Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/57141
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

Summary

DNA molekülleri floresan mikroskopi için boyama bir deney sırasında görüntüleyebilmesi için bir bilim adamı sağlar. Burada sunulan yönteminde DNA molekülleri ile floresan boyalar önceden lekeli ve metilasyonu ve sigara metilasyonu hassas enzimleri ile sindirilir.

Abstract

DNA'ın görselleştirme floresan mikroskopi için boyalar siyanür boyalar gibi çeşitli kullanır. Bu boyalar onların yüksek benzeşme ve duyarlılık nedeniyle DNA için kullanılmaktadır. DNA molekülleri deney tamamlandıktan sonra tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için bir yöntem enzimleri ile DNA sindirerek tarafından lekeli molekülleri tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bir yöntem için fluorochrome ihtiyacım ne enzimler DNA lekeli belirlemek için gerekli değildir ancak, lekeli DNA enzimleri inhibe. Bu yöntemde, DNA boya ve DNA equilibrate izin veren bir siyanür boya ile bir gecede lekeli. Sonraki, lekeli DNA restriksiyon enzimi ile sindirilmiş, bir jel yüklenen ve electrophoresed. Deneysel DNA Özet bantları restriksiyon enzimi etkinliğini belirlemek için bir silico sindirimi karşılaştırılır. Beklendiği gibi grup aynı dizi Eğer reaksiyon tamamlandıktan. Kısmi sindirim belirtmek beklenenden daha fazla grup ve daha az bantları eksik sindirim gösterir. Bu yöntemin avantajı basitliğidir ve bir bilim adamı için bir restriksiyon enzimi gerekir ekipman kullanır tahlil ve Elektroforez jel. Bu yöntemin bir sınırlama enzimler için çoğu bilim adamı mevcut piyasada bulunan enzimler vardır; Ancak, herhangi bir enzimleri kullanılabilir.

Introduction

TOTO serisi (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 ve BOBO-3; Tablo 1) çeşitli deneyler DNA görselleştirme gerekli1,2,3,4,5,6,7, nerede olarak kullanılmaktadır 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. siyanür dimer aile onların kuantum verimi, ışık hassasiyeti ve DNA molekülleri18,19,20için yüksek ilgi nedeniyle yaygın olarak kullanılır. Siyanür dimer boyalar Floresans21100-1000 kat artış var büyük seçicilik çift iplikçikli DNA için ve ne zaman ara var. Pyridinium boya maddeler, araçlar (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 ve TOTO-3) onların quinolium boya daha karşılıkları (Tablo 1)22(BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 ve POPO-3) bir daha kısa emisyon dalga boyu var. Aynı zamanda, DNA'ya ara siyanür dimer kuantum verimi yüksektir (0.2 - 0,6)22. Ancak, bir enzim bir DNA molekülü2 metilasyonu profili belirleme veya23 zaten ile floresan boya lekeli bir DNA molekülünün germek için kullanmak ne enzimler lekeli DNA sindirmek belirlemek için bir metod gerekir. DNA'ya intercalates boya herhangi bir tür veya DNA substrat discernable örnek verir herhangi bir enzim için bu yöntemi kullanabilirsiniz.

Meng vd. ilk prestained DNA yoluyla farklı boya24çeşitli kullanarak Jel Elektroforez sindirim oranı belirlenir. Maschmann ve ark. delved derin boyalar TOTO aileye bakmak için. Her ikisi de belirli bir boya ile lekeli DNA restriksiyon enzimi25ile sindirmek Eğer görmek için lekeli DNA sindirim oranı belirlenir. Diğer yöntemler optik cımbız26 veya NMR27kullanarak DNA ile ara boya etkileri bağlama çalışma. Her iki yöntem özel ekipman gerektirir; ise bu yöntem çoğu moleküler biyoloji laboratuarları bir boya olup olmadığını belirlemek zorunda ekipman sağlar, restriksiyon enzimi sindirim ile etkilemektedir.

Ayrıca, belirli bir molekül uzunluğunu ölçmek için diğer yöntemleri, optik eşleme günahı DNA molekülleri bir yüzey üzerinde uzamış ve streç ve parçaları boyutunu belirlemek için DNA sindirilir. Boya enterkalasyon kontur uzunluğu fluorescently lekeli DNA moleküllerinin ve bağlı olarak kullanılan boya artırmak için gösterilmiştir, kontur uzunlukları farklı21. Bu yöntem genleri1,3,4,6,13,28,29,30, çeşitli kullanıldığında vardır 31. molekülleri, boya ve enzim bağlı olarak önceden lekeli olsaydı, ancak, enzim DNA ile belirli bir boya lekeli kesmek mümkün olmayabilir. Bu nedenle, bu yöntem ile belirli bir boya lekeli DNA bir enzim ile sindirilmiş Eğer belirler. Ayrıca, boya ve boya DNA hareketliliğini kullanıldığında, konsantrasyon bağlı olarak bir jel bantlarında daha yavaş boya baz çifti32 arasında eklemek yer açmak için yerel DNA kısmi DNA omurgası gevşemek nedeniyle göç edecek .

Ancak, bazen bu boyalar olabilir kısmen veya tamamen belirli enzimleri7,24eylem inhibe. Bu enzim, belirli sıra tanımasını engelleyebilir floresan boyalar ve eki neden olduğu DNA yapısal bir değişiklik nedeniyle düşünülmektedir. Bu boyalar enzimleri etkilemesi anlamak metilasyonu profil veya uzatma lekeli DNA'ın gerekli olduğu deneylerde yardımcı olabilir.

Bizim yöntem, DNA faiz fluorochrome ile lekeli ve restriksiyon enzimi ile sindirilir. O zaman DNA görüntüsü, bir jel üzerinde electrophoresed ve restriksiyon enzimi sindirim oranı ölçüldü. Enzimleri dayalı bir jel üzerinde kesme desen olarak seçilmiştir. Çok fazla grup örtüşme DNA gruplarından neden ve çok az bantları DNA molekülünün tam bir resim vermek değil. Profil sindirilir DNA molekülünün belirlemek için tatlı bir nokta var; Bu nedenle, kullanılan DNA ve enzim bağlı olacaktır. Bu yöntemin bir avantajı basitliğidir; Sadece bir kısıtlama sindirim ve Jel Elektroforez cihazları gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması boyalar, tamponlar ve özel jel

  1. Aşağıdaki çözümleri DNA veya lekeli DNA hazım boyama için hazırlayın.
    1. 1 x TE (Tris-HCl ve ethylenediaminetetraacetic asit; hazırlamak EDTA) arabelleği 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA mezun silindir veya volumetric flask kullanarak. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.
    2. Her boya aliquots olun: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tablo 1). 1 mM boya koyu amber içine 4 µL pipet veya 1,5 mL tüp siyah ve 1 x TE 36 µL eklemek, pipet kullanarak karıştırın; Bu konsantrasyon 100 µM boya çözüm (40 µL toplam) yapar. Her boya için bu adımı tamamlayın. 4 ° C'de mağaza
      Not: photobleaching veya boya bozulma önlemek için ışık boya kullanılmasını önlemek.
    3. Arabellek 1 10 mM Bis-Tris-propan-HCl, 10 mM MgCl2ve 100 µg/mL sığır serum albumin (BSA) kullanarak hazırlayın. Arabellek 2-50 mM NaCl, kullanımı hazırlamak 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2ve 100 µg/mL BSA. Tampon 3 50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA kullanarak hazırlayın. Her enzim çalışması için belirli bu arabellekleri birini gerektirir.
  2. Aşağıdaki çözümleri Jel Elektroforez için hazırlayın.
    1. 6 yükleme x boya %0.25 bromophenol birleştirerek mavi, olun % 0.25 Ksilen cyanol, % 15 Ficoll dH2O. mağaza oda sıcaklığında.
    2. Jel, dışarı yüksek jelleşme sıcaklık (HGT) özel bir Erlenmeyer flask 0,07 g tartmak % 0.7 özel yapmak için 1 x TAE arabellek 100 mL ekleyin ve ters bir kabı balonun üstüne yerleştirin.
      1. Çözüm sıcak tabakta ısı kadar şişesi ve üst için kayan nokta alt formda kabarcıklar başlayacak.
      2. Çözüm sıcak plaka kaldırmak için balonun ile çıplak bir el dokundu ve jel kuyuları oluşturmak için jel tarak ile 24.5 cm x 21,8 cm jel kalıp içine dökün kadar çözüm soğumaya bırakın.
      3. Pipet ucu ile haşhaş tarafından baloncuklar tarak ya da jel yüzeyi kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca katılaşmaya jel izin. Bu jel veya kirlenme kurutma önlemek 1 hafta için plastik wrap sarılı bir buzdolabı (4 ° C) depolanabilir. Nasıl çalıştırılacağı hakkında daha fazla bilgi için bir jel başvurmak için Lee vd. 33 .
        Not: 30 bireysel wells ile jel tarak kullanın. Her şey 4.5 mm 2 mm derinliğe ile geniş olmalıdır. Kuyu yüksekliğini jel kutusu dökülür, miktarına bağlı olacaktır.
    3. 1 x TAE (Tris - asetat - EDTA) arabelleği 40 mM Tris-HCl, 20 mM Asetik asit ve 1 mM EDTA kullanarak hazırlayın. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.

2. lekeli DNA hazırlanması

  1. Lambda DNA (300-800 ng) boyalar farklı aliquots kullanarak leke. Her boya (tablo 1) test, restriksiyon enzimi başına 48 reaksiyonlar olmak üzere toplam altı farklı konsantrasyonlarda olacaktır. Aşağıdaki işlem için 1 tepki (şekil 1) bir küme özetliyor.
    1. 1 x TE 100 kullanarak lambda DNA seyreltik ng / µL. mağaza 4 ° c ' Bir çözüm 300 µL hacmi ile olun.
    2. Bazlar lambda DNA leke. "Denemeler" den beklenen her grup için 75-100 ng/bant tahmin ediyoruz. Boya konsantrasyonları 1.9 µM, 3.8 µM, 19.4 µM, 32.2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM üretmek için uygun miktarda ekleyebilirsiniz / 100 ng DNA'ın.
    3. Gecede kuluçkaya (15 h - 18 h) 4 ° C'de
    4. Denetim25hareket günahı bir tepki bırak.
      Not: bazlar DNA sindirim tepki için kullanın. Metilasyon duyarlı enzimler DNA metillenmiş bölgelerde kesemezsin ve eksik bir sindirim bir görünüm verecektir.

3. restriksiyon enzimi tahlil hazırlanması

  1. Özet Bu enzim prestained DNA (şekil 1) sindirmek olabilir belirlemek için bir restriksiyon enzimi ile DNA lekeli.
    1. Ertesi gün 20 U restriksiyon enzimi, 3 µL uygun arabellek (Tablo 2) ve toplam 30 µL distile, autoclaved ve süzülmüş su ekleyin. Her enzim reaksiyon için arabellek üreticinin Web sitesinde bulunabilir en yüksek kesme verimliliği ile seçin.
    2. Maschmann ve arkiçinde kullanılan 6 enzimler için Tablo 2'de listelenen en iyi enzim aktivitesinin sıcaklığında su banyosu tepkiler yer., 2-4 h (Tablo 2)25.
    3. Reaksiyon 0,5 M EDTA pH 8.0 2 µL ekleyerek durdurmak.

4. bir özel jel DNA'da lekeli Electroeluting

  1. Taraf (Adım 1.2.2) 24.5 cm x 21,8 cm jel kalıptan çıkarın ve jel Jel Elektroforez kutusuna yerleştirin. 1 x TAE arabelleği 2.5 L kutusu dökün. Dikkatli bir şekilde böylece kuyu erişilebilir33jel tarak jel çıkarın.
  2. Restriksiyon enzimi tepkiler üzerine bir plastik film pipette ve her reaksiyon boya yükleme x 6 ile birleştirir. Her reaksiyon çözüm için boya başına 5-6 µL DNA çözüm (1 x) yükleme x 6 1 µL ekleyin. Öyleyse karşılıklar pipette (yükleme boya içeren < 18 µL) kuyu içine.
  3. 1 kb merdivenin 1 µL, 1 x TE 9 µL ve boya yükleme x 6 2 µL karıştırın. Çözüm başka çözümler kanattan kuyu yükleyin.
  4. Koyu mavi veya siyah kağıt veya kumaş ile jel kutu örtmek. Jel kutusu 30 V güç kaynağı ayarlayın ve gecede çalıştırın bir güç kaynağı için (15-20 h) bağlayın. Jel, photocleavage etiketli DNA'ın önlemek için çalışırken ışıkları kapatın.
  5. Ertesi sabah güç kaynağını kapatmak. Tepsi kullanarak jel al ve bir konteyner ile 45 µL etidyum bromür ve 1 L 1 x TAE arabelleği aktarmak. Karanlık oda sıcaklığında veya kapak konteyner folyo ışığa maruz kalma önlemek için saklayın. Leke, oda sıcaklığında en az 45 dakika için jel izin.
    Dikkat: etidyum bromür kullanım ile eldiven ve koruyucu gözlük giymek. Konteynerin etidyum bromür solüsyon içeren ve jel atmadan temizlerken, kullanılan etidyum bromür ile başa çıkmak konusunda bilgi almak senin Birleşik elden çıkarma yönergelere başvurun; Ayrıca, diğer lekeleri etidyum bromür yerine yararlı.

5. özel jel görüntüleme

  1. Jel 400-500 nm arasında en fazla ışık verimi yayar mavi bir ışık transilluminator üstüne yerleştirin. Merkeze bağlı kamera ile fotoğraf çekmek.
    Dikkat: kapak ışığı için kullanın ve ışık kaynağında dönüm önce koruyucu gözlük koymak emin olun.
    Not: Bu adımı da herhangi bir UV ışık kaynağı veya standart jel tarayıcı kullanılarak tamamlanabilir.
  2. Dosyayı ImageJ durum çubuğuna sürükleyerek ImageJ içinde resimleri görüntüleme ve görüntü çıkacaktır.
  3. Sindirim oranı deneme için beklenen silico jel desen jöleye bands karşılaştırarak belirle. Sindirim oranı belirlemek için deneysel grup dizi DNA bantları24,25beklenen numarasına göre bölünür. Deneysel sindirilir DNA bant deseni beklenen desen varsa, sindirim oranı 1'dir. Desen beklenenden daha fazla parçaları varsa, sindirim 1'den büyük oranıdır. Desen beklenenden daha az parçaları varsa, sindirim birden oranıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İntercalating bir boya sindirerek DNA restriksiyon enzimi etkilerse, adımları doğru sırada olmalıdır belirlemek için (şekil 1) takip. Bir kez DNA lekeli ve belirli bir enzim ile sindirilmiş, jel resmini parçaları ve büyüklükleri (Şekil 2) sayısını belirlemek için alınabilir. Enzim verimlilik, beklenen görünür bant görünür grup numarasına göre bölünmüş toplam sayısı belirlemek için. Enzim verimliliği egale etti birlik, eğer bant sayısı beklenen ve görülen maç. Sonra beklenen jel üzerinde daha fazla grup varsa, değeri birden büyük ve kısmen sindirilir tepkiler gösterir. Sonra beklenen daha az gruplar varsa, sonra birden, eksik sindirim gösteren değerdir. Şekil 2a, bantları hareketliliğini azalmıştır, şerit 3 ve 4 gösteri wells doğru kaydırmaya bantları neden. Yolları 1 ve 2, bantları denetimi eşleşecek şekilde boya miktarı hareketlilik fark, etkilemez. Kısmi sindirim gösterir yüzden şekil 2a, denetim, daha daha fazla gruplar şerit 5 ve 6 göster. Demek oluyor ki, boyalar DNA tanıma sitesinde Bu enzim için bölünme etkilenen. Şekil 2b, tüm boya DNA sindirim ile müdahale değil bu yüzden tüm boya konsantrasyonları için bantları görülmektedir bekleniyor. Şekil 2 c parça hareketliliği ile renkli yıldız kayar.

Boya konsantrasyon -1, hareketliliği ile boyalar için azalır artar. Bantlar yaklaşık boyutu belirlemek için bir denetim nerede yerel DNA molekülleri beklenen bilmek lekeli DNA (şekil 2a) göre gerekir. Ölçüde bu-1 boyalar mı, parça boyutu (şekil 2b) belirlemek daha kolay oldu -3 ile boyaları hareketliliği azaltamaz. Hareketlilik fark Maschmann vd. görüldüğü gibi kullanılan, boya tipi nedeniyle olduğunu 25. Bu boyalar varyansını boyalar yapıları nedeniyle görülür. Boya -3 için aromatik yan arasında bağlayıcı -1'den daha uzun. Boya biraz daha farklı neden azdır hareketlilik shift-3 boyalar için açıklayabilir bağlayıcı boyut farkı nedeniyle intercalate.

DNA yok veya DNA bantları jel çok zayıf olan, DNA konsantrasyonu artırmak gereklidir. Eğer DNA konsantrasyonu artar, ancak, daha sonra gerekli boya miktarı da DNA oranı için boya doğru konsantrasyonu tutmak için artacak.

Figure 1
Resim 1 : Fluorochrome sindirerek DNA molekülleri etiketli bir şematik adımları gereklidir. DNA ve YOYO-1 veya başka bir boya TOTO serisinden bir siyah tüp eklenir ve inkübe gecelik (O/N; 15-20 h). Restriksiyon enzimi bir tüp eklenir; Bu bir kuluçka, tercih edilen sıcaklığında 2-4 h (Tablo 2) için yerleştirilir. 1 x TAE arabellek ile yapılan bir dalmış % 0.7 özel jel içine örnekleri yükleyin. Koyu renkli kağıt kapakları jel ise jel kutusu ve ışıklar kapalıdır boya photocleavage önlemek için gece koştu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Kısıtlama sindirim DNA siyanür dimer boya ile ara. (bir) Lambda DNA lekeli farklı konsantrasyonları YOYO-1 gecede (lane C: sindirilmiş lambda DNA yok boya (kontrol), lane 1: 1.9 ng, lane 2: 3,8 ng, lane 3: 19,4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: 48.3 ng, lane 6: 63,5 ng, boya başına 100 ile DNA'ın ng) ve sonra dige 2-4 h için 37 ° C'de sted ile EcoRI. Bütün tepkiler electrophoresed (E = 0,85 V/cm) bir % 0.7 Yüksek jelleşme sıcaklığına (HGT) özel jel yapılan ile 1 x TAE tampon (1 x TAE; 40 mM Tris-HCl, 20 mM Asetik asit, 1 mM EDTA). Jelleri etidyum bromür ile lekeli ve mavi bir ışık transilluminator bir kamera için birleştiğinde ile görüntüsü. Lane L 1 kb merdiven (boyutları, kb);. Lane λ tam uzunlukta lambda DNA'sı; Lane E (boyutları, kb) beklenen grup kalıptır. (b) Lambda DNA YOYO-3 ile lekeli (lane 1: 1.9 ng, lane 2: 3,8 ng, lane 3: 19,4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: 48.3 ng, lane 6: 63,5 ng başına 100 boya, DNA'ın ng) ve HindIII ile 37 ° C'de sindirmek (nasıl YOYO-1 konsantrasyon hareketliliği kaymıştır görmek için,c) artar, renkli yıldız işareti her grup için her YOYO-1 konsantrasyon yanında yer alır. Örneğin, grubun 3.5 KB her grup yanında kırmızı bir yıldız işareti her YOYO-1 konsantrasyonu vardır. Lane 5 ve 6 beklenmeyen bantlarında grupların yanında bir yıldız işareti yok. Şekil Maschmann ve ark. değiştirilir 25. (2017) nükleozit, nükleotit, nükleik asitler ve telif hakkı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Kimyasal adı Kısaltılmış adı EX / Em (nm)
[(1-1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] bis [4-[(3-metil-2(3H)-benzothiazolylidene) metil]]-, tetraiodide TOTO-1 514/533
1, 1 ' - (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) BIS [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} YOYO-1 491/509
2, 2 '-[1,3-pervane-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-metil]-, tetraiodide POPO-1 434/456
2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} BOBO-1 462/481
2, 2 '-{[4,8-bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] bis [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide TOTO-3 642/660
1, 1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide YOYO-3 612/631
2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide POPO-3 534/570
2,2'-{Propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)Propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-Methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraiodide BOBO-3 570/602

Tablo 1: Boyalar TOTO ailesi isimleri ile IUPAC adlarıyla emisyon (Em) ve uyarma (Ex) maximima22kısaltılır.

Enzim Metilasyon duyarlı Arabellek Su banyo sıcaklığı
BamHI Hayır 2 37 ° C
EcoRI Evet 2 37 ° C
HindIII Hayır 2 37 ° C
PmlI Evet 1 37 ° C
ScaI Hayır 2 37 ° C
SmaI Evet 3 25 ° C

Tablo 2: Tabloda listelenen bu deneylerde kullanılabilecek olası enzimler bir alt kümesidir. Üç enzimler metilasyonu hassas ve üç metilasyonu hassas değil. Enzimler ve kuluçka sıcaklıklar için kullanılan arabellekleri her enzim için listelenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescently etiketli DNA (şekil 1)sindirmek amacıyla bir dizi adım gereklidir. İlk olarak, DNA ile bir fluorochrome gecede lekeli. DNA daha kısa bir süre için siyanür dimer ile inkübe; Ancak, Carlsson vd. DNA çift kişilik gruplar her DNA boyutu nedeniyle eksik boyama20için oluşturulan bulundu. Bu sorunu gidermek için DNA çift kişilik grup oluşmasını önlemek için gece Boyanabilen. Bu protokol kritik bir adımdır. Boya için yeterince uzun bir zaman inkübe değil, boya-DNA Equilibrium'da olmayabilir ve bir çift bantlama deseni verecektir. Eğer bu does vuku bulmak, daha uzun bir süre için equilibrate DNA-boya karışım izin verin.

Ardından, restriksiyon enzimi DNA-boya karışıma eklenir ve 2-4 h her enzim için belirli bir ısıda sindirilir. DNA metilasyonu duyarlı enzimler için bazlar olması gerekir. Yoksa, kesme DNA metillenmiş bölgelerde metillenmiş DNA restriksiyon enzimi yapılmasını engeller. Buna ek olarak, reaksiyon doğru tampon ve enzim için sıcaklık inkübe gerekir. Her enzim her arabellekte arabellekleri ve enzim etkinliği bir listesi vardır. Arabellek enzim aktivitesi % 100, mümkünse seçin. Sıcaklık gelince, doğru sıcaklıkta inkübe emin olun. Yoksa, enzim aktivitesi kaybetmek ya da sıcaklık çok yüksek ise denatüre neden olabilir. EDTA reaksiyonu durdurmak için kullanılmaktadır. Nerede enzimler satın alınan şirket en uygun sıcaklık ve bu enzim için arabellek koşullar içeren bir grafik olacak. Denetimin sağ moleküler ağırlık, enzim süresinin dolmadığını denetleyin bantları doğru sayıda vermezse kuluçka süresini artırmak veya kontrol emin olmak için sıcaklık Bu enzim için doğrudur.

Reaksiyon tamamlandığında, örnekleri bir jel yüklenebilir. İlk olarak, bir jel jel konteyner içine yüklenen ve 1 x TAE arabellekte dalmış. Ardından, sindirilmiş DNA boya yükleme ile karıştırılır ve çözüm jel kuyu yüklenir. Kapağı üzerinde kaydı ve teller jel kutusuna eklenir. Bantladım, karanlık bir kağıt, kapak kapak ve taraf asmak için kapak üstüne yerleştirilir. Diğer kritik adım örnekleri özellikle jel çalışırken her zaman, gelen ışık korunur olduğunu. Güç kaynağı açık olmalı ve ışıkları odasına kapattı. DNA'ın photocleavage önlemek için örnekleri her zaman gelen ışık korunmuş olur. Hiçbir karanlık kağıt ise, karanlık bir kumaş de kullanılabilir. DNA taşınmaz kutusu için kabloların takılı olduğundan ve çalıştırma düğmesi basılı emin olun.

Sabah, jel jel kutusundan çıkarın ve jel etidyum bromür içeren bir konteyner içine yük. Etidyum bromür mavi ışık transilluminator (Şekil 2) altında DNA bantları görmek için bize izin verir. Diğer boyalar etidyum bromür yerine kullanılabilir. Bir fotoğraf makinesi-ebilmek var olmak dağ resimleri jel yakalamak için mavi ışık transilluminator. Kurulumuna bağlı olarak, bir görüntüleme istasyonu da yararlı olabilir.

Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanmak için herhangi bir boya intercalates veya DNA, sadece TOTO serisi lekeleri. Maschmann ve ark. Meng ve arktarafından geliştirilen bir teknik değiştiren. Fluorescently DNA lekeli olup olmadığını belirlemek için enzimleri24,25ile sindirmek. Bu önceden lekeli DNA enzimleri etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılan tek yöntemdir. Bir bilim adamı ticari olarak listelenmeyen diğer enzimleri erişim olmadıkça bu yöntemi enzimleri için piyasada bulunan sınırlıdır. DNA bağlı olarak, seçilen enzim discernable DNA bant deseni ve yeterli bantları olmalıdır (> 3) DNA molekülünün tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için. Ayrıca, DNA metilasyonu duyarlı enzimler kullandıysanız bazlar olmalıdır. Eğer DNA metillenmiş, metilasyon duyarlı enzimler kullanmayın.

Bu yöntem enzimleri ile intercalating bir boya astar için verilen kesme site34tasarım gerek kalmadan lekeli tanıma sitesinde DNA molekülleri kesmek eğer belirlemek için kolay bir yoldur. Bu yöntemin gelecekte uygulamaları fluorescently molekülleri bir deneme etiketli olup olmadığını belirlemek için tam uzunlukta bir restriksiyon enzimi kullanarak ve DNA bantları "denemeler" den veya DNA metilasyonu profillerini belirlemek için boyutunu belirleme olacağını molekülleri. Gelecekteki deneyler de nicking enzimler siyanür boyalar veya diğer floresan boyalar tarafından etkilenip etkilenmediğini belirlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma için genel tıbbi bilim (NIGMS) (5605100122001), bir bileşeni Nebraska Üniversitesi Kearney (UNK) yaz öğrenci araştırma programı (SSRP) ve UNK yanı sıra ulusal kurumları Sağlık (NIH) Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi Lisans araştırma bursu (URF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Unmethylated lambda DNA NEB N3013S
YOYO-1 ThermoFisher Scientific Y3601
TOTO-1 ThermoFisher Scientific T3600
POPO-1 ThermoFisher Scientific P3580
BOBO-1 ThermoFisher Scientific B3582
YOYO-3 ThermoFisher Scientific Y3606
TOTO-3 ThermoFisher Scientific T3604
POPO-3 ThermoFisher Scientific P3584
BamHI NEB R0136S
PmlI NEB R0532S
ScaI NEB R3122S
EcoRI  NEB R0101S
HindIII NEB R0104S
SmaI NEB R0141S
Tris Fisher BP152-1 Irritant
EDTA Fisher S316-212 Toxic
HCl Fisher S25358 Corrosive and irritant
Buffer 1 NEB B7201S NEB 1.1
Buffer 2 NEB B7202S NEB 2.1
Buffer 3 NEB B7204S NEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gel Lonza 50041
Acetic Acid Fisher S25118 Hazardous
Blue light transilluminator Dark Reader DR196 Wear correct eyewear 
Ethidium bromide Fisher 15585011 Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I camera Cannon
Apogee Model H4 Biorad 1704510
Power Pac Basic Power Supply Biorad 1645050 
Ficoll Fisher Scientific BP525-25
Bromophenol blue Fisher Scientific B-392
Xylene Cyanol Eastmen T1579

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
  2. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
  3. Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
  4. Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
  5. Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
  6. Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
  7. Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
  8. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  9. Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
  10. Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
  11. Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
  12. Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
  13. Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
  14. Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
  15. Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
  16. Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
  17. Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
  18. Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
  19. Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
  20. Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
  22. Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
  23. Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
  24. Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
  25. Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
  26. Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
  27. Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
  28. Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
  29. Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
  30. Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
  31. Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
  32. Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
  33. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).

Tags

Biyokimya sayı 132 Jel Elektroforez TOTO-1 YOYO-1 POPO-1 BOBO-1 TOTO-3 YOYO-3 POPO-3 BOBO-3 restriksiyon enzimi sindirim
DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maschmann, A., Masters, C., Davison, … More

Maschmann, A., Masters, C., Davison, M., Lallman, J., Thompson, D., Kounovsky-Shafer, K. L. Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes. J. Vis. Exp. (132), e57141, doi:10.3791/57141 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter