Summary
Vlekken van DNA moleculen voor fluorescentie microscopie kan een wetenschapper om ze te bekijken tijdens een experiment. In de methode die hier gepresenteerd, zijn de DNA moleculen vooraf gekleurd met fluorescente kleurstoffen en verteerd met methylation en niet-methylering gevoelige restrictie-enzymen.
Abstract
Visualisatie van DNA voor fluorescentie microscopie maakt gebruik van een verscheidenheid van kleurstoffen zoals cyanine kleurstoffen. Deze kleurstoffen worden gebruikt vanwege hun hoge affiniteit en de gevoeligheid voor DNA. Om te bepalen als de DNA moleculen volle lengte na de voltooiing van het experiment zijn, is een methode nodig om te bepalen als de gekleurde moleculen volle lengte zijn door de spijsvertering van DNA met enzymen van de beperking. Gekleurd DNA kan echter de enzymen, remmen, zodat er een methode om te bepalen welke enzymen die men voor fluorescerende gebruiken kan gekleurd DNA nodig is. Bij deze methode is DNA gekleurd met een cyanine kleurstof 's nachts om de kleurstof en DNA aan equilibreer. Volgende, Gebrandschilderd DNA wordt verteerd met een restrictie-enzym, geladen in een gel en electrophoresed. De experimentele DNA verteren bands worden vergeleken met een verteren in silico om te bepalen van de activiteit van het beperkingsenzym. Als er evenveel bands zoals verwacht, dan is de reactie is voltooid. Meer bands dan verwacht geven van gedeeltelijke vertering en minder banden geven onvolledige spijsvertering. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en het gebruik van apparatuur die een wetenschapper nodig voor een restrictie-enzym hebben zou assay en gel elektroforese. Een beperking van deze methode is dat de enzymen beschikbaar voor de meeste wetenschappers verkrijgbare enzymen zijn; enzymen van de beperking kan echter worden gebruikt.
Introduction
De TOTO-serie (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 en BOBO-3; Tabel 1) wordt gebruikt in een breed scala aan experimenten waarbij de visualisatie van DNA vereist1,2,3,4,5,6,7, is 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. de cyanine dimeer familie is veel gebruikt vanwege hun quantumrendement, gevoeligheid, en met hoge affiniteit voor DNA moleculen18,19,20. Cyanine dimeer kleurstoffen hebben grote selectiviteit voor dubbele gestrande DNA en bij tussenliggende hebben een 100 tot 1000-voudige toename van fluorescentie21. Pyridinium kleurstoffen (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 en TOTO-3) hebben een kortere golflengte van de emissie dan hun quinolium kleurstof (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 en POPO-3) tegenhangers (tabel 1)22. Ook het quantumrendement voor cyanine Dimeren tussenliggende in DNA is hoog (0.2 - 0.6)22. Met behulp van een enzym te bepalen van het profiel van de methylering van een DNA-molecuul2 of rekken23 van een DNA molekuul al gekleurd met fluorescente kleurstof vereist echter een methode om te bepalen welke enzymen zal gebeitst DNA verteren. Elk type kleurstof die intercalates in DNA of een enzym dat een waarneembaar patroon van het DNA-substraat geeft kan worden gebruikt voor deze methode.
Meng et al. bepaald eerst het tarief van de spijsvertering van DNA van de prestained door middel van de Elektroforese van het gel met behulp van een verscheidenheid van verschillende kleurstoffen24. Maschmann et al. dook dieper kijken naar de TOTO-familie van kleurstoffen. Beide bepaald het percentage van de spijsvertering van gebeitst DNA te zien als DNA met een bepaalde kleurstof gekleurd met een restrictie-enzym25kan worden verteerd. Andere methoden bestuderen bindende gevolgen van kleurstoffen tussenliggende met DNA met optisch pincet26 of27van de NMR. Beide methoden vereist gespecialiseerde apparatuur; Overwegende dat met deze methode kunt apparatuur die de meeste moleculaire biologie labs hebben om te bepalen of een kleurstof interfereert met de spijsvertering van een restrictie-enzym.
Bovendien, in de andere methoden voor het meten van de lengte van een bepaalde molecule, heeft optische mapping langwerpige onbevlekt DNA moleculen op een oppervlak en verteerd van DNA om te bepalen van het stuk en de grootte van fragmenten. Bekomt van kleurstof is aangetoond dat het verhogen van de contour lengte van fluorescently gebeitst DNA moleculen en afhankelijk van de kleurstof gebruikt, de contour lengtes zijn verschillende21. Deze methode is gebruikt in een verscheidenheid van genoom1,3,4,6,13,28,29,30, 31. echter moleculen mochten vooraf gebeitst, afhankelijk van de kleurstof en enzym, het enzym kan niet zitten kundig voor snijden van DNA met een bepaalde kleurstof gekleurd. Deze methode bepaalt daarom als DNA met een bepaalde kleurstof gekleurd met een enzym kan worden verteerd. Bovendien, afhankelijk van de concentratie van de kleurstof en de kleurstof gebruikt, de mobiliteit van het DNA zal banden in een gel migreren langzamer dan de inheemse DNA als gevolg van de gedeeltelijke afwikkeling van de DNA-ruggengraat ruimte te maken voor de kleurstof moet worden ingevoegd tussen basenparen32 .
Echter soms deze kleurstoffen kunnen gedeeltelijk of volledig remmen de werking van bepaalde enzymen van de beperking7,24. Dit is vermoedelijk te wijten zijn aan een structurele verandering in het DNA veroorzaakt door de bevestiging van de fluorescerende kleurstof, die eventueel kunnen verhinderen dat het enzym herkennen de specifieke volgorde. Invloed van deze kleurstoffen op restrictie-enzymen kan helpen bij experimenten waar de methylering profiel of het traject van gebeitst DNA vereist is.
In onze werkwijze, was DNA gekleurd met een fluorescerende van belang en verteerd met een restrictie-enzym. Vervolgens DNA was electrophoresed op een gel, beeld, en de snelheid van de spijsvertering restrictie-enzym werd gemeten. De enzymen van de beperking werden gekozen op basis van de uitgesneden patroon op een gel. Te veel bands veroorzaakt overlapping van DNA bands en te weinig bands niet geven een totaalbeeld van de DNA-molecule. Er is een sweet spot te kunnen bepalen van het profiel van de verteerd DNA-molecule; Daarom zal het afhangen van de DNA gebruikt en het enzym. Een voordeel van deze methode is de eenvoud; zij vereist alleen apparaten die worden gebruikt in een beperking spijsvertering en gel elektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Buffers, kleurstoffen en Agarose Gel
-
Voorbereiden op de volgende oplossingen kleuring van DNA of de vertering van gebeitst DNA.
- Bereiden 1 x TE (Tris-HCl en ethyleendiamminetetra zuur; EDTA) buffer met behulp van 10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA in een volumetrische maatkolf of gegradueerde cilinder. Bewaren bij kamertemperatuur (18-25 ° C).
- Maken van de hoeveelheden van elke kleurstof: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabel 1). Pipetteer 4 µL van 1 mM kleurstof in een donker amberkleurig of 1,5 mL tube zwart en voeg 36 µL voor 1 x TE, meng met de pipet; Deze concentratie is een oplossing kleurstof 100 µM (40 totaal µL). Voltooi deze stap voor elke kleurstof. Bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Vermijd blootstelling van de kleurstof aan het licht om photobleaching of aantasting van de kleurstof te voorkomen. - Bereiden buffer 1 met behulp van 10 mM Tris-propaan-Bis-HCl, 10 mM MgCl2en 100 µg/mL bovien serumalbumine (BSA). Bereiden van buffer 2 met behulp van 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2en 100 µg/mL BSA. Buffer 3 met 50 mM Kaliumacetaat, 20 mM Tris-acetaat, 10 mM magnesium acetaat en 100 µg/mL BSA voor te bereiden. Elk enzym vergt één van deze specifieke buffers te functioneren.
-
De volgende oplossingen voorbereiden gelelektroforese.
- Maak een 6 x laden kleurstof door het combineren van 0,25% bromophenol blauw, 0,25% xyleen cyanol, 15% densiteitgradiënt in dH2O. winkel bij kamertemperatuur.
- Om een 0,7% agarose gel, weeg 0,07 g van hoge gelerend temperatuur (HGT) agarose in een conische kolf, voeg 100 mL voor 1 x TAE buffer en een omgekeerde bekerglas plaats op de top van de kolf.
- Verwarm de oplossing op een hete plaat tot belletjes te vormen aan de onderkant van de kolf en zweven naar de top beginnen.
- Verwijder de oplossing uit de hete plaat, laat de oplossing afkoelen totdat de kolf kan worden aangeraakt met een blote hand, en giet de gel in een mal gel 24,5 x 21.8 cm met een kam gel om te maken van putten.
- Bubbels in de buurt van de kam verwijderen of op het oppervlak van de gel door knallen ze met een pipet tip en laat de gel te stollen gedurende ten minste 15 minuten. Dit kan worden opgeslagen in de koelkast (4 ° C), gewikkeld in plasticfolie 1 week om te voorkomen dat het drogen van de gel of besmetting. Raadpleeg voor meer informatie over het uitvoeren van een gel Lee et al. 33 .
Opmerking: Gebruik een gel kam met 30 individuele wells. Elk moet goed 4.5 mm breed met een diepte van 2 mm. De hoogte van de put zal afhangen van de hoeveelheid gel gegoten in het vak.
- Bereiden 1 x TAE (Tris - acetaat - EDTA) buffer met 40 mM Tris-HCl, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA. Bewaren bij kamertemperatuur (18-25 ° C).
2. voorbereiding van gebeitst DNA
-
Vlek lambda DNA (300-800 ng) met behulp van verschillende aliquots van kleurstoffen. Elke kleurstof (tabel 1) zal hebben zes verschillende concentraties getest, voor een totaal van 48 reacties per restrictie-enzym. Het volgende proces schetst een set up voor 1 reactie (Figuur 1).
- Lambda DNA met 1 x TE 100 verdund ng / µL. winkel in 4 ° C. Maak een oplossing met totaal volume van 300 µL.
- Vlek unmethylated lambda DNA. Voor elke band verwacht van de digest, schatten 75-100 ng/band. Toevoegen van de juiste hoeveelheid kleurstof tot concentraties van 1.9 µM 3,8 µM, 19.4 µM, 32.2 µM, 48.3 µM, 63,5 µM / 100 ng van DNA.
- Na een nacht bebroeden (15 h - 18 h) bij 4 ° C.
- Laat een reactie onbevlekt om te fungeren als een controle-25.
Opmerking: Gebruik unmethylated DNA voor de reactie van de spijsvertering. Methylation gevoelige enzymen gemethyleerd provincies in DNA kunnen niet knippen en zal een verschijning van een onvolledige vertering.
3. voorbereiding van de restrictie-enzym-Assay
-
Digest gekleurd DNA met een restrictie-enzym om te bepalen als dat enzym prestained DNA (Figuur 1) kan verteren.
- De volgende dag, Voeg 20 U van restrictie-enzym, 3 µL van de passende buffer (tabel 2), en die zijn gedistilleerd, gesteriliseerde met autoclaaf en gefilterd water voor een totaal van 30 µL. Voor elke reactie enzym door de buffer met de hoogste efficiëntie van snijden, die kan worden gevonden op de website van de fabrikant te kiezen.
- Plaats de reacties in een bad van water op de temperatuur van optimale enzymatische activiteit, vermeld in tabel 2 voor de 6 enzymen gebruikt in Maschmann et al.., voor 2-4 h (tabel 2)25.
- Zet de reactie stop door toevoeging van 2 µL van 0.5 M EDTA pH 8,0.
4. Electroeluting DNA in een Agarose Gel bevlekt
- De kanten van de mal gel 24,5 x 21.8 cm (stap 1.2.2) verwijderen en plaats de gel in het vak van de Elektroforese van het gel. Giet 2.5 L 1 x TAE buffer in het vak. Verwijder voorzichtig de gel kam van de gel, zodat de putten toegankelijk33 zijn.
- Pipetteer de restrictie-enzym reacties op een plastic folie en combineren van elke reactie met 6 x laden kleurstof. Voeg 1 µL van 6 x laden kleurstof per 5-6 µL van DNA oplossing (1 x) voor elke reactie-oplossing. Pipetteer vervolgens de reacties (met de laden kleurstof, < 18 µL) in de putjes.
- Meng 1 µL van 1 kb ladder, 9 µL voor 1 x TE en 2 µL van 6 x laden kleurstof. Laden oplossing in de putten die flank van de andere oplossingen.
- Dekking van de gel-doos met donker blauw of zwart papier of stof. De gel-box aansluiten op een stroomvoorziening, het instellen van de voeding tot 30 V, en voer het 's nachts (15-20 h). De lichten uit te schakelen terwijl de gel wordt uitgevoerd, om te voorkomen dat photocleavage van de gelabelde DNA.
- De volgende ochtend schakelt u de stroomvoorziening. Neem de gel met behulp van de lade en het overbrengen van een container met 45 µL ethidiumbromide en 1 L voor 1 x TAE buffer. Bewaar de verpakking bij kamertemperatuur in het donker of voorblad in folie om te voorkomen dat blootstelling aan licht. Laat gel vlek gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur.
Let op: Gebruik van ethidiumbromide met handschoenen en veiligheidsbril dragen. Bij het reinigen van de container die ethidium bromide oplossing en de gel weg te gooien, raadplegen uw Staten verwijdering richtlijnen om te bepalen hoe om te gaan met gebruikte ethidiumbromide; Bovendien kunnen andere vlekken worden gebruikt in plaats van ethidiumbromide.
5. beeldvorming van het Agarose Gel
- Plaats de gel op de top van een blauwe lichte transilluminator, die maximale lichtopbrengst tussen 400-500 nm uitzendt. Fotograferen met de camera aan het station is gekoppeld.
Let op: Zorg ervoor dat het gebruik van de cover voor de verlichter en zet op beschermende bril vóór het inschakelen van de lichtbron.
Opmerking: Deze stap kan ook worden ingevuld met behulp van een UV-lichtbron of standaard gel scanner. - Bekijk de foto's in ImageJ door het bestand naar de statusbalk ImageJ te slepen en de afbeelding zal opduiken.
- De spijsvertering tarief voor het experiment bepalen door het vergelijken van de bands op de gel om de verwachte in silico gel patroon. Om te bepalen van de snelheid van de spijsvertering, wordt het aantal experimentele bands gedeeld door de verwachte aantal DNA banden24,25. Als de experimentele verteerd DNA band patroon het verwachte patroon heeft, bedraagt de spijsvertering 1. Als het patroon meer fragmenten heeft dan verwacht, is de snelheid van de spijsvertering groter dan 1. Als het patroon minder fragmenten dan verwacht heeft verloopt de spijsvertering minder dan één.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te bepalen dat als een intercalating kleurstof zal van invloed zijn op een restrictie-enzym DNA verteren, de juiste volgorde van stappen die moet worden gevolgd (Figuur 1). Zodra DNA is gekleurd en verteerd met een bepaald enzym, kan een beeld van de gel worden genomen om te bepalen van het aantal fragmenten en hun grootte (Figuur 2). Om te bepalen van de efficiëntie van het enzym, het totale aantal verwachte zichtbaar bands gedeeld door het aantal zichtbare banden. Enzym-efficiëntie geëvenaard eenheid, als het aantal banden verwacht en gezien match. Als er meer bands op de gel dan verwacht, wordt de waarde groter is dan één en geeft gedeeltelijk verteerd reacties. Als er minder banden dan verwacht, dan is de waarde is minder dan één, waarin onvolledige spijsvertering. In Figuur 2a, stegen 3 en 4 Toon de mobiliteit van de bands is gedaald, waardoor de bands te verschuiven naar de putten. In rijstroken 1 en 2, het bedrag van de kleurstof heeft geen invloed op de mobiliteit merkbaar, zodat de bands overeenkomen met het besturingselement. In Figuur 2atonen rijstroken 5 en 6 meer banden dan het besturingselement, zodat betekent dit gedeeltelijke vertering. Dat wil zeggen, de kleurstoffen beïnvloed het splijten van het DNA op de site van de erkenning voor dat enzym. In Figuur 2bverwacht alle bands worden gezien voor alle concentraties die kleurstof, zodat de kleurstof geen invloed op de spijsvertering van DNA. Figuur 2 c nummers de mobiliteit verschuift met gekleurde sterretjes.
Als kleurstof verhoogt de concentratie voor kleurstoffen met -1, de mobiliteit vermindert. Om te bepalen van de geschatte omvang van de bands, een controle nodig is om te weten waar de oorspronkelijke DNA-moleculen worden verwacht in vergelijking met de gekleurde DNA (Figuur 2a). Voor kleurstoffen met -3, deed de mobiliteit niet verminderen in de mate dat-1 kleurstoffen deed, dus het was gemakkelijker om te bepalen van de grootte van het fragment (Figuur 2b). Het verschil van de mobiliteit is te wijten aan het soort kleurstof gebruikt, zoals te zien in Maschmann et al. 25. De variantie van deze kleurstoffen wordt gezien als het gevolg van de structuren van de kleurstoffen. De linker tussen de aromatische groep voor kleurstoffen -3 was langer dan -1. De kleurstoffen mogelijk iets anders vanwege het verschil in de grootte van de linker, wat kan verklaren waarom de mobiliteit verschuiving is minder voor-3 kleurstoffen afwisseling.
Als er geen DNA, of de DNA-bands zeer vaag in de gel zijn, is verhoging van de concentratie van DNA vereist. Echter als de DNA-concentratie stijgt, zal dan de hoeveelheid kleurstof nodig ook toenemen om de juiste concentratie van de kleurstof te DNA verhouding.
Figuur 1 : Een schematische voorstelling van de stappen nodig waarbij verteren fluorescerende label DNA moleculen. DNA en YOYO-1, of een andere kleurstof uit de TOTO-serie, is toegevoegd aan een zwarte buis en uitgebroed overnachting (O/N; 15-20 h). Een restrictie-enzym wordt toegevoegd aan een buis; het is geplaatst in een incubator, op de gewenste temperatuur, voor 2-4 h (tabel 2). Monsters in een ondergedompeld 0,7% agarose gel gemaakt met 1 x TAE buffer geladen. Donker gekleurd papier dekt die het vak gel en de lichten zijn uitgeschakeld, terwijl de gel is liep 's nachts om te voorkomen dat photocleavage van de kleurstof. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Beperkingsspijsvertering van DNA tussenliggende met een cyanine dimeer kleurstof. (een) Lambda DNA is gekleurd met verschillende concentraties van YOYO-1 's nachts (lane C: verteerd lambda DNA met geen kleurstof (control), lane 1: 1,9 ng lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19.4 ng, lane 4: 32.2 ng, lane 5: 48.3 ng, lane 6: 63,5 ng van kleurstof per 100 ng van DNA) en vervolgens dige sted met EcoRI bij 37 ° C gedurende 2-4 uur. Alle reacties zijn electrophoresed (E = 0.85 V/cm) op een gelerend hoogtemperatuur 0,7% (HGT) agarose gel gemaakt met 1 x TAE buffer (1 x TAE; 40 mM Tris-HCl, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA). Gels zijn gekleurd met ethidiumbromide en beeld met een blauwe lichte transilluminator gekoppeld aan een camera. Lane L is een ladder 1 kb (maten, kb); Lane λ is volle lengte lambda DNA; Lane E is het patroon van de verwachte band (maten, kb). (b) Lambda DNA is gekleurd met YOYO-3 (lane 1: 1,9 ng lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19.4 ng, lane 4: 32.2 ng, lane 5: 48.3 ng, lane 6: 63,5 ng van kleurstof per 100 ng van DNA) en verteerd met HindIII bij 37 ° C. (c) om te zien hoe de mobiliteit als de YOYO-1 concentratie verschoven wordt verhoogd, gekleurde sterretjes bevinden zich naast elke band voor elke concentratie YOYO-1. Bijvoorbeeld, heeft de band bij 3,5 kb een rood sterretje naast elke band in elke YOYO-1 concentratie. De onverwachte bands in baan 5 en 6 hebben niet een sterretje naast de bands. De figuur wordt gewijzigd van Maschmann et al. 25. copyright (2017) nucleosiden, nucleotiden en nucleïnezuren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Chemischenaam | Afgekorte naam | Ex / Em (nm) |
| [(1-1-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]-bis [4-[(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene) methyl]]-, tetraiodide | TOTO-1 | 514/533 |
| 1, 1 ' - bis (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl)-methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} | YOYO-1 | 491/509 |
| 2, 2′-[1,3-prop-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-methyl]-, tetraiodide | POPO-1 | 434/456 |
| 2, 2′-[1,3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} | BOBO-1 | 462/481 |
| 2, 2′-{[4,8-bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] BIB [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide | TOTO-3 | 642/660 |
| 1, 1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] BIB [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide | YOYO-3 | 612/631 |
| 2, 2′-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide | POPO-3 | 534/570 |
| 2,2'-{Propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)Propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraiodide | BOBO-3 | 570/602 |
Tabel 1: Afgekort namen van TOTO familie van kleurstoffen met IUPAC-namen met emissie (Em) en excitatie (Ex-) maximima22.
| Enzym | Methylation van gevoelige | Buffer | Temperatuur van het water bad |
| BamHI | No | 2 | 37 ° C |
| EcoRI | Ja | 2 | 37 ° C |
| HindIII | No | 2 | 37 ° C |
| PmlI | Ja | 1 | 37 ° C |
| ScaI | No | 2 | 37 ° C |
| SmaI | Ja | 3 | 25 ° C |
Tabel 2: Vermeld in de tabel is een subset van mogelijke enzymen die kunnen worden gebruikt in deze experimenten. Drie enzymen zijn methylering gevoelige en drie niet methyleren gevoelig. De buffers gebruikt voor de enzymen en de incubatie temperaturen worden weergegeven voor elk enzym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om te verteren fluorescently geëtiketteerde DNA (Figuur 1), zijn een aantal stappen vereist. Eerst, DNA is gekleurd met een fluorescerende 's nachts. DNA kan worden geïncubeerd met cyanine Dimeren voor een kortere periode; Carlsson et al. vond echter dat DNA dubbele banden voor elke grootte van de DNA als gevolg van onvolledige kleuring20gemaakt. Om dit te verhelpen, kan het DNA overnachting om te voorkomen dubbele banden worden gekleurd. Dit is een cruciale stap in het protocol. Als de kleurstof is niet lang genoeg ge¨ uncubeerd, de kleurstof-DNA wellicht niet bij evenwicht en krijgt een dubbele-"banding"-patroon. Als dit gebeurt, laat het mengsel DNA-kleurstof equilibreer gedurende een langere periode van tijd.
Vervolgens is een restrictie-enzym toegevoegd aan het DNA-kleurstof mengsel en verteerd voor 2-4 h bij een specifieke temperatuur voor elk enzym. Het DNA moet unmethylated voor methylering gevoelige enzymen. Als er geen, zal gemethyleerd DNA weerhouden de restrictie-enzym snijden DNA regio gemethyleerd. De reactie moet bovendien worden geïncubeerd in de correcte buffer en de temperatuur voor het enzym. Elk enzym heeft een lijst van buffers en de enzymactiviteit in elke buffer. Kies indien mogelijk de buffer met enzymactiviteit bij 100% is. Wat betreft temperatuur, door ervoor te zorgen dat het is geïncubeerd in de juiste temperatuur. Als het niet het geval is, kan het het enzym te verliezen van de activiteit of denatureren als de temperatuur te hoog is. EDTA wordt gebruikt om te stoppen met de reactie. Het bedrijf waar de enzymen werden aangekocht zal hebben een grafiek met de optimale temperaturen en buffer voorwaarden voor dat enzym. Als het besturingselement niet het juiste aantal banden op de juiste molecuulgewichten, controleren om te zien geeft als het enzym is verlopen, verhogen de incubatietijd, of te controleren om te controleren of de temperatuur klopt voor dat enzym.
Zodra de reactie wordt voltooid, kunnen de monsters worden geladen in een gel. Eerst wordt een gel in de gel container geladen en ondergedompeld in 1 x TAE buffer. Vervolgens het verteerd DNA wordt gemengd met laden kleurstof en de oplossing wordt geladen in de putten van de gel. Het deksel is gleed over en de draden zijn aangesloten op het vak van de gel. Een donker papier, die samen is geplakt, wordt geplaatst op de top van het deksel te dekken van het deksel en draperen over de zijkanten. Een andere belangrijke stap is dat de monsters worden beschermd tegen het licht te allen tijde, met name terwijl de gel wordt uitgevoerd. De voeding moet worden ingeschakeld en de lichten aan de kamer uitgeschakeld. Om te voorkomen dat photocleavage van DNA, worden monsters beschermd tegen licht de hele tijd. Als er geen donker papier aanwezig is, kan een donkere stof ook worden gebruikt. Als het DNA niet beweegt, zorg ervoor dat de draden zijn verbonden met het vak en de stormloop knop is ingedrukt.
In de ochtend, neem de gel uit de doos van de gel en de gel in een container waarin ethidiumbromide laden. Ethidiumbromide laat ons zien de DNA-bands onder het blauwe licht transilluminator (Figuur 2). Andere kleurstoffen kunnen worden gebruikt in plaats van ethidiumbromide. Een camera kan worden gemonteerd boven de blauwe lichte transilluminator te vangen van foto's van de gel. Afhankelijk van de instelling, kan ook een imaging station worden gebruikt.
Deze methode kan worden gebruikt voor elke kleurstof die intercalates of vlekken van DNA, niet alleen de TOTO-serie. Maschmann et al. bewerkt een techniek ontwikkeld door Meng et al. om te bepalen als fluorescently gekleurd DNA kunnen met enzymen van de beperking24,25worden verteerd. Dit is de enige techniek gebruikt om te bepalen als vooraf gebeitst DNA invloed op restrictie-enzymen. Deze methode is beperkt tot de enzymen van de beperking verkrijgbare, tenzij een wetenschapper heeft toegang tot andere enzymen van de beperking die niet commercieel worden vermeld. Afhankelijk van DNA, het enzym gekozen moet een waarneembare DNA band patroon en genoeg bands (> 3) om te bepalen of de DNA-molecule volledige lengte. Ook moet het DNA de unmethylated als methylering gevoelige enzymen worden gebruikt. Als DNA is gemethyleerd, vervolgens geen gebruik van methylering gevoelige enzymen.
Deze methode is een makkelijk te gebruiken manier om te bepalen als enzymen van de beperking DNA moleculen op de site van de erkenning gekleurd met een intercalating kleurstof zonder te ontwerpen van inleidingen voor een bepaalde gesneden site34kan snijden. De toekomstige toepassingen van deze methode zou zijn om te bepalen als fluorescently aangeduid als moleculen van een experiment volle lengte met behulp van een restrictie-enzym en bepalen van de grootte van de DNA-bands van de digest of om te bepalen van de profielen van methylation van DNA moleculen. Toekomstige experimenten zouden kunnen ook bepalen als plukt enzymen worden beïnvloed door de cyanine-kleurstoffen of andere fluorescente kleurstoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschap (NIGMS) (5605100122001), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH), evenals de Universiteit van Nebraska op Kearney (UNK) zomer Student Research Program (SSRP) en UNK Undergraduate Research Fellowship (URF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
- Riehn, R., et al.
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
