DNA molekülleri floresan mikroskopi için boyama bir deney sırasında görüntüleyebilmesi için bir bilim adamı sağlar. Burada sunulan yönteminde DNA molekülleri ile floresan boyalar önceden lekeli ve metilasyonu ve sigara metilasyonu hassas enzimleri ile sindirilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme
Bu makalede
Özet
Özet
DNA'ın görselleştirme floresan mikroskopi için boyalar siyanür boyalar gibi çeşitli kullanır. Bu boyalar onların yüksek benzeşme ve duyarlılık nedeniyle DNA için kullanılmaktadır. DNA molekülleri deney tamamlandıktan sonra tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için bir yöntem enzimleri ile DNA sindirerek tarafından lekeli molekülleri tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bir yöntem için fluorochrome ihtiyacım ne enzimler DNA lekeli belirlemek için gerekli değildir ancak, lekeli DNA enzimleri inhibe. Bu yöntemde, DNA boya ve DNA equilibrate izin veren bir siyanür boya ile bir gecede lekeli. Sonraki, lekeli DNA restriksiyon enzimi ile sindirilmiş, bir jel yüklenen ve electrophoresed. Deneysel DNA Özet bantları restriksiyon enzimi etkinliğini belirlemek için bir silico sindirimi karşılaştırılır. Beklendiği gibi grup aynı dizi Eğer reaksiyon tamamlandıktan. Kısmi sindirim belirtmek beklenenden daha fazla grup ve daha az bantları eksik sindirim gösterir. Bu yöntemin avantajı basitliğidir ve bir bilim adamı için bir restriksiyon enzimi gerekir ekipman kullanır tahlil ve Elektroforez jel. Bu yöntemin bir sınırlama enzimler için çoğu bilim adamı mevcut piyasada bulunan enzimler vardır; Ancak, herhangi bir enzimleri kullanılabilir.
Giriş
TOTO serisi (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 ve BOBO-3; Tablo 1) çeşitli deneyler DNA görselleştirme gerekli1,2,3,4,5,6,7, nerede olarak kullanılmaktadır 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlanması boyalar, tamponlar ve özel jel
-
Aşağıdaki çözümleri DNA veya lekeli DNA hazım boyama için hazırlayın.
- 1 x TE (Tris-HCl ve ethylenediaminetetraacetic asit; hazırlamak EDTA) arabelleği 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA mezun silindir veya volumetric flask kullanarak. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.
- Her boya aliquots olun: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tablo 1). 1 mM boya koyu amber içine 4 µL pipet veya 1,5 mL tüp siyah ve 1 x TE 36 µL eklemek, pipet kullanarak karıştırın; Bu konsantrasyon 100 µM boya çözüm (40 µL toplam) yapar. Her boya için bu adımı tamamlayın. 4 ° C'de ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İntercalating bir boya sindirerek DNA restriksiyon enzimi etkilerse, adımları doğru sırada olmalıdır belirlemek için (şekil 1) takip. Bir kez DNA lekeli ve belirli bir enzim ile sindirilmiş, jel resmini parçaları ve büyüklükleri (Şekil 2) sayısını belirlemek için alınabilir. Enzim verimlilik, beklenen görünür bant görünür grup numarasına göre bölünmüş toplam sayısı belirlemek için. Enzim verimliliği egale etti birlik, eğer bant s.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fluorescently etiketli DNA (şekil 1)sindirmek amacıyla bir dizi adım gereklidir. İlk olarak, DNA ile bir fluorochrome gecede lekeli. DNA daha kısa bir süre için siyanür dimer ile inkübe; Ancak, Carlsson vd. DNA çift kişilik gruplar her DNA boyutu nedeniyle eksik boyama20için oluşturulan bulundu. Bu sorunu gidermek için DNA çift kişilik grup oluşmasını önlemek için gece Boyanabilen. Bu protokol kritik bir adımdır. Boya için yeterince uzun bir .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu araştırma için genel tıbbi bilim (NIGMS) (5605100122001), bir bileşeni Nebraska Üniversitesi Kearney (UNK) yaz öğrenci araştırma programı (SSRP) ve UNK yanı sıra ulusal kurumları Sağlık (NIH) Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi Lisans araştırma bursu (URF).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Metillenmemiş lambda DNA'sı | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI ve nbsp; | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Tahriş Edici |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toksik |
| HCl | Fisher | S25358 | Aşındırıcı ve tahriş |
| edici Tampon 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Tampon 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Tampon 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| Yüksek jelleşme sıcaklığı agaroz jel | Lonza | 50041 | |
| Asetik Asit | Fisher | S25118 | Tehlikeli |
| Mavi ışık aydınlatıcı | Dark Reader | DR196 | Doğru gözlük takın |
| Etidyum bromür | Fisher | 15585011 | Kanserojen; diğer alternatifler Nancy 520, Jel kırmızısı, vb. |
| Cannon EOS Rebel T3I kamera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Temel Güç Kaynağı | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromofenol mavisi | Fisher Scientific | B-392 | |
| Ksilen Siyanol | Eastmen | T1579 |
Kaynaklar
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
