Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحديد إذا كان الحمض النووي ملطخة "سينين صبغ يمكن هضمها" مع إنزيمات التقييد

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/57141
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

Summary

تلوين جزيئات الحمض النووي للفحص المجهري fluorescence يسمح عالم لعرضها أثناء تجربة. في أسلوب عرض هنا، قبل ملطخة بالأصباغ الفلورية جزيئات الحمض النووي وهضمها مع مثلايشن وغير مثلايشن الحساسة تقييد الإنزيمات.

Abstract

التصور للحمض النووي للفحص المجهري الفلورية تستخدم مجموعة متنوعة من الأصباغ مثل الأصباغ سيانيني. وتستخدم هذه الأصباغ نظراً لتقارب عالية وحساسية للحمض النووي. من أجل تحديد ما إذا كانت جزيئات الحمض النووي طول كامل بعد انتهاء التجربة، مطلوب طريقة لتحديد ما إذا كانت الجزيئات الملون طول كامل بهضم الحمض النووي مع إنزيمات التقييد. ومع ذلك، قد تمنع الحمض الخلوي الصبغي الملون الإنزيمات، حيث هناك حاجة إلى طريقة لتحديد ما هي الإنزيمات واحدة يمكن استخدامها ل fluorochrome الملون الحمض النووي. في هذا الأسلوب، يتم الملون الحمض النووي مع صبغة سينين بين عشية وضحاها للسماح لصبغ والحمض النووي حجته. الحمض النووي القادم، ملطخة يهضم مع إنزيم التقييد، وتحميلها في جل واليكتروفوريسيد. تتم مقارنة العصابات هضم الحمض النووي التجريبي إلى خلاصة في السيليكون لتحديد نشاط إنزيم التقييد. إذا كان هناك نفس العدد من العصابات كما هو متوقع، ثم رد الفعل كاملة. العصابات أكثر مما كان متوقعا تشير إلى الهضم الجزئي وعصابات أقل تشير إلى غير مكتملة الهضم. وميزة هذا الأسلوب هو بساطته ويستخدم المعدات التي سوف تحتاج إلى عالم لأنزيم التقييد الاعتداء وهلام التفريد. حد من هذا الأسلوب هو أن الإنزيمات متاحة لمعظم العلماء الإنزيمات المتوافرة تجارياً؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أي إنزيمات التقييد.

Introduction

سلسلة توتو (توتو-1 ويويو-1، بوبو-1، بوبو-1، توتو-3، يويو-3، بوبو-3 وبوبو-3؛ الجدول 1) ويستخدم في مجموعة متنوعة واسعة من التجارب حيث التصور من الحمض النووي هو مطلوب1،2،3،،من45،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17-الأسرة ديمر سينين يستخدم على نطاق واسع نظراً للعائد الكم، والحساسية، وألفة عالية للحمض النووي جزيئات18،،من1920. وقد الأصباغ ديمر سينين انتقائية كبيرة لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل، وعندما أولمبية صيفية زيادة إضعاف 100 إلى 1000 من الأسفار21. بيريدينيوم الأصباغ (يويو-1 توتو-1, 3 يويو وتوتو-3) يكون طول موجي أقصر انبعاثات من كوينوليوم على صبغ النظراء (الجدول 1) (بوبو-1 بوبو-1، 3-بوبو وبوبو-3)22. أيضا، عالية المحصول الكم dimers سينين أولمبية صيفية في الحمض النووي (0.2-0.6)22. ومع ذلك، يتطلب استخدام إنزيم لتحديد التشكيل الجانبي مثلايشن من جزيء الحمض النووي2 وامتداد23 جزيء الحمض النووي فعلا ملطخة بصبغة الفلورسنت أو طريقة لتحديد ما هي الإنزيمات سوف هضم الحمض الخلوي الصبغي الملون. يمكن استخدام أي نوع من صبغة إينتيركالاتيس في الحمض النووي أو أي الإنزيم الذي يعطي نمط ملموس من الركازة الحمض النووي لهذا الأسلوب.

منغ et al. أولاً بتحديد معدل الهضم بريستاينيد الحمض النووي عن طريق التفريد جل باستخدام مجموعة متنوعة من صبغات مختلفة24. ماشمان et al. يفتش في أعمق إلقاء نظرة على الأسرة توتو من الأصباغ. سواء حددت سعر الهضم من الحمض الخلوي الصبغي الملون لمعرفة إذا كان يمكن هضمها الحمض النووي ملطخة بصبغة معينة مع إنزيم التقييد25. دراسة أساليب أخرى آثار ملزمة من الأصباغ أولمبية صيفية مع الحمض النووي باستخدام ملاقط بصرية26 أو27من الرنين المغناطيسي النووي. أما الأسلوب يتطلب معدات متخصصة؛ وحيث يسمح هذا الأسلوب بالمعدات التي لديها معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية تحديد ما إذا كانت صبغة يتداخل مع هضم إنزيم التقييد.

بالإضافة إلى ذلك، في أساليب أخرى لقياس طول جزيء معين، ممدود جزيئات الحمض النووي أونستينيد على سطح رسم الخرائط البصرية وهضم الحمض النووي لتحديد امتداد وحجم الشظايا. الالكترود صبغ قد ثبت أن زيادة طول كفاف من جزيئات الحامض النووي فلوريسسينتلي الملون واعتماداً على الصبغة المستخدمة، كفاف أطوال مختلفة21. وقد استخدمت هذا الأسلوب في مجموعة متنوعة من الجينوم1،3،،من46،13،،من2829،30، 31-ومع ذلك، ولو قبل الملون، اعتماداً على صبغ وإنزيم جزيئات، الإنزيم قد لا تكون قادرة على قطع الحمض النووي ملطخة بصبغة معينة. لذلك، يحدد هذا الأسلوب إذا كان الحمض النووي ملطخة بصبغة معينة يمكن هضمها بإنزيم. بالإضافة إلى ذلك، اعتماداً على تركيز الصبغة والصبغة المستخدمة، التنقل من الحمض النووي العصابات في جل سيتم ترحيل ببطء أكثر من الحمض النووي الأصلية بسبب تفكيك جزئي للعمود الفقري الحمض النووي لإفساح المجال لصبغ لإدراج بين قاعدة أزواج32 .

ومع ذلك، في بعض الأحيان هذه الأصباغ يمكن جزئيا أو تماما تحول دون عمل بعض الإنزيمات تقييد7،24. هذا ويعتقد أن يكون سبب تغيير هيكلي في الحمض النووي الناجم عن المرفق صبغة الفلورسنت، مما قد يمنع الإنزيم من الاعتراف تسلسل معين. يمكن أن يساعد فهم كيف تؤثر هذه الأصباغ على إنزيمات التقييد في التجارب حيث الشخصية مثلايشن أو تمتد من الحمض الخلوي الصبغي الملون مطلوب.

في أسلوبنا، ملطخة فلوروتشرومي الاهتمام الحمض النووي وهضمها مع إنزيم التقييد. ثم كان اليكتروفوريسيد الحمض النووي في هلام، المصورة، وتم قياس معدل الهضم إنزيم التقييد. تم اختيار إنزيمات التقييد بناء على النمط الذي قطع في جل. عصابات كثيرة جداً بسبب تداخل الحمض النووي العصابات وعصابات قليلة جداً لم يعط صورة كاملة من جزيء الحمض النووي. وهناك بقعة الحلو ليتمكن من تحديد التشكيل الجانبي لهضم جزيء الحمض النووي؛ ولذلك، فإنه سيتوقف على الحمض النووي المستخدمة والانزيم. ميزة هذا الأسلوب هو بساطته؛ فإنه يتطلب فقط المعدات المستخدمة في التفريد الهضم وجل تقييد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد الأصباغ ومخازن [اغروس] هلام

  1. إعداد الحلول التالية لتلطيخ الحمض النووي أو هضم الحمض الخلوي الصبغي الملون.
    1. تعد الشركة المصرية للاتصالات x 1 (حمض HCl تريس والايثيلين؛ المخزن المؤقت يدتا) باستخدام 10 مم يدتا تريس-HCl و 1 مم في اسطوانة أو دورق حجمي. تخزين في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية).
    2. جعل مختبرين لكل صبغ: توتو-1، يويو-1، بوبو-1، بوبو-1، توتو-3، 3 يويو، بوبو-3، بوبو-3 (الجدول 1). "الماصة؛" 4 ميليلتر صبغ 1 مم في العنبر مظلم أو أسود 1.5 مل أنبوب وإضافة ميليلتر 36 1 x الشركة المصرية للاتصالات، استخدام الماصة؛ مزيج هذا التركيز يجعل حل صبغ 100 ميكرومتر (مجموع 40 ميليلتر). إكمال هذه الخطوة من أجل كل صبغة. مخزن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تجنب تعريض صبغ الضوء للحيلولة دون فوتوبليتشينج أو تدهور من الصبغة.
    3. إعداد المخزن المؤقت 1 استخدام ملم 10 مكررا-تريس-البروبين-HCl 10 مم مجكل2، و 100 ميكروغرام/مل ألبومين المصل البقري (BSA). إعداد المخزن المؤقت 2 استخدام كلوريد الصوديوم، 50 ملم 10 ملم تريس-HCl و 10 مم مجكل2و 100 ميكروغرام/مل جيش صرب البوسنة. إعداد المخزن المؤقت 3 استخدام 50 مم "خلات البوتاسيوم"، 20 مم تريس-خلات، خلات المغنيسيوم 10 ملم و 100 ميكروغرام/مل جيش صرب البوسنة. سوف تتطلب كل إنزيم واحد من هذه المخازن المؤقتة محددة العمل.
  2. إعداد الحلول التالية لجل التفريد.
    1. جعل صبغ 6 × التحميل عن طريق الجمع بين 0.25% بروموفينول الأزرق، زايلين زيلين نفط 0.25%، 15% فيكل dH2"مخزن سين" في درجة حرارة الغرفة.
    2. جعل 0.7% [اغروس] هلام، وتزن بها 0.07 ز من عالية التبلور درجة الحرارة (حجة) [اغروس] في قارورة Erlenmeyer إضافة 100 مل من المخزن المؤقت x TAE 1 ثم ضعه الكأس مقلوب أعلى قارورة.
      1. حرارة الحل على صفيحة ساخنة حتى تبدأ فقاعات إلى النموذج في الجزء السفلي لقارورة وتطفو إلى الأعلى.
      2. إزالة الحل من صفيحة، والسماح لتبرد الحل حتى يمكن أن يلمس يد عارية قارورة، وثم صب الجل في العفن جل 24.5 × 21.8 سم بمشط جل لإنشاء الآبار.
      3. إزالة فقاعات قرب المشط أو على سطح الهلام التي ظهرت عليها مع تلميح ماصة والسماح الهلام يصلب لمدة 15 دقيقة على الأقل. وهذا يمكن تخزينها في ثلاجة (4 درجات مئوية) مغلفة بالبلاستيك لمدة أسبوع واحد لمنع تجفيف هلام أو التلوث. لمزيد من المعلومات حول كيفية تشغيل هلام الرجوع إلى لي et al. 33 .
        ملاحظة: استخدام مشط هلام مع 30 بئرا الفردية. كذلك كل واحد ينبغي أن يكون 4.5 مم مع عمق 2 مم. ارتفاع البئر سيتوقف على مقدار جل سكب في المربع.
    3. إعداد المخزن المؤقت x TAE (تريس-خلات-يدتا) 1 باستخدام 40 تريس-HCl، حمض الخليك 20 مم، و 1 ملم يدتا. تخزين في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية).

2-إعداد الحمض الخلوي الصبغي الملون

  1. وصمة عار لامدا الحمض النووي (300-800 نغ) استخدام مختبرين مختلفة من الأصباغ. وسيكون كل صبغة (الجدول 1) ستة تركيزات مختلفة اختبار، لما مجموعة 48 ردود فعل كل إنزيم التقييد. العملية التالية الخطوط العريضة لمجموعة تصل للرد 1 (الشكل 1).
    1. تمييع الحمض النووي لامدا باستخدام تي س 1 إلى 100 نانوغرام/ميليلتر. مخزن في 4 درجات مئوية. جعل التوصل إلى حل مع إجمالي حجم 300 ميليلتر.
    2. وصمة عار لامدا أونميثيلاتيد الحمض النووي. لكل فرقة من المتوقع من الخلاصة، تقدير 75-100 نانوغرام/الفرقة. إضافة المبالغ المناسبة لصبغ لإنتاج تركيزات 1.9 ميكرومتر، ميكرومتر 3.8، 19.4 ميكرومتر، ميكرومتر 32.2، ميكرومتر 48.3، ميكرومتر 63.5/100 نانوغرام من الحمض النووي.
    3. تبني بين عشية وضحاها (ح 15-18 ح) في 4 درجات مئوية.
    4. اترك رد فعل واحد أونستينيد بمثابة السيطرة25.
      ملاحظة: استخدام الحمض النووي أونميثيلاتيد لرد فعل الهضم. مثلايشن الإنزيمات الحساسة لا قص مناطق ميثليته في الحمض النووي، وسوف تعطي مظهر الهضم غير مكتملة.

3-إعداد المقايسة إنزيم التقييد

  1. هضم الحمض النووي ملطخة إنزيم التقييد لتحديد إذا كان هذا الإنزيم يمكن هضم الحمض بريستينيد (الشكل 1).
    1. وفي اليوم التالي إضافة 20 ش إنزيم التقييد، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الملائم (الجدول 2)، والماء المقطر ويعقم وتمت تصفيتها لما مجموعة 30 ميليلتر. لكل رد فعل الإنزيم، اختر المخزن المؤقت مع خفض كفاءة أعلى، يمكن الاطلاع عليها على موقع الويب الخاص بالشركة المصنعة.
    2. ضع ردود الفعل في حمام مائي عند درجة حرارة النشاط الأنزيمي الأمثل، ترد في الجدول 2 للإنزيمات 6 المستخدمة في ماشمان et al.، 2-4 ح (الجدول 2)25.
    3. وقف رد الفعل بإضافة 2 ميليلتر من 0.5 م يدتا pH 8.0.

4-اليكترولوتينج الملون الحمض النووي في [اغروس] هلام

  1. إزالة الجانبين من العفن جل 24.5 × 21.8 سم (الخطوة 1.2.2) ووضع الجل في مربع التفريد هلام. صب 2.5 لتر من المخزن المؤقت x TAE 1 في المربع. بعناية إزالة المشط جل من الجل، حيث الآبار هي موجوداً33.
  2. "الماصة؛" ردود فعل إنزيم التقييد على فيلم بلاستيك والجمع بين كل رد فعل مع 6 × تحميل صبغ. لكل حل رد فعل، أضف 1 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ كل ميليلتر 5-6 من الحمض النووي الحل (س 1). ثم "الماصة؛" ردود فعل (التي تحتوي على صبغ تحميل، < ميليلتر 18) في الآبار.
  3. مزيج ميليلتر 1 سلم 1 كيلو بايت وميليلتر 9 1 x تي 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ. تحميل الحل في الآبار التي الجناح الحلول الأخرى.
  4. تغطية مربع هلام مع ورقة سوداء أو زرقاء داكنة أو النسيج. قم بتوصيل مربع هلام إمدادات طاقة، تعيين إمدادات الطاقة إلى 30 الخامس، وبين عشية وضحاها وتشغيلها (ح 15-20). إطفاء الأنوار أثناء تشغيل الهلام، لمنع فوتوكليفاجي من الحمض النووي المسمى.
  5. في صباح اليوم التالي إيقاف الإمداد بالطاقة. تأخذ الجل باستخدام علبة الورق ونقله إلى حاوية مع 45 ميليلتر اثيديوم بروميد ول 1 1 x TAE المخزن المؤقت. تخزين الحاويات في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو الغطاء في إحباط لمنع التعرض للضوء. واسمحوا جل وصمة عار لمدة 45 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: استخدام اثيديوم بروميد مع القفازات وارتداء نظارات الأمان. تنظيف الحاوية التي تحتوي على اثيديوم بروميد الحل ورمي الهلام، يتشاور مع المبادئ التوجيهية الخاصة بك التخلص من الدول لتحديد كيفية التعامل مع بروميد اثيديوم المستخدمة؛ بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام البقع الأخرى بدلاً من اثيديوم بروميد.

5-التصوير [اغروس] هلام

  1. ضع الجل على رأس ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، التي تنبعث من ناتج الضوء القصوى بين 400-500 نانومتر. التقاط الصور باستخدام الكاميرا تعلق على المحطة.
    تنبيه: تأكد من استخدام الغطاء لإضاءة ووضع النظارات الواقية قبل تحول على مصدر الضوء.
    ملاحظة: هذه الخطوة قد أيضا إكمال باستخدام أي مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو هلام القياسية الماسح الضوئي.
  2. عرض الصور في إيماجيج عن طريق سحب الملف إلى شريط الحالة إيماجيج وسوف يطفو على السطح الصورة.
  3. تحديد معدل الهضم للتجربة بمقارنة العصابات في الجل لنمط جل المتوقعة في السيليكون . لتحديد معدل الهضم، هو عدد الأشرطة التجريبية مقسوماً على العدد المتوقع من الحمض النووي العصابات24،25. إذا كان نمط الفرقة الحمض النووي التجريبي هضمها النمط المتوقع، ومعدل الهضم هو 1. إذا كان النمط الأجزاء أكثر مما كان متوقعا، ومعدل الهضم أكبر من 1. إذا كان النمط الشظايا أقل مما كان متوقعا، ومعدل الهضم أقل من واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد إذا كان سيؤثر صبغ إينتيركالاتينج إنزيم التقييد هضم الحمض النووي، يجب أن يكون الترتيب الصحيح للخطوات المتبعة (الشكل 1). مجرد الحمض الخلوي الصبغي الملون وهضمها مع إنزيم معين، يمكن التقاط صورة من الجل لتحديد عدد الشظايا وحجمها (الشكل 2). من أجل تحديد فعالية الإنزيم، العدد الإجمالي لأشرطة مرئية المتوقعة مقسوماً على عدد أشرطة مرئية. كفاءة الإنزيم ساوى بين الوحدة، وإذا كان من المتوقع عدد العصابات وشهدت المباراة. إذا كان هناك عصابات أكثر في جل ثم المتوقع، القيمة أكبر من واحد ويشير إلى ردود فعل هضمها جزئيا. إذا كان هناك عصابات أقل من المتوقع بعد ذلك، ثم القيمة هي أقل من 1، مما يشير إلى عدم اكتمال الهضم. في الشكل 2 أ، عرض الممرات 3 و 4 وانخفض تنقل العصابات، مما تسبب في العصابات التحول نحو الآبار. حارات 1 و 2، كمية صبغ لا يؤثر على الحركة ملحوظ، حيث العصابات تطابق عنصر التحكم. في الشكل 2 أ، تظهر حارات 5 و 6 عصابات أكثر من عنصر التحكم، حيث أنه يشير إلى الهضم الجزئي. مما يعني، الأصباغ المتأثرة الانقسام ومن الحمض النووي في موقع التسليم لهذا الإنزيم. في الشكل 2، المتوقع جميع العصابات وينظر لجميع صبغ التركيزات، حيث الصبغ لا تتداخل مع عملية الهضم من الحمض النووي. الرقم 2 (ج) المسارات التنقل تحولات نجمية الملونة.

كصبغ تزيد تركيز الأصباغ مع-1، التنقل النقصان. من أجل تحديد الحجم التقريبي للعصابات، مطلوب عنصر تحكم معرفة حيث من المتوقع أن جزيئات الحمض النووي الأصلية مقارنة بالحمض النووي الملون (الشكل 2a). للصبغات مع-3، التنقل لم تقل بقدر ما فعل الأصباغ-1، حيث أنه من الأسهل لتحديد حجم جزء (الشكل 2). التنقل والفرق بسبب نوع الصبغة المستخدمة، كما رأينا في ماشمان et al. 25. ويعتبر الفرق من هذه الأصباغ بسبب هياكل الأصباغ. الرابط بين moiety العطرية للأصباغ-3 كانت أطول من-1. قد إينتيركالاتي الأصباغ بشكل مختلف قليلاً بسبب الفرق في حجم رابط، مما قد يفسر لماذا تحول التنقل أقل للأصباغ-3.

إذا كان هناك لا الحمض النووي، أو نطاقات الحمض النووي خافت جداً في الهلام، زيادة تركيز الحمض النووي المطلوب. ومع ذلك، إذا كان يزيد من تركيز الحمض النووي، ثم مقدار الصبغة المطلوبة ستزيد أيضا للحفاظ على تركيز الصبغة الصحيحة لنسبة الحمض النووي.

Figure 1
الشكل 1 : تخطيطي للخطوات المطلوبة عند هضم fluorochrome المسمى جزيئات الحمض النووي. الحمض النووي ويويو-1، أو صبغ آخر من سلسلة توتو، إضافة إلى أنبوب أسود والمحتضنة بين عشية وضحاها (س/ن؛ ح 15-20). يتم إضافة إنزيم التقييد أنبوب؛ يتم وضعها في حاضنة، عند درجة حرارة المفضل، عن 2-4 ح (الجدول 2). تحميل عينات مغمورة 0.7% [اغروس] هلام مع المخزن المؤقت x TAE 1. ورق ملون الظلام يغطي مربع هلام والأضواء تم إيقاف، بينما الجل ركض بين عشية وضحاها لمنع فوتوكليفاجي الصبغة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الهضم تقييد الحمض النووي أولمبية صيفية مع صبغة ديمر سينين. () "الحمض النووي لامدا" هي ملطخة بتركيزات مختلفة من يويو-1 بين عشية وضحاها (لين جيم: هضم الحمض النووي لامدا مع لا صبغ (مراقبة)، لين 1: 1.9 نغ، لين 2: 3.8 نانوغرام، لين 3: 19.4 نغ، لين 4: 32.2 نغ، لين 5: 48.3 نغ، لين 6: 63.5 نغ صبغ كل 100 نانوغرام من الحمض النووي) وثم دعيج sted مع اكوري في 37 درجة مئوية ح 2-4. هي اليكتروفوريسيد جميع ردود الفعل (E = 0.85 الخامس/سم) على درجة حرارة التبلور ارتفاع نسبة 0.7 في المائة التي (حجة) [اغروس] هلام مع المخزن المؤقت x TAE 1 (1 x TAE؛ 40 مم تريس-HCl، 20 ملم حمض الخليك، يدتا 1 مم). الهلام الملون مع اثيديوم بروميد وتصويرها مع ترانسيلوميناتور ضوء أزرق بالإضافة إلى كاميرا. L لين سلم 1 كيلوبايت (الأحجام، ك. بايت)؛ لين λ هو طول كامل لامدا الحمض النووي؛ لين ه هو نمط الفرقة المتوقعة (الأحجام، كيلو بايت). (ب) "الحمض النووي لامدا" هي ملطخة يويو-3 (لين 1: 1.9 نغ، لين 2: 3.8 نانوغرام، لين 3: 19.4 نغ، لين 4: 32.2 نغ، لين 5: 48.3 نغ، لين 6: 63.5 نغ صبغ كل 100 نانوغرام من الحمض النووي) وهضمها مع هنديي في 37 درجة مئوية. (ج) لترى كيف تحول التنقل كتركيز يويو-1 هو زيادة، وعلامات نجمية الملونة تقع بجوار كل فرقة لكل تركيز يويو-1. على سبيل المثال، قد الفرقة في 3.5 كيلو بايت علامة نجمية حمراء بجانب كل الفرقة في كل تركيز يويو-1. لم يكن لديك العصابات غير متوقعة في حارة 5 و 6 نجمية إلى جانب العصابات. يتم تعديل هذا الرقم من ماشمان et al. 25-حقوق الطبع والنشر نوكليوسدس (2017)، النيوكليوتيدات والأحماض النووية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الاسم الكيميائي الاسم المختصر ت/م (nm)
[(1-1-[1، 3-بروبانيدييلبيس مكررا [(ديميثيليمينيو)-3,1-بروبانيدييل] [4-[الميثيل (3-الميثيل-2(3H)-بينزوثيازوليليديني) []--، تيتريوديدي توتو-1 514/533
1، 1--(4,4,8,8-ميثيل-4,8-ديازاونديكاميثيليني) مكررا [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) ميثيليديني]-l, 4-ديهيدروكوينولينيوم] تيترايوديدي} يويو-1 491/509
2, 2 '-[أنيدييلبيس-1، 3-prop [(ديميثيليمينيو)-3,1-بروبانيدييل-1 (4 ح)-بيريدينيل-4-يليدينيميثيليد-ين]] مكررا [3-ميثيل]-، تيتريوديدي بوبو-1 434/456
2, 2 '-[1، 3-بروبانيدييلبيس [(dimethylimi-nio)-3,1-بروبانيدييل-1(4H)-بيريدينيل-4 – 1، 1'-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-نولينيوم} بوبو-1 462/481
2, 2 '--{مكررا [4,8-مكررا (ديميثيليمينيو) أونديكان-1,11-ديل] [كوينولين-1-يل-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) تيترايو--ديدي 3-توتو 642/660
1، 1 '-[1، 3-بروبانيدييلبيس [(ديميثيليمينيو)-3,1-بروبانيدييل] [مكررا [4-[تيتريوديدي 3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-، يويو-3 612/631
2, 2 '-[1، 3-بروبانيدييلبيس [(ديميثيليمينيو)-3,1-بروبانيدييل-1 (4 ح)-بيريدينيل-4-ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-، تيترايوديدي بوبو-3 534/570
تيتريوديدي 2,2'-{propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) بوبو-3 570/602

الجدول 1: يختصر أسماء عائلة توتو من الأصباغ مع أسماء البحتة مع الانبعاثات (م) والإثارة (السابقين) ماكسيميما22-

إنزيم مثلايشن الحساسة المخزن المؤقت درجة حرارة المياه حمام
بامهي لا 2 37 درجة مئوية
اكوري نعم 2 37 درجة مئوية
هنديي لا 2 37 درجة مئوية
بملي نعم 1 37 درجة مئوية
سي لا 2 37 درجة مئوية
سماي نعم 3 25 درجة مئوية

الجدول 2: المدرجة في الجدول هو مجموعة فرعية إنزيمات الممكنة التي يمكن أن تستخدم في هذه التجارب- الإنزيمات الثلاثة مثلايشن الحساسة وثلاثة ليست مثلايشن الحساسة. المخازن المؤقتة المستخدمة للإنزيمات ودرجات حرارة الحضانة المذكورة لكل إنزيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من أجل هضم الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي (الشكل 1)، سلسلة من الخطوات المطلوبة. أولاً، هو الملون الحمض النووي مع فلوروتشرومي بين عشية وضحاها. يمكن المحتضنة الحمض النووي مع dimers سينين لفترة أقصر من الوقت؛ ومع ذلك، وجد كارلسون et al. أن الحمض النووي إنشاء نطاقات مزدوجة لكل حجم الحمض النووي نظراً لعدم اكتمال المصبوغة20. لتصحيح هذا الوضع، يمكن الملون الحمض النووي بين عشية وضحاها لمنع حدوث العصابات مزدوجة. هذا خطوة حاسمة في البروتوكول. إذا لم يتم المحتضنة الصبغة لفترة طويلة بما يكفي، الصبغ-الحمض النووي قد لا تكون في التوازن وسوف تعطي نمط مزدوج النطاقات. إذا كان هذا يحدث، السماح الخليط صبغ الحمض النووي حجته لفترة أطول من الزمن.

المقبل، إنزيم التقييد المضافة إلى الخليط صبغ الحمض النووي وهضمها ح 2-4 عند درجة حرارة محددة لكل إنزيم. يجب أن يكون الحمض النووي أونميثيلاتيد للإنزيمات الحساسة مثلايشن. إذا لم يكن كذلك، سوف تمنع الحمض النووي ميثليته إنزيم التقييد من قطع الحمض النووي في مناطق ميثليته. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون المحتضنة رد فعل في المخزن المؤقت الصحيح ودرجة الحرارة للانزيم. كل إنزيم يحتوي على قائمة من المخازن المؤقتة ونشاط إنزيم في كل المخزن المؤقت. اختر المخزن المؤقت مع نشاط إنزيم عند 100%، إذا كان ذلك ممكناً. أما بالنسبة لدرجة الحرارة، وتأكد من أنها هي المحتضنة في درجة الحرارة الصحيحة. إذا لم يكن كذلك، فقد يتسبب الإنزيم تفقد النشاط أو تؤذي إذا كانت درجة الحرارة عالية جداً. ويستخدم أدتا التوقف عن رد فعل. سوف يكون للشركة حيث تم شراء الإنزيمات مخطط مع درجات الحرارة المثلى وشروط المخزن المؤقت لهذا الإنزيم. إذا كان عنصر التحكم لا تعطي العدد الصحيح من العصابات في الأوزان الجزيئية الصحيحة، تحقق لمعرفة إذا انتهت صلاحية الإنزيم، زيادة فترة حضانة المرض، أو التحقق للتأكد من أن درجة الحرارة الصحيح لهذا الإنزيم.

وبمجرد الانتهاء من رد فعل، يمكن تحميل العينات في هلام. أولاً، تم تحميلها في الحاوية هلام هلام ومنغمسين في المخزن المؤقت x TAE 1. بعد ذلك، الحمض النووي هضمها مختلطة مع تحميل صبغ، والحل الذي تم تحميله في آبار الجل. هو انزلق الغطاء أكثر والأسلاك المرفقة مربع هلام. ورقة مظلمة، التي هي مسجلة معا، يوضع على رأس غطاء لتغطية الغطاء وثني على الجانبين. خطوة حاسمة أخرى أن العينات محمية من الضوء في جميع الأوقات، لا سيما أثناء تشغيل الهلام. ينبغي تشغيل إمدادات الطاقة وإيقاف تشغيل الأضواء للغرفة. ولمنع فوتوكليفاجي من الحمض النووي، محمية عينات من الضوء طوال الوقت. إذا لم يكن هناك أي ورقة الظلام، يمكن استخدام نسيج الظلام كذلك. إذا لم يتحرك الحمض النووي، تأكد من الأسلاك متصلة بالمربع والضغط على زر التشغيل.

في الصباح، واتخاذ الهلام من خارج منطقة الجزاء جل وتحميل الجل في وعاء يحتوي على اثيديوم بروميد. اثيديوم بروميد يتيح لنا أن نرى العصابات الحمض النووي تحت ترانسيلوميناتور الضوء الأزرق (الشكل 2). يمكن استخدام الصبغات الأخرى بدلاً من اثيديوم بروميد. يمكن تحميل كاميرا أعلاه ترانسيلوميناتور الضوء الأزرق لالتقاط صور للجل. اعتماداً على الإعداد، يمكن أيضا أن تستخدم محطة لتصوير.

ويمكن استخدام هذا الأسلوب لأي صبغة إينتيركالاتيس أو بقع الحمض النووي، وليس مجرد سلسلة توتو. ماشمان وآخرون. تعديل تقنية طورتها منغ وآخرون. لتحديد ما إذا كان فلوريسسينتلي الملون الحمض النووي يمكن أن يهضم مع إنزيمات التقييد24،25. هذا هو الأسلوب الوحيد الذي يستخدم لتحديد إذا كان الحمض النووي قبل الملون يؤثر على إنزيمات التقييد. يقتصر هذا الأسلوب على إنزيمات التقييد المتوفرة تجارياً، إلا إذا كان لأحد علماء الحصول على إنزيمات التقييد الأخرى التي لم يتم سردها تجارياً. اعتماداً على الحمض النووي، وينبغي أن يكون الإنزيم اختيار نمط فرقة الحمض النووي ملموس ويكفي العصابات (> 3) تحديد ما إذا كان كامل طول جزيء الحمض النووي. أيضا، ينبغي أن يكون الحمض النووي أونميثيلاتيد إذا استخدمت مثلايشن الإنزيمات الحساسة. إذا كان الحمض النووي هو ميثليته، ثم لا تستخدم الإنزيمات الحساسة مثلايشن.

هذا الأسلوب وسيلة سهلة استخدام لتحديد إذا إنزيمات التقييد يمكن قص جزيئات الحامض النووي في التعرف على موقع ملطخة صبغ إينتيركالاتينج دون الحاجة إلى تصميم كبسولة تفجير ل موقع قطع معينة34. وسيكون التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب تحديد ما إذا كان المسمى فلوريسسينتلي جزيئات من تجربة كانت طول كامل باستخدام إنزيم تقييد وتحديد حجم العصابات الحمض النووي من الخلاصة، أو لتحديد ملامح مثلايشن من الحمض النووي الجزيئات. يمكن تحديد التجارب المستقبلية أيضا إذا نيكينج الإنزيمات تتأثر بالأصباغ سينين أو الأصباغ الفلورية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث بالمعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (نيجمس) (5605100122001)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، فضلا عن جامعة نبراسكا في برنامج البحوث الطالب (SSRP) الصيف كيرني (UNK)، و UNK زمالات البحوث الجامعية (العرف).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Unmethylated lambda DNA NEB N3013S
YOYO-1 ThermoFisher Scientific Y3601
TOTO-1 ThermoFisher Scientific T3600
POPO-1 ThermoFisher Scientific P3580
BOBO-1 ThermoFisher Scientific B3582
YOYO-3 ThermoFisher Scientific Y3606
TOTO-3 ThermoFisher Scientific T3604
POPO-3 ThermoFisher Scientific P3584
BamHI NEB R0136S
PmlI NEB R0532S
ScaI NEB R3122S
EcoRI  NEB R0101S
HindIII NEB R0104S
SmaI NEB R0141S
Tris Fisher BP152-1 Irritant
EDTA Fisher S316-212 Toxic
HCl Fisher S25358 Corrosive and irritant
Buffer 1 NEB B7201S NEB 1.1
Buffer 2 NEB B7202S NEB 2.1
Buffer 3 NEB B7204S NEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gel Lonza 50041
Acetic Acid Fisher S25118 Hazardous
Blue light transilluminator Dark Reader DR196 Wear correct eyewear 
Ethidium bromide Fisher 15585011 Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I camera Cannon
Apogee Model H4 Biorad 1704510
Power Pac Basic Power Supply Biorad 1645050 
Ficoll Fisher Scientific BP525-25
Bromophenol blue Fisher Scientific B-392
Xylene Cyanol Eastmen T1579

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
  2. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
  3. Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
  4. Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
  5. Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
  6. Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
  7. Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
  8. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  9. Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
  10. Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
  11. Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
  12. Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
  13. Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
  14. Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
  15. Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
  16. Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
  17. Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
  18. Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
  19. Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
  20. Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
  22. Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
  23. Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
  24. Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
  25. Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
  26. Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
  27. Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
  28. Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
  29. Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
  30. Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
  31. Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
  32. Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
  33. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 132، جل التفريد، توتو-1، يويو-1، بوبو-1، بوبو-1، توتو-3، 3 يويو، بوبو-3، بوبو-3، الهضم إنزيم التقييد
تحديد إذا كان الحمض النووي ملطخة "سينين صبغ يمكن هضمها" مع إنزيمات التقييد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maschmann, A., Masters, C., Davison, … More

Maschmann, A., Masters, C., Davison, M., Lallman, J., Thompson, D., Kounovsky-Shafer, K. L. Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes. J. Vis. Exp. (132), e57141, doi:10.3791/57141 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter