutulmuş 7 L ile diyaliz kovada diyaliz tüpü yerleştirin. Bar, karıştırma sırasında diyaliz boru dokunmayacaksın sağlanması manyetik bir heyecan yerleştirin.
- Örnek 4 ° C'de 500 rpm'de karıştırmaya devam ile dialyse ve arabellek en az dört kez bir süre 12 h içinde değiştirin. Son arabellek değiştirdikten sonra bir gecede dialyse örnek bırakın.
Not: yavaş yavaş diyaliz sırasında üre (~ 3 M) fazlalığı sağlar refold protein denatüre protein eriyik--dan kaldırılır. Ağır protein yağış diyaliz sonunda görülebilmektedir. - Ve 500 mL kabı içeriğini transfer diyaliz tüp kova çıkarın. Protein çözüm buz, aksi belirtilmedikçe tutun.
- Protein çözüm 0.43 µm gözenek boyutu membran aracılığıyla zarlarını protein var kaldırmak için 500 mL cam şişe içine filtre.
4. arıtma onun6-Metal iyon hareketli benzeşme Kromatografi kullanarak Protein öğesini
-
Ücret ve 5 mL prepacked şelat sütun equilibrate.
- Sütun bağlayan boru içinde hapsolmuş hava olduğunu kontrol ettikten bir Peristaltik pompa bağlayın.
- Sütun ile 25-50 mL GKD2O. geçirerek yıkama
- Sütun 3 mL 0.1 M NiCl2 yükleme ve sonra GKD2O. 25 mL şarj
- Sütun 25 mL (yükleme tampon, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole) arabelleği F ile equilibrate.
- Adım 3.9 arabellek F kompozisyon 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl ve 2 M imidazole hisse senedi çözümleri 2.5 mL 2.5 mL ekleyerek elde refolded protein örneği ayarlayın.
- Örnek hızı 5 mL/dak veya daha az ve atma akışı aracılığıyla sütuna (ilişkisiz proteinler) yükleyin.
- Sütun olmayan özellikle ilişkili proteinler kaldırmak ve akışı üzerinden atmak için arabellek F 50-100 mL ile yıkayın.
- Onun6elute-Tlp3-25 mL (elüsyon arabellek, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole) arabelleği G ile yakın ve (Bradford reaktifi kullanılarak belirlenen) protein içeren akış yoluyla kesirler Havuzu.
- Bradford tahlil kullanarak havuza alınan örnek protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük bir aliquot SDS-sayfa analizi ve-20 ° C'de yer almak
5. onun6-TEV proteaz (isteğe bağlı) kullanarak kaldırma etiketi
- Hazırlamak ve aşağı 4 ° C, 4 L (TEV bölünme tampon, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 (v/v) gliserol, 2 mM DTT) arabelleği H serin.
- Yaklaşık 5-7 cm diyaliz Boru kesme (çapı 2-3 cm) ve 200 mL GKD2O. bırakın
- Onun6eklemek-TEV proteaz onun için öğesini6-etiket protein 1 TEV son molar oranı 4.5. adımda hazırlanan: 8 protein.
- Bir ucunu bir Diyaliz boru kapatma ile boru kelepçe ve protein/TEV proteaz karışımı ile doldurun. Diğer ucunu kapatın ve hiçbir sızıntı olduğundan emin olun.
- Diyaliz öncesi soğutmalı 4 L arabelleği H (Kimden adım 5.1) içine tüp ve sürekli ile 4 ° C'de kuluçkaya yer 2 h. değişiklik arabellek karıştırma ve diyaliz gecede TEV-aracılı bölünme tepki tamamlamak izin vermek için devam edin.
- Bu arada, hazırlamak ve serin (4 ° C) 4 L arabellek ben (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 (v/v) gliserol) ertesi gün için hazırlık.
- Gecede diyaliz sonra 5.6 adımda hazırlanan tampon tampon Döviz ve başka bir 1-2 h 4 ° C'de dialyse
- Tüp bir ucunu Açıl ve protein çözüm bir 50 mL Falcon tüp transfer tüp diyaliz kova çıkarın. Çözüm 0.43 µm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre ve aksi belirtilmediği sürece buz üzerinde tutun.
- Örnek hacmi ölçmek ve arabellek F kompozisyon Tris, NaCl ve imidazole konsantrasyon ayarlayın (örneğin protein çözüm arabelleği J 25 mL için eklemek 0.25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl ve 2 M imidazole 0.25 mL).
- 5 mL HiTrap şelat HP sütun 4.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Örnek sütuna yük (akış oranı: 5 mL/dak) ve akış-etiketsiz Tlp3-yakın (artıkları 42-291) içeren aracılığıyla, toplamak. Uncleaved protein, i ciddi onun6-etiket ve onun6- TEV sütun tarafından korunur.
- Tüm etiketsiz protein akışı ve eluate toplamak izin vermek için sütun ile 5 mL arabellek F (yükleme arabellek) yıkayın.
- Havuz eluate 5,11 ve 5.12 adımlarda elde edilen ve protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük bir aliquot almak ve SDS-sayfa analizi için-20 ° C'de saklayın.
6. boyut-dışlama Kromatografi (jel filtrasyon) Tlp3-yakın
- 1 L (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) arabelleği A hazırlamak ve 0.43 µm membran kullanarak filtre uygulayabilirsiniz.
- Arabellek A 4 mL/dk akış hızında bir 26/60 boyutu-dışlama sütun equilibrate.
- 3-4 mL 15 mL santrifüj yoğunlaştırıcı bir 10 kDa kesme ile (4 ° C, 4.000 x g) kullanarak bir birimi 5.13. adımda elde edilen protein örnek konsantre.
- Santrifüjü 13.000 x g, zarlarını protein var kaldırmak 30 dk için 4 ° C de tarafından protein çözüm açıklamak.
- Örnek önceden dengelenmiş 26/60 jel filtrasyon sütuna yerleştirin. Kromatografi arabellek A 4 mL/dak monitör UV izleme akış hızında gerçekleştirir. Tlp3-yakın 210-220 mL saklama ses seviyesinde elutes. Tepe kesirler havuz.
- Protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük SDS-sayfa analizi için aliquot al.
7. SDS-sayfa analiz Protein arıtma çeşitli aşamalarında toplanan örnekleri
- SDS-sayfa çalışan arabelleği (arabellek J) 1 L hazırlamak, 25 mM içeren Tris, 250 mM glisin pH 8.3 ve % 0.1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS).
- 5 SDS-sayfa yükleme arabellek (arabellek K) x 10 mL hazırlamak, 0.25 M Tris-HCl pH 6.8 içeren, mavi (w/v) % 10 SDS, % 50 (v/v) gliserol, 1 mM DTT ve %0,05 bromophenol.
- İzin arıtma farklı adımları sırasında toplanan aliquots (adımlar 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6,6) çözülme.
- Her örnek için toplam protein 15 µg SDS-sayfa yükleme tampon ve 10 µL GKD2O. için ses seviyesini 5 x 2 µL ile karşılık gelen birim mix
- Örnekleri 5-10dk için 95 ° c ısı, onları 10.000 x g 30 s ve transferi de spin temiz bir tüp içine örnekleri.
- Jel ayıran % 15 polyacrylamide kullanarak bir SDS-sayfa jel hazırlamak (5 mL: 2.5 mL %30 (w/v) BIS-Akrilamid, 1.2 mL için 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1.2 mL GKD2O, 50 µL (w/v) SDS % 10, 50 µL % 20 (w/v) amonyum persülfat (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) ve % 5 polyacrylamide jel istifleme (2 mL: 340 µL % 30 (w/v) BIS-Akrilamid için 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL GKD2O, 20 µL %10 (w/v) SDS, 20 µL %20 (w/v) APS, 2 µL TEMED).
- Elektroforez cihazları monte ve SDS sayfa arabellek üreticisinin tavsiye başı olarak çalıştıran x 1 ile doldurun.
- Protein molekül ağırlığı marker ve 7,5 adımda hazırlanan örnekleri yükleyin. 25 sabit bir akım, Elektroforez gerçekleştirmek anne.
- Jel bir konteyner içine aktarmak ve GKD2O. eklemek 150 mL % 25 (v/v) isopropanol, % 10 (v/v) Asetik asit ve %0.03 (w/v) parlak mavi R-250 içeren çözüm boyama Coomassie mavi ile durulayın. Kapsayıcı bir yatay döndürme platform, oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirin.
- Jel GKD2O ile durulayın ve %5 (v/v) metanol ve %7 (v/v) Asetik asit içeren destaining çözüm yerleştirin. Yatay döndürme platformu için 1 h kullanarak karıştırma sırasında destain.
- Jel görüntü ve analiz.
8. dairesel Dichroism (CD) spektroskopi analiz ikincil yapısı refolded saf protein
- 0.5 - 1 mg diyaliz tüp içine adım 6,6 elde refolded protein aktarmak ve 5 4 ° C'ye precooled L L tamponunun (50 mM sodyum fosfat pH 7,4), içeren bir Diyaliz kova yere koyun Sürekli karıştırarak ile 4 ° C'de örnek dialyse ve en az 3-4 arabellek değişiklikleri gerçekleştirmek üzerinde 2-4 h gecede dialyse örnek ayrılmadan önce.
- Dialysed protein çözüm 10 kDa kesme santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak 0.06 mg mL-1 için konsantre.
- Santrifüjü 13.000 x g, 30 dk için 4 ° C de tarafından çözüm açıklamak.
- Örnek bir spectropolarimeter 20 nm min-1tarama oranı ile kullanarak 200-260 nm dalga boyu aralığı boyunca 25 ° c kadar UV CD spektrum kaydedin. Diyaliz arabellek boş bir denetim olarak kullanın. Nüsha kayıt tekrarlayın ve ortalama spektrum oluşturmak.
- İkincil yapı içeriğini hesaplamak CD deconvoluting tarafından25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk) DichroWeb CDSSTR programdan kullanarak spectra sever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın protein ifade dahil organlarında sonuçlandı. Onun6yaklaşık 100 mg 1 l bakteri kültürü 2,13 adımda hesaplanan ifade verim yapıldı-Tlp3-yakın dahil gövdelerinde yatırılır. Burada açıklanan ve şekil 1' de, resimli protein yalıtım, solubilisation dahil organları, protein refolding ve arıtma, benzeşim Kromatografi, etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile özetlenebilir ve saf, etiketsiz Tlp3-yakın bakteri kültürü 1 litre başına 10-20 mg verimleri.
Jel-filtrasyon sütundan bir 220 mL (şekil 2A) saklama birime karşılık gelen bir tek, simetrik en yüksek olarak eluted protein. Günlük (MW) saklama birimi karşı bir kalibrasyon arsa kullanarak hesaplama Moleküler ağırlığı (MW) (Vsaklama (mL) 549.3-73.9 x log(MW)) elde edilebilir EMBL Protein ifade ve arıtma çekirdek tesis website (http://www.embl.de/ = pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), 29 kDa değerini vermiştir. Bu değer çok önerilen amino asit dizisi (28,7 kDa), hesaplanan bu Tlp3 yakın bir monomer çözüm yakındır yapıldı.
Arıtma işlemi değerlendirmek için farklı adımlar toplanan örnekleri SDS-sayfa analizi ile değerlendirilmiştir. Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi ağırlıklı olarak yer alan onun6dahil organları-Tlp3-yakın. Bu proteinin az miktarda da indüklenen kültür çözünür kısmını mevcut (IPTG(+)) ve uninduced kültür (IPTG(-))-T7 polimeraz sızan ifadesi sonucunda anlaşılan. Onun6-Tlp3-yakın göç polyacrylamide jel ile amino asit dizisi (31,8 kDa) hesaplanan değeri yakındır 28 kDa belirgin bir molekül ağırlığı üzerinde. Onun6-tag kaldırma, benzeşim Kromatografi ve son derece saf protein vermiştir filtrasyon adımları jel (> % 90 elektroforetik homojenliği).
Bu yordamla elde edilen protein olduğunu onaylamak için katlanmış, ikincil yapı onun6-Tlp3-yakın CD spektroskopisi tarafından değerlendirilmesi. α-sarmal ve β-yapraklık içerikten CDSSTR kullanarak CD spektrum (şekil 3) tahmini % 31 α ve % 23 β değerleri verdi. Bu değerler üre denatüre dahil vücutlarından kurtarılan protein katlanmış belirten yakın Jpred3 server (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (% %37 26 α ve β), kullanarak dizi analizi tahmin edildi.
Şekil 1: sunulan yönteminin şematik. Rekombinant onun6-Tlp3-yakın olduğunu indüksiyon ile IPTG (bakınız Bölüm 1) üzerine E. coli olarak expressd. 4 h ifade sonra bakteri hücreleri ve hasat (bakınız Bölüm 2) lysed. Dahil organları (IB) içeren çözünmez kesir membran ve membran proteinleri kirleri, sonra IB yüksek konsantrasyon (bakınız Bölüm 2), üre içeren bir arabellek içinde çözünmüş kaldırılması için yıkanır. Onun6-Tlp3-yakın seyreltme arabellek ayrıntılı diyaliz kademeli üre kaldırma (Bölüm 3) için ve ardından E içine tarafından refolded. Onun6refolded-Tlp3-4 bölümde açıklandığı gibi yakın immobilize metal iyon benzeşme Kromatografi tarafından sonra saf. Onun6-etiket TEV proteaz (Bölüm 5) kullanarak kaldırılır. Etiketsiz Tlp3-yakın konsantre ve daha fazla jel filtrasyon Kromatografi (Bölüm 6) tarafından arıtılmış. SDS-sayfa analizi için örnekleri topluluğu için puan ile gösterilir *. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: rekombinant Tlp3-yakın saflaştırılması. (A) etiketsiz Tlp3-yakın bir Superdex 200 HiLoad 26/60 jel filtrasyon sütun boyutu-dışlama Kromatografi iz. 220 mL tutma hacmi ile eluted protein. (B) % 15 SDS-sayfa Coomassie mavi lekeli jel azaltılmış. M: protein molekül ağırlığı işaret; IPTG (-): uninduced denetimi örneğini adım 1.3 toplanan; IPTG (+): çözünür kesir sonra IPTG indüksiyon (2.3 adımda toplanan); IB: izole dahil organları (Adım 2.13); Onun6refolded-Tlp3-yakın: refolded protein örnek adım 4,6; Etiketsiz Tlp3-yakın: 5.13. adımda elde protein örnek; Filtrasyon 1 ve 2 jel: jel-filtrasyon sütundan (adım 6,6) eluted protein pik üzerinden iki kesirler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: dairesel dichroism spektrumu saflaştırılmış rekombinant Tlp3 yakın. Spektrum 50 mM sodyum fosfat pH 7.4 25 ° c kaydedildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İfade ve bakteriyel chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın dahil vücutlarından refolding için basit bir yordam sunulur. Saf protein hazırlanması içerir E. coli, arıtma ve solubilisation dahil organlarının evde beslenen hayvan-plazmid kodlu genin aşırı ifade denatüre protein ve onun arıtma ardışık benzeşimi tarafından refolding ve Boyut-dışlama Kromatografi adımları. Denatürasyon üre kolaylaştırdı ve seyreltme/diyaliz-aracılı refolding protokolündeki optimizasyonu hangi kez dahil organları26yatırılır protein uygun renaturation emin olmak için gerekli kritik adımlardır.
Tlp3-yakın refolding iki aşamalı bir şekilde ilk denatüre örnek üre içeren bir arabelleğe sulandrarak ve sonra örnek bir arabellek yoksun bu karşı dialysing tarafından sağlanır. Bu iletişim kuralı kullanılarak elde refolded protein işlevsel ve crystallisable18,23olduğunu. Ancak, sunulan yöntem bazı sınırlamalar vardır. İyi bilinen protein denatüre ve huzurunda üre27,28,29refolded o carbamylation amino gruplarının kez oluşur. Çözünmüş üre zamanla çözer ve istikrarlı carbamylated ürün oluşturmak için protein amino grupları ile ve diğer fonksiyonel grupların31, ile küçük bir ölçüde tepki cyanate30 üretir nedeniyle gerçeğini bu 32. alkali pH ve yüksek sıcaklık koşullar altında üre Ayrışma hızlandırdı. Yani, bu taze üre çözümlerinden ultrasaf yapmak tavsiye edilir (> % 99) katı reaktif ve cyanate oluşumunu azaltmak için düşük sıcaklık (4 ° C)30,33refolding/diyaliz adımları gerçekleştirin. Ayrıca, Birincil aminler, Tris gibi içeren arabellek seçmek glisin veya refolding karışımı için amonyum bikarbonat üretilen cyanate29,33atılmasını sağlamak önemlidir. Guanidin hidroklorid kimyasal olarak proteinler değiştirmek için rapor edilmemiştir gibi diğer seçenek üre yerine, guanidin hidroklorür kullanmaktır.
Üre, ek olarak bir indirgeyici (DTT veya β-mercaptoethanol) sık sık dahil organları solubilize için gereklidir ve yerel olmayan içi - ve cins disülfür önlemek için onların azaltılmış devlet26 sistein kalıntıları tutarak oluşumu Tahvil ,34. Tlp3 yakın olan bir intramolecular disülfür bağ ve bu protokol, 10 mM çözünmez protein DTT resuspension yardım etmek için dahil organları denatürasyon ara belleğe (Adım 2.10) dahil. DTT konsantrasyon sonra arabellek, yavaş yavaş tüm DTT kaldırmak için diyaliz adım gelir refolding protein içine örnek sulandrarak ~ 100 kat tarafından düşürüldü. Not Bu yordam uygulanması proteinler birden çok disülfür bağları ile refolding için oksitleyici ve azaltılması(okside ve glutatyon (GSSH/GSH), azaltılmış ajanlar konsantrasyon duruma getirilmesi gerekebilir önemlidir GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor Sistin/sistein) arasında köprü görevi gören34,35disülfür uygun oluşumu teşvik etmek. Ayrıca, eğer faiz protein disülfit bağı oluşumu söz konusu değil katıldı unpaired, bir indirgeyici tüm arıtma arabellekleri için eklenmelidir. Tahmin potansiyel disülfür köprü bir proteinin amino asit dizisi üzerinden gerçekleştirilen çeşitli silico araçlarını kullanarak (örneğin cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& alt grup e =).
Sunulan Protokolü'nün kullanılmasına arıtma farklı proteinlerin imidazole konsantrasyon çamaşır adımı 4.4 duruma getirilmesi gerektiren büyük olasılıkla da. Şekil 2B içinde gösterildiği gibi (lane) IB etiketli, izole dahil cesetleri, bu durumda, ağırlıklı olarak faiz protein içeriyordu. Ek önemli bantları SDS jel adım 4.4 imidazole konsantrasyonu artan IB örnek kirletici kaldırmak için gerekli ama protein verim36,37azaltabilir sayfasında görünür durumdaysa. Diğer seçenek imidazole konsantrasyon doğrusal degrade uygulayın ve faiz protein içeren eluted kesirler havuz etmektir.
Arıtma, boyut-dışlama Kromatografi, son adımında aynı anda eluted parçacıkların molekül ağırlığı tahmin ve protein oligomeric durumunu türetmek için araçlar sağlar. Ancak, tahmini boyutu-dışlama Kromatografi tarafından molekül ağırlığı sadece hangi birçok protein38,39için durum böyle değil küresel moleküller için doğrudur. Bir belirleyebilir protein molekül ağırlığı ve oligomeric devlet boyutu-dışlama Kromatografi kullanarak yüksek doğruluk ile birleştiğinde çok açılı ışık saçılma (sn-MALS)40 ya da analitik ultrasantrifüj41. Daha önce Tlp3-yakın sn-MALS analiz23kullanarak çözümde monomeric ve bu sonuç ile diğer dCACHE LBDs42,43raporlarda tutarlı olduğunu doğruladı.
Sunulan protokolü, orijinal ya da biraz değiştirilmiş şekliyle, refold ve x-ışını crystallographic çalışmaları17,18,19, dCACHE aileden birkaç chemoreceptor LBDs arındırmak için kullanılmıştır 23 , 42 , 44. bu yordam genellikle diğer bakteriyel chemoreceptors çözünür ve crystallisable periplasmic LBDs miligram miktarda üretim için yararlı olabilir. Ayrı her durumda, büyük olasılıkla protokol optimizasyon gereklidir. Yukarıda tartışılan puan ek olarak dahil organları ve protein refolding en iyi solubilisation deterjanlar (örneğin SDS veya N-asetil trimetil amonyum klorür), kullanmanızı gerektirebilir katkı maddeleri (örneğin L-Arginin) ve adımları26,34,45,46refolding birey konsantrasyon ve kuluçka zamanında uyum. Ayrıca, protein konsantrasyonu refolding adımda refolding verim büyük ölçüde etkiler. 10 mg mL-1 için 1 ng mL-1 gelen konsantrasyonları aralığı genellikle test edilmelidir. Tlp3-yakın için protein refolding karışımında en iyi konsantrasyon 0.2 mg mL-1oldu.
Son derece düşük refolding verim genellikle deneme refolding koşulları çok uzak en iyi durumda bir işarettir. Bir o yüksek verim CD spektroskopisi (Bu yordamda belirtildiği gibi) kullanarak onaylanabildiğini katlanmış bir protein ile tutarlıdır bekleyebilirsiniz. Ayrıca, crystallisability sonuç protein protein katlanmış devlet sugguest olabilir. Alternatif olarak, bir işlev tahlil (varsa) protein katlanmış onaylamak için kullanılabilir. Tlp3-yakın olması durumunda, örneğin, refolded protein-ligand taşıması kabiliyetini korumak için izotermal Kalorimetre tarafından gösterildiği gibi gösterildi. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Yu C. Liu Tlp3-yakın üretim üzerine erken çalışmaları için teşekkür ediyoruz. Mayra A. Machuca Paraguay Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS doktora burs için borçlu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).
