Summary
Farging DNA molekyler for fluorescens mikroskopi kan en forsker for å vise dem i et eksperiment. Metoden som presenteres her, er DNA molekyler pre beiset med fluorescerende fargestoffer og fordøyd med metylering og ikke-metylering følsom begrensning enzymer.
Abstract
Visualisering av DNA for fluorescens mikroskopi benytter en rekke fargestoffer som cyanine fargestoffer. Disse fargestoffer benyttes på grunn av deres høy affinitet og følsomhet for DNA. For å avgjøre om DNA-molekyler er full lengde etter ferdigstillelse av eksperimentet, kreves en metode å avgjøre om farget molekylene er full lengde av fordøye DNA med begrensning enzymer. Imidlertid kan farget DNA hemme enzymer, slik metode er nødvendig for å avgjøre hva enzymer som man kan bruke for fluorochrome farget DNA. I denne metoden er DNA farget med en cyanine farge over natten å la fargestoffet og DNA å equilibrate. Neste, farget DNA fordøyd med en begrensning enzym, lastes inn i en gel og electrophoresed. Eksperimentell DNA digest band er sammenlignet med en i sili digest å bestemme begrensning enzymaktiviteten. Hvis det er like mange band som forventet, så er reaksjonen fullført. Flere band enn forventet angir delvis fordøyelsen og mindre band angir ufullstendig fordøyelsen. Fordelen med denne metoden er dens enkelhet og den bruker utstyr som en vitenskapsmann ville nød for en begrensning enzym analysen og gel geleelektroforese. En begrensning av denne metoden er at enzymer tilgjengelig for de fleste forskere er kommersielt tilgjengelige enzym; Imidlertid kan noen begrensninger enzymer brukes.
Introduction
Den TOTO-serien (TOTO-1 YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 og BOBO-3; Tabell 1) benyttes i en rekke eksperimenter hvor effekten av DNA er nødvendige1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. cyanine dimer familien er utbredt på grunn av deres quantum avkastning, følsomhet og høy affinitet for DNA molekyler18,19,20. Cyanine dimer fargestoffer har stor selektivitet for double-strandet DNA og når under sommer har en 100-1000 ganger økning fluorescens21. Pyridinium fargestoffer (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 og TOTO-3) har kortere utslipp bølgelengde enn deres quinolium farge (BOBO-1 POPO-1, BOBO-3 og POPO-3) kolleger (tabell 1)22. Quantum avkastningen for cyanine dimers under Sommer inn DNA er også høy (0.2 - 0,6)22. Men krever ved hjelp av et enzym bestemme metylering profilen av DNA molekylet2 eller strekke23 av en DNA-molekyl allerede beiset med fluorescerende farge en metode for å avgjøre hva enzymer vil fordøye farget DNA. Alle typer fargestoff som setter tiden inn DNA eller et enzym som gir en merkes mønster av DNA underlaget kan brukes for denne metoden.
Meng et al. først bestemt fordøyelsen frekvensen av prestained DNA gjennom gel geleelektroforese bruker en rekke forskjellige farger bare24. Maschmann et al. delved dypere for å se på TOTO familie fargestoffer. Både bestemt fordøyelsen frekvensen av farget DNA å se hvis DNA med en gitt farge kan bli fordøyd med en begrensning enzym25. Andre metoder studere bindende effektene blekemidler under sommer med DNA bruker optisk pinsett26 eller NMR27. Disse metodene krever spesialisert utstyr; mens, denne metoden tillater utstyr som de fleste molekylær biologi labs har å avgjøre om en fargestoff forstyrrer en begrensning enzym fordøyelsen.
I tillegg har andre metoder for å måle lengden på et bestemt molekyl, optisk kartlegging langstrakt unstained kvinne DNA molekyler på en overflate og fordøyd DNA for å bestemme strekk og størrelse av fragmenter. Innskudd fargestoff har vist seg å øke omkrets fluorescently farget DNA molekyler og avhengig av fargestoff brukes, kontur lengder forskjellige21. Denne metoden har blitt benyttet i en rekke genomer1,3,4,6,13,28,29,30, 31. men hvis molekyler pre farget, avhengig av fargestoff og enzym, enzymet kanskje ikke å kutte DNA med en gitt farge. Derfor bestemmer denne metoden hvis DNA med en gitt farge kan bli fordøyd med et enzym. I tillegg avhengig av konsentrasjonen av fargestoff og fargestoff brukes, mobiliteten av DNA vil band i en gel migrere saktere enn opprinnelig DNA skyldes delvis slappe av DNA ryggraden å gjøre plass til fargebad sette inn mellom base parene32 .
Men noen ganger disse fargestoffer kan delvis eller hemme helt virkningen av visse restriksjoner enzymer7,24. Dette er antatt å skyldes en strukturell endring i DNA forårsaket av at fluorescerende fargestoff, som kan forhindre enzymet gjenkjenner bestemte sekvensen. Forstå hvordan disse fargestoffer påvirker begrensning enzymer kan hjelpe eksperimenter der metylering profilen eller strekningen av farget DNA kreves.
I vår metode, var DNA farget med en fluorochrome rundt og fordøyd med en begrensning enzym. Deretter DNA var electrophoresed på en gel, fotografert, og begrensning enzym fordøyelsen hastigheten ble målt. Begrensning enzymer ble valgt basert på klippe mønster på en gel. For mange band forårsaket overlapping av DNA band og for få band gir ikke et fullstendig bilde av DNA molekylet. Det er et sweet spot å kunne avgjøre profilen til fordøyd DNA molekylet; Derfor vil det avhenge DNA brukes og enzymet. En fordel med denne metoden er dens enkelhet; det krever bare en begrensning fordøyelsen og gel geleelektroforese utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse fargestoffer, buffere og Agarose Gel
-
Klargjør følgende løsninger for farging DNA eller fordøyelsen av farget DNA.
- Forberede 1 x TE (Tris-HCl og ethylenediaminetetraacetic syre; EDTA) buffer med 10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA i en uteksaminert sylinder eller volumetriske kolbe. Lagre ved romtemperatur (18-25 ° C).
- Gjøre dele hver farge: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabell 1). Pipetter 4 µL av 1 mM fargestoff inn mørk eller svart 1,5 mL tube og legge til 36 µL av 1 x TE, blander med Pipetter; denne konsentrasjonen gjør en 100 µM fargestoff løsning (40 µL totalt). Fullfør denne fremgangsmåten for hver farge. Butikken på 4 ° C.
Merk: Unngå å utsette fargestoff til lys for å forhindre photobleaching eller degradering av fargestoffet. - Forberede buffer 1 med 10 mM Bis-Tris-propan-HCl, 10 mM MgCl2og 100 µg/mL bovin serum albumin (BSA). Forberede buffer 2 bruke 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2og 100 µg/mL BSA. Forberede buffer 3 bruker 50 mM kalium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetat og 100 µg/mL BSA. Hver enzym krever en av disse spesifikke buffere skal fungere.
-
Klargjør følgende løsninger for gel geleelektroforese.
- Gjør en 6 x lasting farge ved å kombinere 0,25% bromophenol blå, 0,25% xylen cyanol, 15% Ficoll i dH2O. butikken ved romtemperatur.
- For å gjøre en 0,7% agarose gel, veier ut 0,07 g høy gelling temperatur (HGT) agarose i en Erlenmeyer kolbe, legge til 100 mL 1 x TAE buffer og Plasser en invertert beaker på flasken.
- Varme løsningen på en varm plate til boblene begynner å danne på bunnen av flasken og flyte til toppen.
- Fjerne løsningen fra kokeplate, Avkjøl løsning til kolbe kan bli rørt med en nakne hånd, og så helle gel i 24,5 cm x 21.8 cm gel mold med en gel kam å opprette brønner.
- Fjern bobler nær kammen eller på overflaten av gel ved dem med en pipette tips og tillate gel å stivne i minst 15 minutter. Dette kan være lagret i et kjøleskap (4 ° C) innpakket i plastfolie for 1 uke å hindre tørking av gel eller forurensning. Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du kjører en gel se Lee et al. 33 .
Merk: Bruk en gel kam med 30 individuelle brønner. Hver skal godt 4,5 mm bred med en dybde på 2 mm. Høyden av brønnen vil avhenge av mengden gel helles i boksen.
- Forberede 1 x TAE (Tris - acetate - EDTA) buffer 40 mM Tris-HCl, 20 mM eddiksyre og 1 mM EDTA. Lagre ved romtemperatur (18-25 ° C).
2. forberedelse av farget DNA
-
Stain lambda DNA (300-800 ng) bruker forskjellige dele fargestoffer. Hver farge (tabell 1) har seks ulike konsentrasjoner testet, for totalt 48 reaksjoner per begrensning enzym. Følgende prosess beskriver en satt opp for 1 reaksjon (figur 1).
- Fortynne lambda DNA ved å bruke 1 x TE til 100 ng / µL. Lagre i 4 ° C. Lage en løsning med et totalt volum på 300 µL.
- Flekk unmethylated lambda DNA. Anslå 75-100 ng/band for hvert band fra sammendraget. Legge til passende mengder av fargestoff til produsere konsentrasjoner av 1,9 µM 3,8 µM 19.4 µM, 32.2 µM, 48.3 µM, 63,5 µM / 100 ng DNA.
- Ruge over natten (15t - 18 h) på 4 ° C.
- La en reaksjon unstained kvinne som en kontroll25.
Merk: Bruk unmethylated DNA for fordøyelsen reaksjonen. Metylering følsom enzymer kan ikke klippe ut denaturert i DNA og vil gi en opptreden av en ufullstendig fordøyelsen.
3. forberedelse til begrensning enzym analysen
-
Digest farget DNA med en begrensning enzym å avgjøre hvis enzym kan fordøye prestained DNA (figur 1).
- Dagen etter, legge til 20 U begrensning enzym, 3 µL av riktige bufferen (tabell 2) og destillert, autoklaveres og filtrert vann totalt 30 µL. For hver enzym reaksjon, velger du buffer med høyeste klippe effektivitet, som du finner på produsentens webområde.
- Plasser reaksjonene i et vannbad på temperaturen på optimalt enzymatisk aktivitet, vises i tabell 2 for 6 enzymer i Maschmann et al., for 2-4 h (tabell 2)25.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 2 µL av 0,5 M EDTA pH 8.0.
4. Electroeluting farget DNA i en Agarose Gel
- Fjerne sidene fra 24,5 cm x 21.8 cm gel mold (trinn 1.2.2) og plasser gel i boksen gel geleelektroforese. Hell 2.5 L 1 x TAE bufferen i boksen. Fjern forsiktig gel kammen fra gel, så brønnene er tilgjengelig33.
- Pipetter begrensning enzym reaksjonene på en plastfolie og kombinere hver reaksjon med 6 x lasting fargestoff. For hver reaksjon-løsning, kan du legge 1 µL av 6 x lasting fargestoff per 5-6 µL av DNA løsning (1 x). Deretter Pipetter reaksjonene (som inneholder lasting fargestoff, < 18 µL) i brønnene.
- Bland 1 µL av 1 kb stigen, 9 µL av 1 x TE og 2 µL av 6 x lasting fargestoff. Legg løsning i brønnene som flanken til andre løsninger.
- Dekk boksen gel med mørk blå eller svart eller stoff. Koble boksen gel til en strømforsyning, angi strømforsyningen til 30 V, og kjøre den over natten (15-20 h). Slå av lysene mens gel kjører, for å hindre photocleavage av merket DNA.
- Neste morgen slå av strømforsyningen. Ta gel ut ved hjelp av skuffen og overføre den til en beholder med 45 µL ethidium bromide og 1 L 1 x TAE buffer. Beholderne oppbevares i romtemperatur i mørket eller dekke i folie å hindre eksponering for lys. La gel flekk i minst 45 min ved romtemperatur.
FORSIKTIG: Bruk ethidium bromide med hansker og bruke vernebriller. Når rengjøring ut beholderen som inneholder ethidium bromide løsning og kaste gel, konsultere din stater disposisjon retningslinjer for å finne ut hvordan å håndtere brukt ethidium bromide; i tillegg harddiskkapasiteten andre flekker brukes i stedet for ethidium bromide.
5. imaging Agarose Gel
- Plass gel på et blått lys transilluminator, som avgir maksimale lysstyrken mellom 400-500 nm. Ta bilder med kameraet festet til stasjonen.
FORSIKTIG: Kontroller dekselet for illuminator og sette på beskyttende briller før slå på lyskilden.
Merk: Dette trinnet kan også fullføres ved å bruke en UV lys kilde eller standard gel skanner. - Vis bildene i ImageJ ved å dra filen til ImageJ statuslinjen og bildet ville popmusikk opp.
- Finn fordøyelsen satsen for eksperimentet ved å sammenligne band på gel forventet i sili gel mønsteret. For å bestemme hastigheten fordøyelsen, deles antall eksperimentelle band forventet antall DNA band24,25. Hvis den forventede mønsteret har eksperimentell fordøyd DNA bandet mønsteret er fordøyelsen hastigheten 1. Hvis mønsteret har flere fragmenter enn forventet, er fordøyelsen hastigheten større enn 1. Hvis mønsteret har mindre fragmenter enn forventet, er fordøyelsen hastigheten mindre enn 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å avgjøre hvis en intercalating farge vil påvirke en begrensning enzym fordøye DNA, riktig rekkefølge på trinnene være fulgt (figur 1). Når DNA er farget og fordøyd med en gitt enzym, kan et bilde av gel tas til å bestemme antall fragmenter og størrelsen (figur 2). For å fastslå enzym effektiviteten, totalt antall forventede synlige bånd delt på antall synlige felt. Enzym effektivitet likeverdig enhet, hvis antall band forventet og sett match. Hvis det er flere band på gel enn forventet, verdien er større enn 1 og angir delvis fordøyd reaksjoner. Hvis det er mindre band enn forventet, deretter er verdien mindre enn 1, som angir ufullstendig fordøyelsen. I figur 2a, baner 3 og 4 viser mobilitet band har minsket, forårsaker band å brønnene. I baner 1 og 2 påvirker hvor mye farge ikke mobilitet merkbart, slik at feltene samsvarer med kontrollen. I figur 2avise baner 5 og 6 flere band enn kontrollen, så angir delvis fordøyelsen. Hvilket betyr, fargestoffer berørt i spalting av DNA på webområdet anerkjennelse for enzym. I figur 2bventet band er sett for alle fargestoff konsentrasjoner, slik fargestoff ikke forstyrre fordøyelsen av DNA. Figur 2 c spor mobilitet skifter med farget stjerner.
Som fargestoff øker konsentrasjonen for fargestoffer med -1, mobiliteten reduseres. For å bestemme omtrentlig størrelsen på bånd, er en kontroll nødvendig å vite hvor den opprinnelige DNA molekyler er forventet sammenlignet med farget DNA (figur 2a). For fargestoffer med -3, mobiliteten ikke redusere i den grad at-1 fargestoffer gjorde, så det var lettere å finne fragment størrelsen (figur 2b). Mobilitet forskjellen er på grunn av fargestoff brukes, som sett i Maschmann et al. 25. Variansen for disse fargestoffer er sett på grunn av strukturene i fargestoffer. Linker mellom de aromatiske moiety for fargestoffer -3 var lengre enn -1. Fargestoffer kan intercalate litt annerledes på grunn av forskjellen i koblingsfunksjonalitet størrelsen, noe som kan forklare hvorfor mobilitet skiftet er mindre for-3 fargestoffer.
Hvis det er ingen DNA eller DNA er svært svak i gel, kreves øker konsentrasjonen av DNA. Men hvis DNA konsentrasjonen øker, vil deretter mengden fargestoff nødvendig også øke for å holde riktig konsentrasjonen av fargestoff DNA forhold.
Figur 1 : En skjematisk av trinnene nødvendig når fordøye fluorochrome merket DNA molekyler. DNA og YOYO-1 eller en annen farge fra TOTO serien, legges til en sort tube og ruges overnatting (O/N, 15-20 h). En begrensning enzym legges til et rør; Det er plassert i en inkubator, ved ønsket temperatur, for 2-4 h (tabell 2). Legg prøver i en nedsenket 0,7% agarose gel laget med 1 x TAE buffer. Mørk farget papir deksler av gel og lysene er slått av, mens gel er løp over natten for å hindre photocleavage av fargestoffet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Begrensning fordøyelsen av DNA under sommer med en cyanine dimer fargestoff. (en) Lambda DNA er farget med ulike konsentrasjoner av YOYO-1 over natten (lane C: fordøyd lambda DNA med ingen fargestoff (kontroll), lane 1: 1,9 ng, lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19.4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: andel på 48,3 ng, lane 6: 63,5 ng fargestoff per 100 ng DNA) og deretter dige sted med EcoRI på 37 ° C 2-4 h. Alle reaksjoner er electrophoresed (E = 0,85 V/cm) på 0,7% høy gelling temperatur (HGT) agarose gel laget med 1 x TAE buffer (1 x TAE, 40 mM Tris-HCl, 20 mM eddiksyre, 1 mM EDTA). Gels er farget med ethidium bromide og fotografert med en blå lys transilluminator koblet til et kamera. Lane L er en 1 kb stige (størrelser, kb); Lane λ er full lengde lambda DNA; Lane E er forventet bandet mønsteret (størrelser, kb). (b) Lambda DNA er farget med YOYO-3 (lane 1: 1,9 ng, lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19.4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: andel på 48,3 ng, lane 6: 63,5 ng fargestoff per 100 ng DNA) og fordøyd med HindIII på 37 ° C. (c) å se hvordan mobilitet flyttet som YOYO-1 konsentrasjonen er økt, farget stjerner ligger ved siden av hvert band for hver YOYO-1 konsentrasjon. Bandet på 3.5 kb har for eksempel en rød stjerne ved siden av hvert band i hver YOYO-1 konsentrasjon. Uventet bandene i lane 5 og 6 har ikke en stjerne ved siden av bandene. Figuren endres fra Maschmann et al. 25. opphavsrett (2017) Nucleosides, nukleotider og atomer syren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kjemisk navn | Forkortelse | Ex / Em (nm) |
| [(1-1-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] bis [4-[(3-metyl-2(3H)-benzothiazolylidene) metyl]]-, tetraiodide | TOTO-1 | 514/533 |
| 1, 1 - (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} | YOYO-1 | 491/509 |
| 2, 2 '-[1,3-prop-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-metyl]-, tetraiodide | POPO-1 | 434/456 |
| 2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} | BOBO-1 | 462/481 |
| 2, 2 '-{bis [4,8-bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide | TOTO-3 | 642/660 |
| 1, 1-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide | YOYO-3 | 612/631 |
| 2 2′-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide | POPO-3 | 534/570 |
| 2,2'-{propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)propane-3,1-diylpyridin-1-YL-4-ylideneprop-1-en-1-YL-3-ylidene]}BIS(3-Methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraiodide | BOBO-3 | 570/602 |
Tabell 1: Forkortet navn på TOTO rekke fargestoffer med IUPAC navn med utslipp (Em) og eksitasjon (Ex) maximima22.
| Enzym | Metylering Sensitive | Buffer | Bad temperaturen |
| BamHI | nei | 2 | 37 ° C |
| EcoRI | ja | 2 | 37 ° C |
| HindIII | nei | 2 | 37 ° C |
| PmlI | ja | 1 | 37 ° C |
| ScaI | nei | 2 | 37 ° C |
| SmaI | ja | 3 | 25 ° C |
Tabell 2: Oppført i tabell er et delsett av mulige enzymer som kan brukes i disse eksperimentene. Tre enzymer er metylering følsom og tre er ikke metylering følsom. Bufferne enzymer og inkubasjon temperaturer vises for hver enzym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å fordøye fluorescently merket DNA (figur 1), en rekke trinn kreves. Først er DNA farget med en fluorochrome over natten. DNA kan være inkubert med cyanine dimers for en kortere periode; men funnet Carlsson et al. at DNA skapt dobbel band for hver DNA størrelse på grunn av ufullstendige flekker20. For å bøte på dette kan DNA være farget over natten for å unngå dobbelt band. Dette er et viktig skritt i protokollen. Hvis fargen ikke er ruges i lang nok tid, fargestoff-DNA kan ikke være likevekt og vil gi en dobbel-striper mønster. Hvis dette oppstår, tillate DNA-dye blandingen til equilibrate for en lengre periode.
Deretter en begrensning enzym legges til DNA-dye blanding og fordøyd for 2-4 h på en bestemt temperatur for hver enzym. DNA må unmethylated for metylering følsom enzymer. Hvis ikke vil denaturert DNA hemme enzymet begrensning fra kutte DNA i denaturert regioner. I tillegg må reaksjonen være ruges i riktig buffer og temperatur for enzymet. Hver enzymet har en liste over buffere og enzymaktiviteten hver buffer. Velg bufferen med enzym aktivitet ved 100%, hvis mulig. Som for temperatur, kontroller at det er ruges i riktig temperatur. Hvis ikke kan det føre enzymet forsvinner aktivitet eller denature hvis temperaturen er for høy. EDTA er benyttet for å stoppe reaksjonen. Selskapet der enzymer ble kjøpt vil ha et diagram med optimal temperatur og buffer betingelser for enzym. Hvis kontrollen ikke gir riktig antall band på høyre molekylære vekter, se hvis enzymet er utløpt, øke inkubasjon eller sjekk at temperaturen er riktig for enzym.
Når reaksjonen er fullført, kan prøvene lastes inn i en gel. Først er en gel lastet inn i beholderen gel og midt i 1 x TAE buffer. Deretter fordøyd DNA er blandet med lasting fargestoff og løsningen er lastet inn i brønnene i gel. Lokket er gled over og ledninger er festet til boksen gel. En mørk papir, som er limt sammen, er plassert på toppen av lokket til å dekke lokket og drapere over sidene. Et annet viktig skritt er at prøvene er beskyttet mot lyset hele tiden, spesielt mens gel kjører. Strømforsyningen skal slås på og lyset i rommet slått av. For å hindre photocleavage av DNA, er prøver beskyttet mot lyset hele tiden. Hvis det er ikke mørk papir, kan en mørke stoffet brukes også. Hvis DNA ikke flyttes, kontroller ledningene er koplet til boksen og løpe knapp har trykket.
I morgen, ta gel esken gel og laste gel i en beholder som inneholder ethidium bromide. Ethidium bromide tillater oss å se DNA band under det blå lyset transilluminator (figur 2). Andre fargestoffer kan brukes i stedet for ethidium bromide. Et kamera kan monteres over den blå lys transilluminator å fange bilder av gel. Avhengig av oppsettet, kan en tenkelig stasjon benyttes.
Denne metoden kan brukes for alle fargestoff som setter tiden eller flekker DNA, ikke bare TOTO serien. Maschmann et al. endret en teknikk utviklet av Meng et al. for å fastslå om fluorescently farget DNA kan bli fordøyd med begrensning enzymer24,25. Dette er den eneste teknologien som benyttes for å avgjøre om pre farget DNA påvirker begrensning enzymer. Denne metoden er begrenset til begrensning enzymer kommersielt tilgjengelig, med mindre en forsker har tilgang til andre begrensning enzymer som ikke vises kommersielt. Avhengig av DNA, enzymet valgt bør ha en merkes DNA bandet mønster og nok band (> 3) å avgjøre om DNA molekylet er full lengde. Også bør DNA være unmethylated hvis metylering følsom enzymer brukes. Hvis DNA er denaturert, så ikke bruk metylering følsom enzymer.
Denne metoden er en brukervennlig vei å avgjøre hvis begrensning enzymer kan kutte DNA molekyler på webområdet anerkjennelse farget med en intercalating farge uten å utforme primere for et kutt område34. Den fremtidige anvendelser av denne metoden ville være å finne ut om fluorescently merket molekyler fra et eksperiment var full lengde ved å bruke en begrensning enzym og bestemmer størrelsen på DNA bandene fra sammendraget eller å bestemme DNA metylering profiler molekyler. Senere eksperimenter kan også fastslå om skår enzymer er påvirket av cyanine fargestoffer eller andre fluorescerende fargestoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Institute for generell medisinsk vitenskap (NIGMS) (5605100122001), en del av National Institutes of Health (NIH), i tillegg til University of Nebraska Kearney (UNK) Sommer Student Research Program (SSRP) og UNK Undervisning forskningsstipend (URF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
- Riehn, R., et al.
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
