Summary
형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA 분자를 얼룩이 지는 과학자를 실험 기간 동안 그들을 볼 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법에서 DNA 분자는 미리 형광 염료와 스테인드 하 고 메 틸 화 및 비 메 틸 화 과민 한 금지 효소로 소화.
Abstract
형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA의 시각화 cyanine 염료 등 염료의 다양 한을 사용합니다. 이 염료는 DNA에 대 한 그들의 높은 선호도와 감도 활용 됩니다. DNA 분자는 실험의 완료 후 전체 길이 인지 파악 하는 방법 스테인드 분자 DNA를 제한 효소로 소화 하 여 전체 길이 인지 확인 필요 합니다. 그러나, 스테인드 DNA 메서드 하나 형광 색소를 사용할 수 있는 어떤 효소 DNA 스테인드 결정 하는 데 필요한 그래서는 효소를 억제 수 있습니다. 이 방법에서는 DNA는 염료 및 DNA equilibrate를 하려면 밤새 cyanine 염료와 스테인드. 다음, 스테인드 DNA는 제한 효소로 소화, 젤에 로드 이며 electrophoresed. 실험적인 DNA 다이제스트 밴드 제한 효소의 활동을 결정 하기 위해 실리콘에 다이제스트 비교 됩니다. 만약 예상 대로 동일한 수 밴드의 있으면, 반응 완료 됩니다. 더 밴드 부분 소화를 나타내는 예상 보다 적은 밴드 불완전 소화를 나타냅니다. 이 방법의 장점은 단순 하 고 그것은 그 과학자는 제한 효소에 대 한 필요 장비를 사용 하 여 시험 하 고 젤 전기 이동 법. 이 방법의 한계는 대부분의 과학자 들은 수 효소는 상업적으로 이용 가능한 효소; 그러나, 어떤 제한 효소 사용 될 수 있습니다.
Introduction
토토 시리즈 (토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 그리고 보 보-3; 표 1) DNA의 시각화가 필요한1,2,3,,45,6,7, 실험의 다양 한 활용 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. cyanine 이합체 가족은 그들의 양자 수율, 감도, 및 DNA 분자18,,1920에 대 한 높은 선호도 널리 사용 된다. Cyanine 이합체 염료 좋은 선택도 두 배 좌초 된 dna와 삽입 된 형광21의 100 ~ 1000 배 증가 했습니다. Pyridinium 염료 (요요-1, 토토 1, 요요-3, 그리고 토토-3) 그들의 quinolium (보 보-1, 포포-1, 보 보-3, 그리고 포포-3) 대응 (표 1)22염색 보다 짧은 방출 파장을가지고. 또한, DNA로 삽입 된 cyanine 이합체의 양자 수율은 높은 (0.2-0.6)22. 그러나, DNA 분자2 의 메 틸 프로필을 확인 하거나 스트레칭23 형광 염료와 스테인드 이미 DNA 분자의 효소를 사용 하 여 어떤 효소 스테인드 DNA를 소화할 것 이다 결정 하는 방법을 필요 합니다. 모든 종류의 DNA에 intercalates 염료 또는 어떤 효소 DNA 기판의 뚜렷한 패턴을 제공 하는이 방법에 대 한 사용할 수 있습니다.
멩 외. 먼저 prestained DNA 젤 전기 이동 법 다른 염료24의 다양 한 사용을 통해의 소화 속도 결정. Maschmann 외 에 파 놓은 광산 염료의 토토 가족 보고 깊은. 둘 다 특정된 염료와 스테인드 DNA 제한 효소25소화 수 경우 보고 스테인드 DNA의 소화 속도 결정. 다른 방법 광학 핀셋26 또는27NMR 사용 하 여 DNA로 삽입 된 염료의 바인딩 효과 연구. 어느 방법을 사용 하려면 전문된 장비; 반면,이 방법을 사용 하면 대부분의 분자 생물학 실험실 염료를 결정 해야 하는 장비는 금지 효소 소화를 방해 합니다.
또한, 주어진된 분자의 길이 측정 하는 다른 방법, 광학 매핑 표면에 흠 없는 DNA 분자를 길쭉한 있으며 스트레치 조각의 크기를 결정 하는 DNA를 소화. 염료의 윤 윤곽선 길이 놓여있는지 스테인드 DNA 분자와 염료 사용에 따라 증가 표시 되었습니다, 그리고 윤곽선 길이 다른21. 이 메서드는 게놈1,3,4,6,13,,2829,30, 의 다양 한 이용 그러나 31., 분자 염료 및 효소에 따라 미리 묻은 경우, 효소 수 없습니다 특정된 염료와 스테인드 DNA를 잘라. 따라서,이 메서드는 특정된 염료와 스테인드 DNA 효소와 함께 소화 수 있습니다 경우 결정 합니다. 또한, 염료와 염료 활용, DNA의 이동성의 농도 따라 젤에 밴드 마이그레이션됩니다32의 기본적인 쌍 사이 삽입할 염료에 대 한 공간을 만들기 위해 DNA 등뼈의 부분 해제로 인해 네이티브 DNA 보다는 더 느리게 .
그러나, 때로는 이러한 염료 수 부분적으로 또는 완전히 특정 제한 효소7,24의 행동을 억제. 이 효소의 특정 시퀀스를 인식 되지 않을 수 있습니다 형광 염료의 부착으로 인 한 DNA 구조 변경 생각 이다. 이러한 염료 제한 효소에 미치는 영향을 이해 실험 메 틸 프로필 또는 스테인드 DNA의 스트레칭은 필요에서 도울 수 있다.
우리의 방법에 DNA의 형광 색소로 얼룩진 고 금지 효소로 소화. 다음 DNA 몇 군데, 젤에 electrophoresed 되었다 그리고 금지 효소 소화 속도 측정 했다. 금지 효소에는 젤 컷된 패턴에 따라 선택 되었다. 너무 많은 악대 DNA 밴드의 중복 발생 하 고 너무 몇 밴드 DNA 분자의 완전 한 그림을 포기 하지 않았다. 명당; 소화 DNA 분자의 프로필을 확인할 수 있다 따라서, 그것은 사용 하는 DNA, 효소에 따라 달라 집니다. 이 방법의 장점은 단순; 그것만 제한 소화와 젤 전기 이동 법에서 사용 하는 장비를 요구 한다.
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Protocol
1. 염료, 버퍼의 Agarose 젤 준비
-
얼룩이 DNA 또는 스테인드 DNA의 소화에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
- 1 x 테 (Tris HCl 및 ethylenediaminetetraacetic 산; 준비 EDTA) 버퍼 10 mM Tris HCl과 1 mM EDTA 졸업된 실린더 또는 부피 측정 플라스 크를 사용 하 여. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.
- 각 염료의 aliquots 만들기: 토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 보 보-3 (표 1). 어두운 주황색으로 1mm 염료의 4 µ L 플라스틱 또는 블랙 1.5 mL 튜브 및 1 x 테의 36 µ L을 추가, 피 펫을 사용 하 여 혼합 이 집중은 100 µ M 염료 솔루션 (총 40 µ L)입니다. 각 염료에 대 한이 단계를 완료 합니다. 4 ° c.에 게
참고: photobleaching 또는 염료의 저하를 방지 하기 위해 빛을 염료를 노출 하지 마십시오. - 1 10 mM Tris, Bis, HCl, 프로 판, 10 m m MgCl2및 100 µ g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 버퍼 2 50 mM NaCl를 사용 하 여 준비 10 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 100 µ g/mL BSA. 3 50 mM 칼륨 아세테이트, 트리 아세테이트 20 mM, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 각 효소 기능을 이러한 특정 버퍼 중 하나 필요 합니다.
-
젤 전기 이동 법에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
- 확인 로드 x 6 블루, 0.25 %bromophenol 결합 하 여 염색 0.25% 자일 렌 cyanol, 15% Ficoll dH2오가 실내 온도에.
- 0.7 %agarose 젤, 삼각 플라스 크에 높은 고 온도 (HGT) agarose의 0.07 g 밖으로 무게, 100 mL 1 x TAE 버퍼의 추가 플라스 크 위에 거꾸로 비 커를 배치.
- 거품 형태로 플라스 크와 상단에 부동의 하단에 시작 될 때까지 핫 플레이트에 솔루션을 열.
- 핫 플레이트에서 솔루션을 제거, 솔루션 쿨 플라스 크 맨 손으로 건드리지 수 수 웰 스를 만드는 젤 빗 24.5 c m x 21.8 c m 젤 형으로 젤을 부 어 때까지.
- 피 펫 팁 터지는 여 빗 근처 또는 젤의 표면에 거품을 제거 하 고 적어도 15 분 동안 공고히 하 젤 허용. 이 젤 또는 오염의 건조를 방지 하기 위해 1 주에 대 한 플라스틱 랩에 싸서 냉장고 (4 ° C)에 저장할 수 있습니다. 젤을 실행 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 리 외. 33 .
참고: 30 개별 웰 스와 젤 빗을 사용 합니다. 각 잘 2 m m의 깊이와 폭이 4.5 m m 이어야 한다. 우물의 높이 상자에 부 어 젤의 크기에 따라 달라 집니다.
- 40 mM Tris HCl, 20 m m 초 산, 1 mM EDTA 사용 하 여 1 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA) 버퍼를 준비 합니다. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.
2입니다. 스테인드 DNA의 준비
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람다 DNA (300-800 ng) 염료의 다른 aliquots를 사용 하 여 얼룩. 각 염료 (표 1) 6 개의 다른 농도 제한 효소 당 48 반응의 총에 대 한 테스트를 할 것 이다. 다음 프로세스 1 반응 (그림 1)에 대 한 최대 집합을 설명합니다.
- 1 x 테 100을 사용 하 여 람다 DNA를 희석 ng / µ L. 4 ° C에 저장 300 µ L의 총 볼륨으로 솔루션을 확인 합니다.
- Unmethylated 람다 DNA 얼룩. 다이제스트에서 예상 각 밴드에 대 한 75-100 ng/밴드 예상. 1.9 µ M, 3.8 µ M, 19.4 µ M, 32.2 µ M, 48.3 µ M, 63.5 μ M의 농도 생산 하는 염료의 적절 한 금액을 추가 / 100 ng의 DNA.
- 밤새 품 어 (15-18 시) 4 ° c.에
- 한 반응 제어25으로 흠 없는 둡니다.
참고: unmethylated DNA를 사용 하 여 소화 반응에 대 한. 메 틸 화 과민 한 효소 수 없습니다 DNA에 갠 지역 고 불완전 한 소화의 모습을 줄 것 이다.
3입니다. 제한 효소 분석 실험의 준비
-
다이제스트는 그 효소 prestained DNA (그림 1)을 소화 수 있습니다 경우 결정 하는 제한 효소로 DNA를 스테인드.
- 다음 날, 제한 효소, 적절 한 버퍼 (표 2)의 3 µ L의 U 20을 추가 하 고 증류수, 압력가 마로 소독 하 고 필터링 된 30 µ L의 총. 각 효소 반응에 대 한 제조업체의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다 가장 높은 절단 효율성으로 버퍼를 선택 합니다.
- 반응의 최적 효소 활동, 6 효소 Maschmann 외에 사용에 대 한 표 2에 나열 된 온도에서 물 욕조에 배치., 2-4 h (표 2)25.
- 0.5 M EDTA pH 8.0의 2 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
4. Electroeluting Agarose 젤에서 DNA 스테인드
- 24.5 c m x 21.8 c m 젤 형 (1.2.2 단계)에서 면을 제거 하 고 젤 젤 전기 이동 법 상자에 놓습니다. 상자에 1 x TAE 버퍼의 2.5 L를 붓으십시오. 조심 스럽게 우물 액세스할 수33그래서, 젤에서 젤 빗을 제거.
- 플라스틱 플라스틱 필름에 제한 효소 반응 하 고 염료를 로드 x 6 각 반응 결합. 각 반응 솔루션에 대 한 DNA 솔루션 (1x)의 5-6 µ L 당 염료 로드 x 6의 1 µ L를 추가 합니다. 다음 반응 플라스틱 (로드 염료 포함 된 < 18 µ L) 우물에.
- 1 kb 사다리의 1 µ L, 1 x 테의 9 µ L 및 염료 로드 x 6의 2 µ L를 혼합. 다른 솔루션 측면 우물에 솔루션을 로드 합니다.
- 어두운 청색 또는 검은색 종이 또는 직물 젤 상자를 커버. 전원 공급 장치, 30 V, 전원 공급 장치를 설정 하 고 그것을 밤새 껏 달린다 (15-20 h)에 젤 상자를 연결 합니다. 젤 레이블이 DNA의 photocleavage를 방지 하기 위해 실행 되는 동안 불을 끕니다.
- 다음 날 아침에 전원 공급 장치 해제. 트레이 사용 하 여 밖으로 젤 하 고 45 µ L ethidium 평범한 사람 및 1 x TAE 버퍼의 1 L 용기에 그것을 전송. 빛에 노출 되지 않도록 호 일에 어둠 속에서 실내 온도 또는 표지에 컨테이너를 저장 합니다. 실내 온도에 적어도 45 분 동안 하자 젤 얼룩.
주의: 장갑 ethidium 평범한 사람을 사용 하 고 안전 안경을 착용. Ethidium 평범한 사람 해결책을 포함 하 고 젤을 버리고 컨테이너를 청소 때 참조 사용된 ethidium 평범한 사람; 처리 하는 방법을 결정 하는 상태 처리 지침 서 또한, 다른 얼룩 ethidium 평범한 사람 대신 이용 될 수 있습니다.
5. 이미징 Agarose 젤
- 400-500 nm 사이 최대 광 출력을 방출 하는 블루 빛 transilluminator의 위에 젤을 놓습니다. 역에 연결 된 카메라와 함께 사진을 찍을.
주의:는 조명에 대 한 커버를 사용 하 여 광원을 켜기 전에 보호 안경에 넣어 있는지 확인 합니다.
참고:이 단계 수 있습니다 또한 완료 모든 UV 광원 또는 표준 젤 스캐너를 사용 하 여. - ImageJ ImageJ 상태 표시줄에 파일을 드래그 하 여 그림 목록 그리고 이미지 팝업 됩니다.
- 예상 에서 실리콘에서 젤 패턴에 젤에 밴드를 비교 하 여 실험에 대 한 소화 속도 결정 합니다. 소화 속도 결정 하기 위해 실험적인 밴드의 수 DNA 밴드24,25의 예상된 수로 나눕니다. 실험적인 소화 DNA 밴드 패턴 예상된 패턴을가지고, 소화 율은 1입니다. 패턴에 경우 예상 보다 더 많은 파편, 소화 속도가 1 보다 큰입니다. 패턴에 경우 예상 보다 적은 조각, 소화 속도가 1 미만입니다.
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Representative Results
경우 intercalating 염료는 DNA를 소화 하는 제한 효소에 영향을 미칠 것 이다, 단계의 올바른 순서로 되어야 합니다 확인 (그림 1)를 따 랐 다. 일단 DNA 스테인드 이며 특정된 효소로 소화, 조각 및 그들의 크기 (그림 2)의 수를 결정 하 젤의 그림을 취할 수 있습니다. 위하여 효소 효율을 보이는 밴드의 수로 나눈 예상된 보이는 밴드의 총 수를 결정 합니다. 효소 효율 같게 화합, 밴드의 수를 예상 하는 경우 및 본된 일치. 다음 예상 젤에 더 많은 밴드 들이 있다면, 값 1 보다 큰 이며 부분적으로 소화 반응을 나타냅니다. 적은 밴드 예상 다음 경우 다음 값 1 미만, 불완전 소화를 나타내는입니다. 그림 2a, 밴드의 이동성은 감소 하 고, 3, 4 차선 표시에에서 우물 쪽으로 이동 하는 악대를 일으키는. 레인 1과 2에서 염료의 양을 미치지 않습니다 이동성 눈에 띄게, 그래서 밴드 일치 합니다. 그림 2a, 5 및 6 차선 부분 소화 나타냅니다 그래서 컨트롤 보다 더 많은 밴드를 보여줍니다. 즉, 염료 그 효소에 대 한 인식 사이트에서 DNA의 분열에 영향을. 그림 2b, 모든 예상 염료 DNA의 소화를 방해 하지 않았다 그래서 밴드 모든 염료 농도 대 한 볼 수 있습니다. 그림 2 c 트랙 이동성 색된 별표와 함께 이동합니다.
염료 농도 증가-1, 이동성 염료에 대 한 감소 합니다. 밴드의 대략적인 크기를 결정 하려면 컨트롤 필요 기본 DNA 분자 예상 됩니다 알고에 묻은 DNA (그림 2a)에 비해 합니다. 염료-3에 대 한 이동성 않았다 감소 하지 수-1 염료 않았다, 그래서 쉽게 조각 크기 (그림 2b)를 확인할 수 있었다. Maschmann 그 외 여러분 에서 보듯이 이동성 차이 활용, 염료의 유형 때문은 25. 이러한 염료의 분산 염료의 구조 때문에 볼 수 있다. 향기로운 moiety 염료-3 사이 링커-1 보다 더 길었다. 염료는 왜 이동성 변화 작으면-3 염료에 대 한 설명할 수 링커 크기 차이로 인해 약간 다르게 intercalate 수 있습니다.
없습니다 DNA 또는 DNA 밴드는 젤에 매우 희미 한 경우 DNA의 농도 증가 하는 것이 필요 합니다. 그러나, DNA 농도 증가, 다음 필요한 염료의 금액 또한 높아집니다 DNA 비율에 염료의 정확한 농도 유지 하.
그림 1 : 단계는 회로도 필요한 때 DNA 분자를 분류 형광 색소를 소화합니다. DNA와 요요-1, 또는 다른 염료 토토 시리즈에서 검은 튜브에 추가 되 고 incubated 하룻밤 (O/N; 15-20 h). 제한 효소는 튜브;에 추가 됩니다. 인큐베이터, 원하는 온도에서 2-4 h (표 2)에 배치 됩니다. 1 x TAE 버퍼와 몰입된 0.7 %agarose 젤으로 샘플을 로드 합니다. 어두운 색된 종이 커버 젤 상자 및 불 꺼진, 젤은 염료의 photocleavage를 방지 하기 위해 밤새 달렸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Cyanine 이합체 염료와 삽입 된 DNA의 제한 소화. (가) 람다 DNA는 스테인드 요요-1의 다른 농도와 하룻밤 (레인 c: 소화 아무 염료 (제어), 레인 1: 1.9, 레인 2: 3.8 ng, 차선 3: 19.4 ng, 레인 4: 32.2 ng, 레인 5: 48.3 ng, 100 당 염료의 레인 6: 63.5 ng와 람다 DNA DNA의 ng)와 다음 dige 호텔 2-4 h 37 ° C에서 위치 EcoRI로 모든 반응 electrophoresed (E = 0.85 V/cm) 0.7% 높은 고 온도에 (HGT) agarose 젤 만든 1 x TAE 버퍼 (1 x TAE; 40 mM Tris HCl, 20 mM 아세트산, 1 mM EDTA). 젤은 ethidium 평범한 사람으로 물 고 파란 빛 transilluminator 카메라에 결합으로 몇 군데. 레인 L는 1 kb 사다리 (크기, kb); 레인 λ는 전체 길이 람다 DNA; 레인 E (크기, kb) 예상된 밴드 패턴입니다. (b) 람다 DNA 요요 3으로 물 (레인 1: 1.9, 레인 2: 3.8 ng, 차선 3: 19.4 ng, 레인 4: 32.2 ng, 레인 5: 48.3 ng, 레인 6: 63.5 ng 100 당 염료의 DNA의 ng) 37 ° c.에 HindIII와 소화 (c) 이동성 요요-1 농도 이동 하는 방법 볼 수 증가, 색된 별표는 각 요요-1 농도 대 한 각 밴드에 인접 한. 예를 들어 3.5 kb에서 밴드 각 요요-1 농도에 각 밴드 옆 빨간색 별표가 있다. 레인 5와 6에서 예기치 않은 밴드 밴드 옆에 있는 별표를 필요가 없습니다. 그림은 Maschmann 그 외 여러분 에서 수정 25. 저작권 (2017) Nucleosides, 뉴클레오티드, 및 핵 산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 화학 이름 | 약식된 이름 | Ex / Em (nm) |
| [(1-1-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl] 두번째 [4-[(3-메 틸-2(3H)-benzothiazolylidene) 메 틸]]-, tetraiodide | 토토-1 | 514/533 |
| 1, 1-(4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) 두번째 [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} | 요요-1 | 491/509 |
| 2, 2 '-[1, 3-소품-anediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl-1 (4 H)-pyridinyl-4-ylidenemethylid-yne]] 두번째 [3-메 틸]-, tetraiodide | 포포-1 | 434/456 |
| 2, 2 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3, 1-propanediyl-1(4H)-pyridinyl-4-1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} | 보 보-1 | 462/481 |
| 2, 2-{[4,8 bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] 두번째 [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide | 토토-3 | 642/660 |
| 1, 1 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl]] 두번째 [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide | 요요-3 | 612/631 |
| 2, 2 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl-1 (4 H)-pyridinyl-4-ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide | 포포-3 | 534/570 |
| 2,2'-{propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraiodide | 보 보-3 | 570/602 |
표 1: 약식 방출 (Em)와 여기 (예) maximima22IUPAC 이름으로 염료의 토토 가족의 이름.
| 효소 | 메 틸 화에 민감한 | 버퍼 | 물 목욕 온도 |
| BamHI | 아니요 | 2 | 37 ° C |
| EcoRI | 예 | 2 | 37 ° C |
| HindIII | 아니요 | 2 | 37 ° C |
| PmlI | 예 | 1 | 37 ° C |
| ScaI | 아니요 | 2 | 37 ° C |
| SmaI | 예 | 3 | 25 ° C |
표 2: 이 실험에 사용 될 수 있는 가능한 효소의 하위 집합은 테이블에 나열 된. 3 효소는 메 틸 화 과민 한 고 3 중요 한 메 틸 화 되지 않습니다. 효소 및 외피 온도 사용 되는 버퍼는 각 효소에 대 한 나열 됩니다.
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Discussion
붙일 레이블된 DNA (그림 1)을소화 하기 위해 일련의 단계를 제시해 주셔야 합니다. 첫째, DNA 하룻밤는 형광 색소로 얼룩진입니다. DNA 수 있습니다 알을 품 cyanine 이합체와 시간;의 짧은 기간에 대 한 그러나, Carlsson 외. 발견 DNA 이중 밴드 때문에 불완전 한 얼룩20각 DNA 크기에 대 한 만든. 이 문제를 해결 하려면 DNA 수 있습니다 얼룩이 질 더블 밴드 발생 하지 않도록 하려면 하룻밤. 이 프로토콜에 중요 한 단계입니다. 염색 하지 오래 충분 한 시간 동안 incubated, 염료-DNA 평형 되지 않을 수도 있습니다 하 고 더블 밴딩 패턴을 줄 것 이다. 이 발생 하는 경우 시간이 더 긴 기간에 대 한 equilibrate를 DNA 염료 혼합을 수 있습니다.
다음, 제한 효소 DNA 염료 혼합에 추가 하 고 각 효소에 대 한 특정 온도에서 2-4 h에 대 한 소화는. DNA 메 틸 화 과민 한 효소 methylated 해야 합니다. 그렇지 않으면 갠 DNA 갠 지역에서 절단 DNA에서 제한 효소를 억제 합니다. 또한, 반응 온도 효소에 대 한 올바른 버퍼에 incubated 해야 합니다. 각 효소는 각 버퍼에서 버퍼 및 효소 활동의 목록이 있다. 가능 하다 면 100%, 효소 활동 버퍼를 선택 하십시오. 온도에 관해서는 정확한 온도에서 incubated 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면 그것은 효소 활동을 잃거나 변성 온도가 너무 높은 경우에 발생할 수 있습니다. EDTA는 반응을 중지를 이용 된다. 효소 구입 했다 회사 그 효소에 대 한 최적의 온도 조건과 버퍼를 사용 하 여 차트를 있을 것 이다. 컨트롤 오른쪽 분자 무게, 효소 만료 확인 밴드의 올바른 번호를 제공 하지 않습니다 부 화 시간을 늘리거나 확인 있는지 확인 하는 온도 그 효소에 적합 합니다.
반응이 완료 되 면 샘플을 젤으로 로드할 수 있습니다. 먼저, 젤 젤 컨테이너에 로드 이며 1 x TAE 버퍼에 몰입. 다음으로, 소화 DNA 염료를 로드와 함께 혼합 하 고 솔루션 젤의 우물에 로드 됩니다. 뚜껑에 미끄러져 하 고 전선을 젤 상자에 연결 된. 함께 녹화는, 어두운 종이 뚜껑 커버와 양쪽 드러 워 진 뚜껑 위에 배치 됩니다. 또 다른 중요 한 단계는 샘플 보호 빛에서 항상 젤 실행 되는 동안에 특히 이다. 전원 공급 장치 설정 해야 하 고 방에 불이 꺼져. DNA의 photocleavage를 방지 하기 위해 샘플은 내내 빛 으로부터 보호 됩니다. 더 어두운 종이 있는 경우에, 어두운 직물 뿐만 사용할 수 있습니다. DNA는 이동 하지 않으면, 철사는 상자에 연결 된 실행된 단추를 누르면 있는지 확인 합니다.
아침에 젤 젤 상자 걸릴 하 고 ethidium 평범한 사람을 포함 하는 컨테이너에 젤을 로드 합니다. Ethidium 평범한 사람 DNA 밴드 블루 라이트 transilluminator (그림 2)에서 볼 수 있습니다. 다른 염료 ethidium 평범한 사람 대신 사용할 수 있습니다. 젤의 그림을 잡으려고 푸른 빛 transilluminator 위에 카메라를 장착할 수 있습니다. 설정에 따라 이미지 역 또한 활용할 수 있습니다.
이 메서드는 intercalates 또는 DNA, 토토 시리즈 뿐 아니라 얼룩 염료에 대 한 이용하실 수 있습니다. Maschmann 외. 멩 외에 의해 개발 된 기술을 수정. 붙일 스테인드 DNA를 제한 효소24,25소화 될 수 있는. 이것은 미리 스테인드 DNA 제한 효소에 영향을 확인 하기 위해 활용 하는 유일한 기술 이다. 과학자는 상업적으로 나열 되지 않은 다른 제한 효소에 대 한 액세스 하지 않는 한이 방법은 상업적으로 사용할 수 있는 제한 효소로 제한 됩니다. DNA에 따라 선택 하는 효소 있어야 뚜렷한 DNA 밴드 패턴 및 충분 한 밴드 (> 3) DNA 분자 전체 길이 인지 확인 하려면. 또한, 메 틸 화 과민 한 효소를 사용 하는 경우에 DNA methylated 아닙니다 이어야 한다입니다. 만약 DNA 갠 다음 사용 하지 마십시오 메 틸 화 과민 한 효소.
이 메서드는 제한 효소가 DNA 분자 특정된 컷된 사이트34뇌관 디자인 하지 않고도 intercalating 염료와 스테인드 인식 사이트에서 줄일 수 경우 결정 하는 사용 하기 쉬운 방법이. 이 방법의 미래의 애플 리 케이 션 것 붙일 실험에서 분자를 표시 하는 경우 확인 하려면 전체 길이 제한 효소를 사용 하 여 다이제스트에서 또는 DNA의 메 틸 프로필을 확인 하기 위해 DNA 밴드의 크기를 확인 하 여 분자입니다. 미래 실험 또한 nicking 효소 cyanine 염료 또는 다른 형광 성 염료에 의해 영향을 받는 경우 결정할 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 연구소에 의해 투자에 대 한 일반 의료 과학 (NIGMS) (5605100122001), 국립 보건원 (NIH), 뿐만 아니라 키 니 (UNK) 여름 학생 연구 프로그램 (SSRP) 그리고 UNK 네브라스카 대학교의 구성 요소 학부 연구 친교 (URF)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
