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Biochemistry

Déterminer si l’ADN colorées avec un Cyanine colorant peuvent être digérées par les Enzymes de Restriction

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/57141
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

Summary

Coloration des molécules d’ADN pour la microscopie de fluorescence permet de les visualiser au cours d’une expérience scientifique. Dans la méthode présentée ici, les molécules d’ADN sont pré-teint avec les colorants fluorescents et digérés par méthylation et enzymes de restriction sensibles non-méthylation.

Abstract

Visualisation de l’ADN pour la microscopie de fluorescence utilise une variété de colorants tels que colorants cyanine. Ces colorants sont utilisés en raison de leur grande affinité et la sensibilité pour l’ADN. Afin de déterminer si les molécules d’ADN pleine longueur à l’issue de l’expérience, une méthode est nécessaire pour déterminer si les molécules colorées sont pleine longueur par digestion de l’ADN avec des enzymes de restriction. Cependant, teinté d’ADN peut inhiber les enzymes, si une méthode est nécessaire pour déterminer quelles enzymes on peut utiliser pour fluorochrome ADN coloré. Dans cette méthode, l’ADN est coloré avec un colorant cyanine pendant la nuit pour permettre au colorant et l’ADN de s’équilibrer. Prochaine, vitrail de l’ADN est digéré par une enzyme de restriction, chargé un gel et PST1. Les bandes de digérer l’ADN expérimentales sont comparés à un digest en silico pour déterminer l’activité de l’enzyme de restriction. S’il y a le même nombre de bandes comme prévu, la réaction est terminée. Plus de bandes que prévu indiquent une digestion partielle et moins bandes indiquent une digestion incomplète. L’avantage de cette méthode réside dans sa simplicité, et il utilise un équipement qui aurait besoin d’un scientifique pour une enzyme de restriction de dosage et électrophorèse sur gel. Une limitation de cette méthode est que les enzymes disponibles pour la plupart des scientifiques sont disponibles dans le commerce ; Cependant, les enzymes de restriction pourrait être utilisés.

Introduction

La série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, 3-YOYO, POPO-3 et BOBO-3 ; Le tableau 1) est utilisé dans une grande variété d’expériences où la visualisation de l’ADN est nécessaire1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la famille de dimère de cyanine est largement utilisée en raison de leur rendement quantique, sensibilité et haute affinité pour l’ADN molécules18,19,20. Cyanine dimère colorants ont grande sélectivité pour l’ADN bicaténaire et quand intercalés ont une augmentation de 100 à 1000 fois de fluorescence21. Pyridinium colorants (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO et TOTO-3) ont une longueur d’onde d’émission plus courte que leur quinolium teindre (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 et POPO-3) homologues (tableau 1)22. En outre, le rendement quantique de dimères de cyanine intercalés dans l’ADN est élevé (0,2 – 0,6)22. Cependant, utilisant une enzyme pour déterminer le profil de méthylation d’un ADN molécule2 ou étirer23 d’une molécule d’ADN déjà teintée avec colorant fluorescent requiert une méthode pour déterminer quelles enzymes digèrera ADN tachée. N’importe quel type de colorant qui s’intercale dans l’ADN ou de n’importe quel enzyme qui donne une tendance discernable du substrat de l’ADN peut être utilisé pour cette méthode.

Meng et al. détermina la vitesse de digestion de marqueur ADN par électrophorèse sur gel en utilisant une variété de différents colorants24. Menad al puisé au plus profond à regarder la famille TOTO de colorants. Les deux détermine le taux de digestion de l’ADN colorée pour voir si les colorer avec un colorant donné l’ADN pourrait être digéré avec une enzyme de restriction25. Autres méthodes étudient un effet contraignant des colorants intercalées avec de l’ADN à l’aide de pinces optiques26 ou27de la NMR. Les deux méthodes besoin d’équipement spécialisé ; considérant que, cette méthode permet aux appareils disposant de la plupart des laboratoires de biologie moléculaire pour déterminer si un colorant interfère avec une enzyme de restriction digestion.

En outre, dans d’autres méthodes pour mesurer la longueur d’une molécule donnée, cartographie optique a allongé les molécules d’ADN sans tache sur une surface et digéré l’ADN afin de déterminer l’étirement et la taille des fragments de. Intercalation de colorant a été montrée pour augmenter la longueur contour des molécules d’ADN fluorescent tachées et selon le colorant utilisé, les longueurs de contour sont différents21. Cette méthode a été utilisée dans une variété de génomes1,3,4,6,13,28,29,30, 31. Toutefois, si les molécules ont été préalablement teintés, selon le colorant et l’enzyme, l’enzyme peut être pas capable de couper l’ADN teinté avec un colorant donné. Par conséquent, cette méthode détermine si les colorer avec un colorant donné l’ADN peut être digérée avec une enzyme. En outre, selon la concentration de la teinture et le colorant utilisé, la mobilité de l’ADN les bandes dans un gel vont migrer plus lentement que l’ADN natif en raison de la remise en cause partielle de l’épine dorsale de l’ADN pour faire place à la teinture à insérer entre les paires de bases32 .

Cependant, parfois ces colorants peuvent partiellement ou complètement inhibent l’action de certaines enzymes de restriction,7,24. Ceci semble être dû à un changement structurel dans l’ADN provoqué par la fixation du colorant fluorescent, qui peut-être empêcher l’enzyme de reconnaître sa séquence spécifique. Peut aider à comprendre comment ces colorants affectent les enzymes de restriction dans les expériences où le profil de méthylation ou la portion d’ADN tachée est requise.

Dans notre méthode, l’ADN a été tachée avec un fluorochrome d’intérêt et digéré par une enzyme de restriction. Puis ADN était électrophorèse sur un gel, imagé, et a mesuré la vitesse de digestion d’enzymes de restriction. Les enzymes de restriction ont été choisis sur le modèle coupé sur un gel de la base. Trop de bandes causé le chevauchement des bandes d’ADN et trop peu de bandes ne donnaient pas une image complète de la molécule d’ADN. Il y a un sweet spot pour pouvoir déterminer le profil de la molécule d’ADN digéré ; par conséquent, il dépendra de l’ADN utilisé et l’enzyme. Un avantage de cette méthode réside dans sa simplicité ; Il suffit d’équipement utilisé dans une restriction digestion et gel d’électrophorèse.

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Protocol

1. préparation de colorants, de tampons et de Gel d’Agarose

  1. Préparer les solutions suivantes pour la coloration de l’ADN ou la digestion de l’ADN tachée.
    1. Préparer 1 x TE (Tris-HCl et EDTA acide ; Tampon à l’EDTA) aide 10 mM Tris-HCl et 1 mM d’EDTA dans un cylindre gradué ou une fiole jaugée. Conserver à température ambiante (18-25 ° C).
    2. Faire des parties aliquotes de chaque colorant : TOTO-1, YOYO-1, 1-POPO, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tableau 1). Distribuer 4 µL de colorant de 1 mM dans un ambre foncé ou noir 1,5 tube de mL et ajouter 36 µL de 1 x TE, mélanger à l’aide de la pipette ; Cette concentration permet une solution de colorant de 100 µM (total 40 µL). Terminer cette étape pour chaque colorant. Conserver à 4 ° C.
      Remarque : Évitez d’exposer la teinture à la lumière pour éviter le photoblanchiment ou dégradation du colorant.
    3. Préparer le tampon 1 à l’aide de Bis-Tris-Propane-HCl 10 mM, 10 mM MgCl2et 100 µg/mL d’albumine sérique bovine (BSA). Préparer le tampon 2 à l’aide de 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2et 100 µg/mL de BSA. Préparer le tampon 3 utilisant 50 mM l’acétate de Potassium, 20 mM Tris-acétate, acétate de magnésium de 10 mM et 100 µg/mL BSA. Chaque enzyme exigera un de ces tampons spécifiques pour fonctionner.
  2. Préparer les solutions suivantes pour l’électrophorèse sur gel.
    1. Fais un 6 x chargement teindre en combinant bromophénol 0.25 % bleu, 0,25 % de xylène cyanol, 15 % Ficoll dH2O. magasin à la température ambiante.
    2. Pour faire un gel d’agarose 0,7 % gel, peser 0,07 g d’agarose élevée de la température (HGT) gélifiants pouvant être employés dans un erlenmeyer, ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 et placer un bécher inversé sur le dessus de la fiole.
      1. Chauffer la solution sur une plaque chauffante jusqu'à ce que les bulles commencent à se former sur le fond de la fiole et le flotteur vers le haut.
      2. Enlever la solution de la plaque chauffante, laissez le refroidir de solution jusqu'à ce que le ballon peut être touché à main nue, puis verser le gel dans un moule de gel de 24,5 cm x 21,8 cm avec un peigne de gel pour créer des puits.
      3. Retirer les bulles près le peigne ou sur la surface du gel en leur faisant éclater avec un embout de la pipette et laisser le gel se solidifier pendant au moins 15 minutes. Cela peut être stocké dans un réfrigérateur (4 ° C) enveloppé dans une pellicule plastique pour 1 semaine pour éviter le dessèchement du gel ou contamination. Pour plus d’informations sur la façon d’exécuter un gel voir Lee et al. 33 .
        NOTE : Utiliser un peigne de gel avec 30 puits individuels. Chacun doit bien être 4,5 mm de large avec une profondeur de 2 mm. La hauteur du puits dépendra de la quantité de gel dans la boîte.
    3. Préparer 1 tampon de x TAE (Tris - acétate - EDTA) à l’aide de 40 mM Tris-HCl, l’acide acétique 20 mM et 1 mM EDTA. Conserver à température ambiante (18-25 ° C).

2. préparation de l’ADN coloré

  1. Tache d’ADN de lambda (300-800 ng) en utilisant différentes parties aliquotes de colorants. Chaque colorant (tableau 1) aura six différentes concentrations testées, pour un total de 48 réactions par enzyme de restriction. Le processus suivant décrit un ensemble vers le haut pour 1 réaction (Figure 1).
    1. Diluer l’ADN de lambda à l’aide de 1 x TE à 100 ng / µL. stocker à 4 ° C. Préparez une solution avec un volume total de 300 µL.
    2. Tache d’ADN non méthylé lambda. Pour chaque tranche, prévu par la digestion, estimer les 75 à 100 ng/band. Ajouter une quantité appropriée de colorant pour produire des concentrations de 1,9 µM, 3,8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng d’ADN.
    3. Incuber pendant la nuit (15 h - 18 h) à 4 ° C.
    4. Laisser une réaction non souillées enregistrée pour agir comme un contrôle25.
      Remarque : Utiliser l’ADN non méthylé pour la réaction de la digestion. Méthylation enzymes sensibles ne peuvent pas couper des régions méthylées de l’ADN et donneront une apparence d’une digestion incomplète.

3. préparation de l’essai de l’Enzyme de Restriction

  1. Digérer l’ADN coloré avec une enzyme de restriction afin de déterminer si cette enzyme peut digérer marqueur ADN (Figure 1).
    1. Le lendemain, ajouter 20 U de l’enzyme de restriction, 3 µL de tampon appropriée (tableau 2) et l’eau distillée, stérilisés à l’autoclave et filtrée pour un total de 30 µL. Pour chaque réaction enzymatique, choisissez le tampon avec la plus grande efficacité de coupe, qui se trouve sur le site du constructeur.
    2. Placer les réactions dans un bain d’eau à la température de l’activité enzymatique optimale, figurant au tableau 2 pour les 6 enzymes utilisées dans menad et al., pour 2-4 h (tableau 2)25.
    3. Arrêter la réaction en ajoutant 2 µL de 0,5 M EDTA pH 8.0.

4. Electroeluting l’ADN dans un Gel coloré

  1. Enlever les côtés du moule de gel de 24,5 cm x 21,8 cm (étape 1.2.2) et placer le gel dans la boîte de l’électrophorèse sur gel. Dans la boîte, verser 2,5 L de 1 x TAE tampon. Retirer soigneusement le peigne de gel du gel, alors que les puits sont accessibles33.
  2. Déposer les réactions de l’enzyme de restriction sur un film plastique et combiner chaque réaction 6 x chargement colorant. Pour chaque solution de réaction, ajouter 1 µL de 6 x colorant par 5-6 µL de solution d’ADN (1 x) de chargement. Déposer ensuite les réactions (contenant le colorant de chargement, < 18 µL) dans les puits.
  3. Mélanger 1 µL d’échelle 1 kb, 9 µL de TE 1 x et 2 µL de 6 x chargement colorant. Chargez la solution dans les puits qui flanquent les autres solutions.
  4. Couvrir la zone de gel foncé bleu ou noir papier ou de tissu. Raccorder le boîtier de gel sur une alimentation, définissez l’alimentation à 30 V et exécutez-le pendant la nuit (15-20 h). Éteindre les lumières pendant que le gel fonctionne, pour empêcher les photoclivage de l’ADN marqué.
  5. Le lendemain matin couper l’alimentation. Prendre le gel à l’aide de la barre d’État et le transférer dans un récipient avec 45 du bromure d’éthidium µL et 1 L de 1 x TAE tampon. Stocker le bac à température de la pièce dans l’obscurité ou le couvercle en aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Laisser le gel teinté pendant au moins 45 min à température ambiante.
    ATTENTION : Utiliser du bromure d’éthidium avec gants et lunettes de sécurité. Lorsque vous nettoyez le bac contenant la solution de bromure d’éthidium et jeter le gel, consulter vos directives de disposition États pour déterminer comment traiter avec du bromure d’éthidium usagés ; en outre, les autres taches peuvent être utilisées au lieu de bromure d’éthidium.

5. imagerie du Gel d’Agarose

  1. Placer le gel sur le dessus un Transilluminateur de lumière bleu, qui émet une puissance lumineuse maximale entre 400-500 nm. Prendre des photos avec l’appareil photo connecté à la station.
    ATTENTION : Veillez à utiliser la couverture de l’illuminateur et chaussez des lunettes de protection avant d’allumer la source de lumière.
    Remarque : Cette étape peut également être complétée à l’aide de toute source de lumière UV ou gel standard scanner.
  2. Voir toutes les photos dans ImageJ en faisant glisser le fichier dans la barre d’État ImageJ et l’image apparaîtra.
  3. Déterminer le taux de digestion pour l’expérience en comparant les bandes sur le gel vers le modèle de gel prévu en silico . Pour déterminer le taux de digestion, le nombre de bandes expérimentales est divisé par le nombre moyen d’ADN bandes24,25. Si le patron de bandes ADN digéré expérimental a le modèle prévu, le taux de digestion est 1. Si le modèle a des fragments de plus que prévu, le taux de digestion est supérieur à 1. Si le modèle a des fragments de moins que prévu, le taux de digestion est inférieur à un.

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Representative Results

Afin de déterminer que si un colorant intercalant affectera une enzyme de restriction digestion de l’ADN, l’ordre correct des étapes doit être suivies (Figure 1). Une fois que l’ADN est tachée et digéré par une enzyme donnée, une image du gel peut être prise pour déterminer le nombre de fragments et leur taille (Figure 2). Afin de déterminer l’efficacité de l’enzyme, le nombre total de bandes visibles attendues, divisé par le nombre de bandes visibles. Efficacité de l’enzyme égalé l’unité, si le nombre de bandes devrait et match vu. S’il n’y a plus de bandes sur le gel devrait ensuite, la valeur est supérieure à un et indique les réactions partiellement digérées. S’il y a des bandes de moins que prévus, alors la valeur est inférieur à 1, ce qui indique une digestion incomplète. L' Figure 2 a, voir la pistes 3 et 4, la mobilité des bandes a diminué, causant les bandes se déplacent vers les puits. Dans les couloirs 1 et 2, la quantité de colorant n’affecte pas sensiblement, la mobilité pour les bandes correspondent au contrôle. L' Figure 2 a, voies 5 et 6 montrent des bandes de plus que le contrôle, donc il indique une digestion partielle. Ce qui signifie, les colorants concernés le clivage de l’ADN sur le site de reconnaissance pour cette enzyme. Dans la Figure 2 b, tous appelés bandes sont vu pour toutes les concentrations de colorant, donc la teinture n’a pas interférer avec la digestion de l’ADN. Les titres Figure 2c la mobilité se déplace avec astérisques colorées.

Comme colorant concentration augmente pour les teintures avec -1, la mobilité diminue. Afin de déterminer la taille approximative des bandes, un contrôle est nécessaire de savoir où les molécules d’ADN natifs sont attendus par rapport à l’ADN tachée (Figure 2 a). Pour les colorants avec -3, la mobilité n’a pas diminué dans la mesure où les colorants-1 a fait, alors qu’il était plus facile de déterminer la taille de fragment (Figure 2 b). La différence de mobilité est dû au type de colorant utilisé, comme dans menad et al. 25. La variance de ces colorants est perçue en raison de la structure des colorants. L’éditeur de liens entre la fraction aromatique des colorants -3 a été plus longue que -1. Les colorants peuvent intercaler un peu différemment en raison de la différence dans la taille de l’éditeur de liens, qui peut expliquer pourquoi le changement de mobilité est moindre pour les colorants-3.

Si il n’y a aucun ADN ou les bandes d’ADN sont très faibles dans le gel, l’augmentation de la concentration de l’ADN est nécessaire. Toutefois, si la concentration d’ADN augmente, alors la quantité de colorant nécessaire augmentera aussi pour garder la bonne concentration de colorant à rapport ADN.

Figure 1
Figure 1 : Une représentation schématique des étapes requises lorsque digérer fluorochrome étiquetés de molécules d’ADN. ADN et YOYO-1 ou un autre colorant de la série TOTO, est déposé dans un tube noir et incubé pendant la nuit (O/N ; 15-20 h). Une enzyme de restriction est déposée dans un tube ; Il est placé dans un incubateur, à la température préférée, pour 2-4 h (tableau 2). Charger des échantillons dans un gel d’agarose immergé 0,7 % effectué avec 1 tampon x TAE. Papier de couleur sombre couvre que la zone de gel et les feux sont éteints, alors que le gel est couru durant la nuit pour empêcher les photoclivage de la teinture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Digestion de restriction de l’ADN intercalé avec un colorant de dimère de cyanine. (un) Lambda ADN est coloré avec différentes concentrations de YOYO-1 pendant la nuit (voie C: digéré lambda ADN sans colorant (contrôle), lane 1 : 1,9 ng, voie 2 : 3,8 ng, voie 3 : 19,4 ng, ng 4 : 32,2 lane, lane 5 : 48,3 ng, ng 6 : 63,5 lane de colorant par tranche de 100 ng d’ADN) et puis dige STED avec EcoRI à 37 ° C pendant 2 à 4 h. Toutes les réactions sont PST1 (E = 0,85 V/cm) à une température élevée gélifiant de 0,7 % gel d’agarose (HGT) fait avec 1 x TAE tampon (1 x TAE ; 40 mM Tris-HCl, 20 mM d’acide acétique, EDTA 1 mM). Gels sont colorées avec du bromure d’éthidium et photographiés avec un Transilluminateur lumière bleu couplé à une caméra. L Lane est une échelle de 1 Ko (taille, kb) ; Lane λ est pleine longueur lambda ADN ; Lane E est le modèle de bande attendue (tailles, Ko). (b) l’ADN Lambda est tachée de YOYO-3 (voie 2 : 3,8 ng, voie 3 : 19,4 ng, voie 4 : 32,2 ng, ng 5 : 48,3 lane, lane 1 : 1,9 ng, ng 6 : 63,5 lane de colorant par tranche de 100 ng d’ADN) et digéré avec HindIII à 37 ° C. (c) pour voir comment la mobilité est passé comme la concentration de YOYO-1 est augmentée, les astérisques colorées sont situés à côté de chaque bande pour chaque concentration de YOYO-1. Par exemple, la bande à 3,5 Ko a un astérisque rouge à côté de chaque tranche dans chaque concentration de YOYO-1. Les bandes inattendus sur voie de 5 et 6 n’ont pas un astérisque à côté des bandes. La figure est modifiée de menad et al. 25. droit d’auteur (2017) nucléosides, nucléotides et acides nucléiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nom chimique Nom abrégé Ex / Em (nm)
[(1 – 1 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] bis [4-[(3-méthyl-2(3H)-benzothiazolylidene) méthyl]]-, tetraiodide TOTO-1 514/533
1, 1′ - bis (4,4,8,8-tétraméthyl-4, 8-diazaundecamethylene) [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) disodique]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} YOYO-1 491/509
2, 2′-[1, 3-prop-anediylbis [(dimethyliminio) - 3, 1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-méthyl]-, tetraiodide POPO-1 434/456
2, 2′-[1, 3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} BOBO-1 462/481
2, 2′-{[4, 8-bis (dimethyliminio) undécane-1,11-diyl] bis [hydroxy-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide TOTO-3 642/660
1, 1′-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide YOYO-3 612/631
2, 2′-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3, 1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide POPO-3 534/570
2,2'-{propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-BENZOTHIAZOL-3-ium) tetraiodide BOBO-3 570/602

Tableau 1 : Abrégée des noms de famille TOTO de colorants avec IUPAC noms avec des émissions (Em) et d’excitation (Ex) maximima22.

Enzyme Sensible à la méthylation Mémoire tampon Température de bain de l’eau
BamHI N° 2 37 ° C
EcoRI Oui 2 37 ° C
HindIII N° 2 37 ° C
PmlI Oui 1 37 ° C
ScaI N° 2 37 ° C
SmaI Oui 3 25 ° C

Tableau 2 : Répertoriées dans le tableau est un sous-ensemble des enzymes possibles qui pourraient être utilisés dans ces expériences. Trois enzymes sont sensibles la méthylation et trois ne sont pas sensibles de la méthylation. Les tampons utilisés pour les enzymes et les températures d’incubation sont répertoriés pour chaque enzyme.

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Discussion

Pour digérer l’ADN fluorescent étiquetés (Figure 1), une série d’étapes sont nécessaires. Tout d’abord, l’ADN est taché avec un fluorochrome du jour au lendemain. L’ADN peut être incubée avec dimères de cyanine pendant une courte période de temps ; Cependant, Carlsson et al a conclu que les ADN créé doubles bandes pour chaque taille d’ADN en raison de la coloration incomplète20. Pour remédier à cela, l’ADN peut être coloré au jour le jour pour éviter tout doubles bandes. Il s’agit d’une étape cruciale dans le protocole. Si la teinture n'est pas incubée pendant une assez longue période, l’ADN de colorant peut ne pas être à l’équilibre et vous donnera un modèle double-bande. Si cela ne fonctionne pas, laisser le mélange de l’ADN-colorant s’équilibrer pendant une plus longue période de temps.

Ensuite, une enzyme de restriction est ajoutée au mélange ADN-colorant et digérée pendant 2-4 h à une température spécifique pour chaque enzyme. L’ADN doit être non méthylé d’enzymes sensibles de méthylation. Si ce n’est pas le cas, l’ADN méthylé inhibent l’enzyme de restriction de coupe l’ADN méthylé régions. En outre, la réaction doit être incubée dans le tampon correct et de la température pour l’enzyme. Chaque enzyme a une liste de tampons et de l’activité enzymatique dans chaque tampon. Choisissez le tampon avec l’activité enzymatique à 100 %, si possible. En ce qui concerne la température, veillez à ce qu’il est incubé à la bonne température. Si ce n’est pas le cas, il peut causer l’enzyme à perdre leur activité ou dénaturer si la température est trop élevée. EDTA est utilisé pour arrêter la réaction. La société où les enzymes ont été achetés aura un tableau avec les températures optimales et les conditions de tampon pour cette enzyme. Si le contrôle ne donne pas le bon nombre de bandes aux droite des poids moléculaires, vérifier pour voir si l’enzyme est expiré, augmenter le temps d’incubation, ou vérifiez pour vous assurer que la température est correcte pour cette enzyme.

Une fois que la réaction est terminée, les échantillons peuvent être chargés dans un gel. Tout d’abord, un gel est chargé dans le récipient de gel et plongé dans 1 x TAE tampon. Ensuite, l’ADN digéré est mélangé avec du colorant de chargement et la solution est chargée dans les puits du gel. Le couvercle est glissé au-dessus et les fils sont attachés à la boîte de gel. Un livre sombre, qui est collé ensemble, est posé sur le couvercle pour couvrir le couvercle et drapé sur les côtés. Une autre étape critique est que les échantillons soient protégés contre la lumière à tout moment, surtout lorsque le gel est en marche. L’alimentation doit être allumée et les lumières de la salle s’éteint. Afin d’éviter la photoclivage de l’ADN, échantillons sont protégés de la lumière tout le temps. S’il n’y a pas de papier noir, un tissu foncé peut être utilisé aussi bien. Si l’ADN ne bouge pas, assurez-vous que les fils sont connectés à la box et le bouton exécution ait été enfoncé.

Le matin, retirez le gel de la boîte de gel et charger le gel dans un récipient contenant du bromure d’éthidium. Le bromure d’éthidium permet de voir les bandes d’ADN sous le transilluminateur bleu clair (Figure 2). Autres colorants peuvent être utilisés à la place de bromure d’éthidium. Une caméra peut être montée au-dessus le transilluminateur lumière bleue pour capturer des images du gel. Selon le paramétrage, une station d’imagerie peut également être utilisée.

Cette méthode peut être utilisée pour n’importe quel colorant qui s’intercale ou taches ADN, non seulement la série TOTO. Menad et al. modifié une technique développée par Meng et al. pour déterminer si l’ADN coloré fluorescent pourrait être digérés par les enzymes de restriction24,25. Il s’agit de la seule technique utilisée pour déterminer si l’ADN préalablement teinté affecte enzymes de restriction. Cette méthode est limitée pour les enzymes de restriction disponibles dans le commerce, à moins qu’un scientifique ait accès aux autres enzymes de restriction qui ne figurent pas dans le commerce. Selon l’ADN, l’enzyme choisie doit avoir un patron de bandes ADN identifiable et suffisamment bandes (> 3) pour déterminer si la molécule d’ADN est pleine longueur. En outre, l’ADN doit être non méthylé si méthylation enzymes sensibles sont utilisés. Si l’ADN est méthylé, alors ne pas utiliser enzymes sensibles de méthylation.

Cette méthode est un moyen facile à utiliser pour déterminer si les enzymes de restriction peut couper des molécules d’ADN sur le site de reconnaissance teinté avec un colorant intercalant sans avoir besoin de concevoir des amorces pour un site donné de coupe34. Les futures applications de cette méthode serait pour déterminer si la mention fluorescent molécules à partir d’une expérience était pleine longueur en utilisant une enzyme de restriction et de déterminer la taille des bandes d’ADN par la digestion ou pour déterminer les profils de méthylation de l’ADN molécules. Expériences futures pourraient également déterminer si les enzymes cassures sont touchés par les colorants cyanine ou autres colorants fluorescents.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par l’Institut National pour générales Medical Sciences (NIGM) (5605100122001), une composante de la National Institutes of Health (NIH), ainsi que l’Université du Nebraska à Kearney (UNK) Summer Student Research Programme (SSRP) et UNK Bourse de recherche de premier cycle (URF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Unmethylated lambda DNA NEB N3013S
YOYO-1 ThermoFisher Scientific Y3601
TOTO-1 ThermoFisher Scientific T3600
POPO-1 ThermoFisher Scientific P3580
BOBO-1 ThermoFisher Scientific B3582
YOYO-3 ThermoFisher Scientific Y3606
TOTO-3 ThermoFisher Scientific T3604
POPO-3 ThermoFisher Scientific P3584
BamHI NEB R0136S
PmlI NEB R0532S
ScaI NEB R3122S
EcoRI  NEB R0101S
HindIII NEB R0104S
SmaI NEB R0141S
Tris Fisher BP152-1 Irritant
EDTA Fisher S316-212 Toxic
HCl Fisher S25358 Corrosive and irritant
Buffer 1 NEB B7201S NEB 1.1
Buffer 2 NEB B7202S NEB 2.1
Buffer 3 NEB B7204S NEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gel Lonza 50041
Acetic Acid Fisher S25118 Hazardous
Blue light transilluminator Dark Reader DR196 Wear correct eyewear 
Ethidium bromide Fisher 15585011 Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I camera Cannon
Apogee Model H4 Biorad 1704510
Power Pac Basic Power Supply Biorad 1645050 
Ficoll Fisher Scientific BP525-25
Bromophenol blue Fisher Scientific B-392
Xylene Cyanol Eastmen T1579

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References

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L’électrophorèse sur Gel de biochimie numéro 132 TOTO-1 YOYO-1 POPO-1 BOBO-1 TOTO-3 YOYO-3 3-POPO BOBO-3 enzyme de restriction digestion
Déterminer si l’ADN colorées avec un Cyanine colorant peuvent être digérées par les Enzymes de Restriction
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Maschmann, A., Masters, C., Davison, M., Lallman, J., Thompson, D., Kounovsky-Shafer, K. L. Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes. J. Vis. Exp. (132), e57141, doi:10.3791/57141 (2018).

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