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Biochemistry

अगर डीएनए एक Cyanine डाई के साथ दाग का निर्धारण प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा जा सकता है

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/57141
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

Summary

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए दाग डीएनए अणुओं एक वैज्ञानिक उंहें एक प्रयोग के दौरान देखने के लिए अनुमति देता है । यहां प्रस्तुत विधि में, डीएनए अणुओं पूर्व फ्लोरोसेंट रंजक के साथ दाग और मिथाइल और गैर मिथाइल संवेदनशील प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा रहे हैं ।

Abstract

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए डीएनए के दृश्य इस तरह के cyanine रंजक के रूप में रंजक की एक किस्म का इस्तेमाल करता है. ये रंजक उनके उच्च अपनत्व और डीएनए के लिए संवेदनशीलता के कारण उपयोग किया जाता है । आदेश में निर्धारित करने के लिए अगर डीएनए अणु प्रयोग के पूरा होने के बाद पूर्ण लंबाई रहे हैं, एक विधि अगर दाग अणुओं प्रतिबंध एंजाइमों के साथ डीएनए को पचाने से पूर्ण लंबाई रहे है निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, दाग डीएनए एंजाइमों को बाधित कर सकते हैं, तो एक विधि क्या एंजाइमों एक fluorochrome दाग डीएनए के लिए उपयोग कर सकते है निर्धारित करने की जरूरत है । इस विधि में, डीएनए एक cyanine डाई रात भर के साथ दाग है डाई और equilibrate को डीएनए की अनुमति । अगले, दाग डीएनए एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा, एक जेल और electrophoresed में भरी हुई है । प्रयोगात्मक डीएनए डाइजेस्ट बैंड एक silico में डाइजेस्ट प्रतिबंध एंजाइम गतिविधि का निर्धारण करने के लिए तुलना कर रहे हैं । अगर वहां बैंड की उंमीद के रूप में एक ही नंबर है, तो प्रतिक्रिया पूरी हो गई है । अपेक्षा से अधिक बैंड आंशिक पाचन इंगित करता है और कम बैंड अपूर्ण पाचन संकेत मिलता है । इस विधि का लाभ अपनी सादगी है और यह उपकरण है कि एक वैज्ञानिक एक प्रतिबंध एंजाइम परख और जेल ट्रो के लिए की आवश्यकता होगी का उपयोग करता है । इस विधि की एक सीमा है कि सबसे अधिक वैज्ञानिकों के लिए उपलब्ध एंजाइमों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइमों हैं; हालांकि, किसी भी प्रतिबंध एंजाइमों इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

टोटो श्रृंखला (टोटो-1, योयो-1, POPO-1, बोबो-1, टोटो-3, योयो-3, POPO-3, और बोबो-3; तालिका 1) प्रयोगों की एक विस्तृत विविधता में उपयोग किया जाता है, जहां डीएनए के दृश्य की आवश्यकता है1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. cyanine डिमर परिवार व्यापक रूप से उनके क्वांटम उपज, संवेदनशीलता के कारण प्रयोग किया जाता है, और डीएनए के अणुओं के लिए उच्च समानता18,19,20। Cyanine डिमर रंजक डबल असहाय डीएनए के लिए महान selectivity है और जब intercalated एक १०० करने के लिए १००० गुना वृद्धि की प्रतिदीप्ति21। Pyridinium रंजक (योयो-1, टोटो-1, योयो-3, और पूर्ण-3) उनके quinolium डाई (बोबो-1, POPO-1, बोबो-3, और POPO-3) समकक्षों (तालिका 1)22से एक छोटे उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है । इसके अलावा, डीएनए में cyanine dimers intercalated के लिए क्वांटम उपज उच्च है (०.२-०.६)22। हालांकि, एक एंजाइम का उपयोग करने के लिए एक डीएनए अणु के मिथाइल प्रोफ़ाइल का निर्धारण2 या एक डीएनए अणु के23 खिंचाव पहले से ही फ्लोरोसेंट डाई से सना हुआ एक विधि निर्धारित करने के लिए क्या एंजाइमों दाग डीएनए पचा जाएगा की आवश्यकता है । डाई के किसी भी प्रकार है कि डीएनए में intercalates या किसी भी एंजाइम कि डीएनए सब्सट्रेट का एक समझदार पैटर्न देता है इस विधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

मेंग एट अल. सबसे पहले जेल ट्रो के माध्यम से दाग डीएनए के पाचन दर24विभिन्न रंगों की एक किस्म का उपयोग कर निर्धारित किया है । Maschmann एट अल. गहरा में तल्लीन रंगों के टोटो परिवार को देखने के लिए । दोनों ने दाग डीएनए के पाचन दर निर्धारित करने के लिए अगर डीएनए एक दिया डाई के साथ सना हुआ एक प्रतिबंध के साथ पचा जा सकता है देखने के25एंजाइम । अन्य तरीकों से ऑप्टिकल चिमटी26 या एनएमआर27का उपयोग डीएनए के साथ रंजक intercalated के बंधन प्रभाव का अध्ययन । या तो विधि विशेष उपकरणों की आवश्यकता है; जबकि, इस विधि उपकरण है कि सबसे आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं निर्धारित करने के लिए अगर एक डाई एक प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ हस्तक्षेप की अनुमति देता है ।

इसके अतिरिक्त, अंय तरीकों में एक दिया अणु की लंबाई को मापने के लिए, ऑप्टिकल मानचित्रण एक सतह पर unसना हुआ डीएनए अणुओं लंबी है और पचा डीएनए खिंचाव और टुकड़ों के आकार का निर्धारण । डाई के Intercalation के लिए फ्लोरोसेंट दाग डीएनए अणुओं की समोच्च लंबाई में वृद्धि और इस्तेमाल डाई पर निर्भर करता है दिखाया गया है, समोच्च लंबाई अलग है21। इस विधि जीनोम की एक किस्म में उपयोग किया गया है1,3,4,6,13,28,29,30, 31. हालांकि, यदि अणुओं पूर्व दाग थे, डाई और एंजाइम पर निर्भर करता है, एंजाइम के लिए एक दिया डाई के साथ दाग डीएनए में कटौती करने में सक्षम नहीं हो सकता है । इसलिए, इस विधि निर्धारित करता है अगर डीएनए एक दिया डाई के साथ दाग एक एंजाइम के साथ पचा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, डाई और डाई उपयोग की एकाग्रता पर निर्भर करता है, एक जेल में डीएनए बैंड की गतिशीलता डीएनए रीढ़ की आंशिक unwinding की वजह से देशी डीएनए की तुलना में अधिक धीरे माइग्रेट होगा आधार जोड़े के बीच डालने के लिए डाई के लिए कमरे बनाने के लिए३२ .

हालांकि, कई बार इन रंजक आंशिक रूप से या पूरी तरह से कुछ प्रतिबंध एंजाइमों7,24की कार्रवाई को बाधित कर सकते हैं । यह फ्लोरोसेंट डाई के लगाव की वजह से डीएनए में एक संरचनात्मक परिवर्तन के कारण होने लगा है, जो अपनी विशिष्ट अनुक्रम पहचानने से एंजाइम को रोक सकता है । समझ कैसे इन रंगों प्रतिबंध एंजाइमों को प्रभावित प्रयोगों में मदद कर सकते हैं, जहां मिथाइल प्रोफ़ाइल या दाग डीएनए के खिंचाव की आवश्यकता है ।

हमारे विधि में, डीएनए ब्याज की एक fluorochrome के साथ दाग और एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा गया था । फिर डीएनए एक जेल पर electrophoresed था, छवि, और प्रतिबंध एंजाइम पाचन दर मापा गया था । प्रतिबंध एंजाइमों एक जेल पर कटौती पैटर्न के आधार पर चुना गया था । भी कई बैंड डीएनए बैंड के ओवरलैप का कारण बना है और भी कुछ बैंड डीएनए अणु की एक पूरी तस्वीर नहीं दे दिया । वहाँ एक मिठाई हाजिर करने के लिए पचा डीएनए अणु के प्रोफ़ाइल का निर्धारण कर सकता है; इसलिए, यह डीएनए इस्तेमाल किया और एंजाइम पर निर्भर करेगा । इस विधि का एक लाभ अपनी सादगी है; यह केवल एक प्रतिबंध पाचन और जेल ट्रो में इस्तेमाल किया उपकरणों की आवश्यकता है ।

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Protocol

1. रंजक, बफ़र्स और Agarose जेल की तैयारी

  1. डीएनए धुंधला या दाग डीएनए के पाचन के लिए निंनलिखित समाधान तैयार करते हैं ।
    1. 1x को तैयार करें (Tris-एचसीएल और ethylenediaminetetraacetic एसिड; EDTA) एक एेसे सिलेंडर या volumetric कुप्पी में 10 एमएम Tris-एचसीएल और 1 एमएम EDTA का उपयोग करते हुए बफर । कमरे के तापमान पर स्टोर (18-25 ° c) ।
    2. प्रत्येक डाई की aliquots बनाएं: टोटो-1, योयो-1, POPO-1, बोबो-1, टोटो-3, योयो-3, POPO-3, बोबो-3 (टेबल 1) । एक काले एंबर या काले १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिमी डाई के 4 µ एल पिपेट और 1x ते के ३६ µ एल जोड़ें, पिपेट का उपयोग कर मिश्रण; इस एकाग्रता एक १०० µ एम डाई समाधान (४० µ l कुल) बनाता है । प्रत्येक डाई के लिए इस कदम को पूरा करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: photobleaching या डाई के क्षरण को रोकने के लिए प्रकाश करने के लिए डाई को उजागर करने से बचें ।
    3. 10 मिमी बीआईएस-Tris-प्रोपेन-एचसीएल, 10 मिमी MgCl2, और १०० µ जी/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) का उपयोग कर 1 बफर तैयार करें । ५० mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl2, और १०० µ g/mL BSA का उपयोग करते हुए बफर 2 तैयार करें । ५० मिमी पोटेशियम एसीटेट, 20 मिमी Tris-एसीटेट, 10 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, और १०० µ जी/एमएल BSA का उपयोग कर 3 बफर तैयार करें । प्रत्येक एंजाइम कार्य करने के लिए इन विशिष्ट बफ़र्स में से एक की आवश्यकता होगी ।
  2. जेल ट्रो के लिए निम्न समाधान तैयार करें ।
    1. ०.२५% bromophenol नीला, ०.२५% xylene cyanol, 15% Ficoll में डीएच2ओ. स्टोर में कमरे के तापमान पर संयोजन के द्वारा एक 6x लोडिंग डाई बनाओ ।
    2. ०.७% agarose जेल बनाने के लिए, एक Erlenmeyer कुप्पी में उच्च तालमेल तापमान (HGT) agarose के ०.०७ g बाहर तौलना, 1x ताे बफर की १०० मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी के शीर्ष पर एक औंधा चोंच रखें ।
      1. एक गर्म थाली पर समाधान गर्मी जब तक बुलबुले कुप्पी के तल पर फार्म और शीर्ष करने के लिए नाव शुरू करते हैं ।
      2. हल गर्म थाली से निकालें, चलो समाधान ठंडा जब तक कुप्पी एक नंगे हाथ से छुआ जा सकता है, और फिर एक जेल कंघी के साथ एक २४.५ सेमी x २१.८ cm जेल मोल्ड में जेल डालना कुओं बनाने के लिए ।
      3. कंघी के पास या एक पिपेट टिप के साथ उन्हें popping द्वारा जेल की सतह पर के पास बुलबुले निकालें और जेल के लिए कम से 15 मिनट के लिए जमना अनुमति देते हैं । यह एक फ्रिज में संग्रहित किया जा सकता है (4 ° c) 1 सप्ताह के लिए प्लास्टिक की चादर में लिपटे जेल या संक्रमण के सूखने को रोकने के लिए । कैसे एक जेल चलाने के लिए के बारे में अधिक जानकारी के लिए ली एट अल देखें । ३३ .
        नोट: 30 व्यक्तिगत कुओं के साथ एक जेल कंघी का प्रयोग करें । प्रत्येक कुआं 2 मिमी की गहराई के साथ ४.५ मिमी चौड़ा होना चाहिए । अच्छी तरह की ऊंचाई जेल की राशि बॉक्स में डाला पर निर्भर करेगा ।
    3. ४० mm Tris-HCl, 20 mm एसिटिक एसिड, और 1 mm EDTA का उपयोग करते हुए 1x ताे (Tris-एसीटेट-EDTA) बफर तैयार करें । कमरे के तापमान पर स्टोर (18-25 ° c) ।

2. दाग डीएनए की तैयारी

  1. दाग लैंब्डा डीएनए (300-800 एनजी) रंजक के विभिंन aliquots का उपयोग कर । प्रत्येक डाई (तालिका 1) छह अलग सांद्रता का परीक्षण किया जाएगा, प्रतिबंध एंजाइम प्रति ४८ प्रतिक्रियाओं की कुल के लिए । निंन प्रक्रिया 1 प्रतिक्रिया (चित्र 1) के लिए सेट अप की रूपरेखा देती है ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस में १०० एनजी/µ एल स्टोर करने के लिए 1x ते का उपयोग लैंब्डा डीएनए पतला । ३०० µ की कुल मात्रा के साथ एक समाधान करें l
    2. सना unmethylated लैंब्डा डीएनए. प्रत्येक के लिए डाइजेस्ट से उंमीद बैंड, अनुमान ७५-१०० एनजी/ १.९ µ एम, ३.८ µ एम, १९.४ µ एम, ३२.२ µ एम, ४८.३ µ एम, ६३.५ µ m/१०० की सांद्रता का उत्पादन करने के लिए डाई की उचित मात्रा में जोड़ें डीएनए के एनजी ।
    3. रात भर गर्मी (15 एच-18 एच) 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. एक प्रतिक्रिया छोड़ एक नियंत्रण25के रूप में कार्य करने के लिए दाग.
      नोट: पाचन प्रतिक्रिया के लिए unmethylated डीएनए का प्रयोग करें । मिथाइल संवेदनशील एंजाइमों डीएनए में मिथाइलयुक्त क्षेत्रों में कटौती नहीं कर सकते और एक अपूर्ण पाचन का एक रूप दे देंगे ।

3. प्रतिबंध एंजाइम परख की तैयारी

  1. यह निर्धारित करने के लिए एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ दाग डीएनए डाइजेस्ट कि एंजाइम का दाग डीएनए पचा सकता है (चित्रा 1) ।
    1. अगले दिन, प्रतिबंध एंजाइम के 20 U जोड़ें, उपयुक्त बफर के 3 µ एल (तालिका 2), और आसुत, autoclaved और फ़िल्टर्ड पानी की कुल के लिए 30 µ l प्रत्येक एंजाइम प्रतिक्रिया के लिए, उच्चतम काटने दक्षता, जो निर्माता की वेबसाइट पर पाया जा सकता है के साथ बफर चुनें ।
    2. इष्टतम एंजाइमी गतिविधि के तापमान पर एक जल स्नान में प्रतिक्रियाओं प्लेस, 2 तालिका में सूचीबद्ध 6 Maschmann एट अलमें इस्तेमाल एंजाइमों के लिए, 2-4 ज(तालिका 2)25 के लिए ।
    3. ०.५ मीटर EDTA pH ८.० के 2 µ l को जोड़कर रिएक्शन रोकें ।

4. एक Agarose जेल में Electroeluting दाग डीएनए

  1. २४.५ cm x २१.८ cm gel मोल्ड (Step 1.2.2) से साइड्स हटायें और जेल ट्रो बॉक्स में रखें । डालो २.५ के एल 1x ताे बफर बॉक्स में । ध्यान से जेल कंघी हटाने के लिए, तो कुओं३३सुलभ हैं ।
  2. पिपेट एक प्लास्टिक की फिल्म पर प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रियाओं और 6x लोड हो रहा है डाई के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया गठबंधन । प्रत्येक प्रतिक्रिया समाधान के लिए, डीएनए समाधान (1x) के 5-6 µ एल प्रति 6x लोडिंग डाई के 1 µ एल जोड़ें । इसके बाद पिपेट (जिसमें लोडिंग डाई, < 18 µ l) को कुएं में डालें ।
  3. 1 केबी सीढ़ी, 9 µ एल के 1x ते, और 6x लोडिंग डाई के 2 µ l का 1 µ l मिलाएं । कुओं में समाधान लोड है कि अंय समाधान पार्श्व ।
  4. गहरे नीले या काले कागज या कपड़े के साथ जेल बॉक्स कवर । एक बिजली की आपूर्ति करने के लिए जेल बॉक्स कनेक्ट, 30 वी करने के लिए बिजली की आपूर्ति सेट, और इसे रातोंरात चलाने (15-20 ज). जबकि जेल चल रहा है रोशनी बंद करें, लेबल डीएनए के photocleavage को रोकने के लिए ।
  5. अगली सुबह बिजली सप्लाई बंद कर दें । ट्रे का उपयोग कर बाहर जेल ले लो और यह ४५ µ l ethidium ब्रोमाइड और 1 एल के साथ एक कंटेनर के लिए स्थानांतरण का 1x ताे बफर । अंधेरे में कमरे के तापमान पर कंटेनर स्टोर या पंनी में प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के लिए कवर । चलो जेल दाग कमरे के तापमान पर कम से ४५ मिनट के लिए ।
    सावधानी: दस्ताने के साथ ethidium ब्रोमाइड का उपयोग करें और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं । जब ethidium ब्रोमाइड समाधान युक्त कंटेनर की सफाई और दूर जेल फेंक, इस्तेमाल किया ethidium ब्रोमाइड के साथ सौदा करने के लिए कैसे निर्धारित करने के लिए अपने राज्यों के निपटान के दिशा निर्देशों से परामर्श; इसके अतिरिक्त, अंय दाग ethidium ब्रोमाइड के बजाय उपयोग किया जा सकता है ।

5. इमेजिंग Agarose जेल

  1. एक नीली बत्ती transilluminator के शीर्ष पर जेल प्लेस, जो 400-500 एनएम के बीच अधिकतम प्रकाश उत्पादन उत्सर्जन करता है । स्टेशन से जुड़े कैमरे के साथ तस्वीरें ले लो ।
    चेतावनी: प्रकाशक के लिए कवर का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें और प्रकाश स्रोत पर मोड़ करने से पहले सुरक्षात्मक चश्मे पर डाल दिया ।
    नोट: यह कदम भी किसी भी यूवी प्रकाश स्रोत या मानक जेल स्कैनर का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है ।
  2. ImageJ स्थिति पट्टी करने के लिए फ़ाइल खींचकर ImageJ में चित्रों को देखने और छवि ऊपर पॉप जाएगा.
  3. प्रयोग के लिए पाचन दर को जेल पर बैंड की तुलना में silico जेल पैटर्न में उंमीद के अनुसार निर्धारित करें । पाचन दर निर्धारित करने के लिए, प्रयोगात्मक बैंड की संख्या डीएनए बैंड की उंमीद की संख्या से विभाजित है24,25। यदि प्रयोगात्मक पचा डीएनए बैंड पैटर्न अपेक्षित पैटर्न है, पाचन दर 1 है । यदि प्रतिमान में अपेक्षा से अधिक अंश है, तो पाचन दर 1 से अधिक है । यदि प्रतिमान में अपेक्षा से कम अंश है, तो पाचन दर एक से कम है ।

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Representative Results

आदेश में निर्धारित करने के लिए यदि एक intercalating डाई एक प्रतिबंध डीएनए पचा एंजाइम को प्रभावित करेगा, कदम का सही क्रम (चित्रा 1) का पालन किया जाना चाहिए । एक बार डीएनए और दाग दिया एंजाइम के साथ पचा लिया है, जेल की एक तस्वीर के टुकड़े की संख्या और उनके आकार का निर्धारण करने के लिए ले जाया जा सकता है (चित्रा 2) । आदेश में एंजाइम दक्षता निर्धारित करने के लिए, दृश्यमान बैंड की संख्या से विभाजित अपेक्षित दिखाई बैंड की कुल संख्या । एंजाइम दक्षता एकता बराबर, यदि बैंड की संख्या की उंमीद है और मैच देखा । यदि जेल पर अधिक बैंड है तो उंमीद है, मूल्य एक से अधिक है और आंशिक रूप से पचा प्रतिक्रियाओं को इंगित करता है । अगर वहां कम बैंड है तो उंमीद है, तो मूल्य एक से कम है, जो अपूर्ण पाचन इंगित करता है । चित्रा 2a, फि ल्म 3 और 4 में बैंड की गतिशीलता कम हुई है, जिससे बैंड कुओं की ओर खिसकने लगता है । गलियों में 1 और 2, डाई की मात्रा गतिशीलता को प्रभावित नहीं करता है, इसलिए बैंड नियंत्रण मैच । चित्रा 2a, गलियाँ 5 और 6 नियंत्रण से अधिक बैंड दिखाएँ, तो यह आंशिक पाचन इंगित करता है. जिसका मतलब है, रंजक है कि एंजाइम के लिए मांयता साइट पर डीएनए के दरार प्रभावित । चित्रा बीमें, सभी की उंमीद बैंड सभी डाई सांद्रता के लिए देखा जाता है, तो डाई डीएनए के पाचन के साथ हस्तक्षेप नहीं किया । चित्र 2c रंगीन तारांकनों के साथ गतिशीलता परिवर्तन ट्रैक करता है ।

-1 के साथ रंजक के लिए डाई एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में, गतिशीलता कम हो जाती है । आदेश में बैंड के अनुमानित आकार का निर्धारण करने के लिए, एक नियंत्रण पता करने के लिए जहां देशी डीएनए अणुओं की तुलना में दाग डीएनए की अपेक्षा की जाती है की आवश्यकता है (चित्र 2a) । -3 के साथ रंजक के लिए, गतिशीलता हद तक कम नहीं किया है कि-1 रंजक था, तो यह टुकड़ा आकार (चित्रा 2 बी) का निर्धारण करने के लिए आसान था. गतिशीलता अंतर का उपयोग डाई के प्रकार के कारण है, के रूप में Maschmann एट अल में देखा. 25. रंगों की संरचनाओं के कारण इन रंगों के विचरण को देखा जाता है । रंजक-३ के लिए सुगन्धित moiety के बीच linker-1 से ज्यादा लंबा था । रंजक लिंकर आकार में अंतर के कारण थोड़ा अलग intercalate हो सकता है, जो समझा सकता है कि क्यों गतिशीलता पारी के लिए कम है-3 रंजक.

यदि डीएनए नहीं है, या डीएनए बैंड जेल में बहुत बेहोश हैं, डीएनए की एकाग्रता में वृद्धि की आवश्यकता है । हालांकि, अगर डीएनए एकाग्रता बढ़ जाती है, तो डाई की राशि की आवश्यकता भी डीएनए अनुपात को डाई की सही एकाग्रता रखने के लिए वृद्धि होगी ।

Figure 1
चित्र 1 : आवश्यक कदम का एक योजनाबद्ध जब fluorochrome डीएनए अणुओं लेबल को पचा। डीएनए और योयो-1, या टोटो श्रृंखला से एक और डाई, एक काले ट्यूब में जोड़ा जाता है और रात भर मशीन (O/N; 15-20 ज) । एक प्रतिबंध एंजाइम एक ट्यूब करने के लिए जोड़ा जाता है; यह एक मशीन में रखा जाता है, पसंदीदा तापमान पर, 2-4 (तालिका 2) के लिए । एक डूबे ०.७% में नमूने लोड agarose 1x ताे बफर के साथ बनाया जेल । काले रंग का कागज जेल बॉक्स शामिल है और रोशनी बंद कर रहे हैं, जबकि जेल डाई के photocleavage को रोकने के लिए रातोंरात भाग गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: एक cyanine डिमर डाई के साथ डीएनए intercalated के प्रतिबंध पाचन। (क) लैंब्डा डीएनए योयो-1 रातोंरात (लेन सी के विभिंन सांद्रता के साथ दाग है: कोई डाई के साथ पच लैंब्डा डीएनए (नियंत्रण), लेन 1:१.९ एनजी, लेन 2:३.८ एनजी, लेन 3:१९.४ एनजी, लेन 4:३२.२ एनजी, लेन 5:४८.३ एनजी, लेन 6:६३.५ डीएनए के एनजी प्रति डाई के एनजी) और फिर डाईग 2-4 एच के लिए ३७ ° c पर EcoRI के साथ sted सभी प्रतिक्रियाओं electrophoresed है (E = ०.८५ वी/cm) एक ०.७% उच्च तालमेल तापमान (HGT) agarose जेल 1x ताे बफर (1x ताे; ४० मिमी Tris-एचसीएल, 20 मिमी एसिटिक एसिड, 1 मिमी EDTA) के साथ बनाया गया है । जैल ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग रहे हैं और एक कैमरा करने के लिए युग्मित transilluminator एक नीली बत्ती के साथ छवि । लेन एल एक 1 kb सीढ़ी है (आकार, केबी); लेन λ पूर्ण लंबाई लैंब्डा डीएनए है; लेन ई अपेक्षित बैंड पैटर्न (आकार, केबी) है । (ख) लैंब्डा डीएनए योयो-3 (लेन 1 के साथ दाग है: १.९ एनजी, लेन 2:३.८ एनजी, लेन 3:१९.४ एनजी, लेन 4:३२.२ एनजी, लेन 5:४८.३ एनजी, लेन 6:६३.५ डीएनए के एनजी १०० प्रति डाई के एनजी) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर HindIII के साथ पचा । (c) यह देखने के लिए कि गतिशीलता को योयो-1 एकाग्रता के रूप में कैसे खिसकाया गया है, रंगीन तारांकन प्रत्येक योयो-1 एकाग्रता के लिए प्रत्येक बैंड के बगल में स्थित होते हैं । उदाहरण के लिए, ३.५ kb पर बैंड प्रत्येक योयो-1 एकाग्रता में प्रत्येक बैंड के बगल में एक लाल तारांकन चिह्न है । लेन 5 और 6 में अप्रत्याशित बैंड एक बैंड के बगल में तारे नहीं है । यह आंकड़ा Maschmann एट अल से संशोधित किया गया है । 25. कॉपीराइट (२०१७) Nucleosides, न्यूक्लियोटाइड, और न्यूक्लिक एसिड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

रासायनिक नाम संक्षिप्त नाम पूर्व/
[(1-1 ′-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl] भा [4-[(3-मिथाइल-2 (3H)-benzothiazolylidene) मिथाइल]]-, tetraiodide टोटो-1 514/533
1, 1 ′-(4, 4, 8, 8-tetramethyl-4, 8-diazaundecamethylene) भा [4-[(3-methylbenzo-1, 3-oxazol -2-yl) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide} योयो-1 491/509
2, 2 ′-[1, 3-सहारा-anediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl-1 (4H)-pyridinyl-4-ylidenemethylid-yne]] बीआईएस [3-मिथाइल]-, tetraiodide POPO-1 434/456
2, 2 ′-[1, 3-propanediylbis [(dimethylimi-निओ)-3, 1-propanediyl-1 (4H)-pyridinyl-4 – 1, 1 ′-[4, 8-भा (dimethyliminio) undecane-1, 11-diyl] बीआईएस {4-[3-(3-मिथाइल-1, 3-benzothiazol-2 (3H)-ylidene) प्रोप-1-en-1-yl] qui-nolinium} बोबो-1 462/481
2, 2 ′-{[4, 8-भा (dimethyliminio) undecane-1, 11-diyl] भा [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]} बीआईएस (3-मिथाइल-1, 3-benzothiazol-3-ium) tetraio-डिड टोटो-3 642/660
1, 1 ′-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl]] बीआईएस [4-[3-(3-मिथाइल-2 (3H)-benzoxazolylidene) -1-propenyl]]-, tetraiodide योयो-3 612/631
2, 2 ′-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3, 1-propanediyl-1 (4H)-pyridinyl-4-ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]] बीआईएस [3-मिथाइल]-, tetraiodide POPO-3 534/570
2, 2 '-{प्रोपेन-1, 3-diylbis [(dimethylazaniumdiyl) प्रोपेन-3, 1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]} बीआईएस (3-मिथाइल-1, 3-benzothiazol-3-ium) tetraiodide बोबो-3 570/602

तालिका 1: उत्सर्जन (Em) और उत्तेजना के साथ आईयूपीएसी नाम के साथ रंगों की टोटो परिवार के संक्षिप्त नाम (पूर्व) maximima22।

एंजाइम मिथाइल संवेदनशील बफ़र जल स्नान तापमान
BamHI नहीं 2 ३७ ° c
EcoRI हाँ 2 ३७ ° c
HindIII नहीं 2 ३७ ° c
PmlI हाँ 1 ३७ ° c
ScaI नहीं 2 ३७ ° c
SmaI हाँ 3 25 डिग्री सेल्सियस

तालिका 2: तालिका में सूचीबद्ध संभव एंजाइमों का एक सबसेट है कि इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है । तीन एंजाइमों मिथाइल संवेदनशील होते है और तीन मिथाइल संवेदनशील नहीं हैं । एंजाइमों और मशीन तापमान के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स प्रत्येक एंजाइम के लिए सूचीबद्ध हैं ।

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Discussion

आदेश में फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए को पचाने के लिए (चित्रा 1), कदम की एक श्रृंखला की आवश्यकता है । सबसे पहले, डीएनए एक fluorochrome रात भर के साथ दाग है । डीएनए समय की एक छोटी अवधि के लिए cyanine dimers के साथ मशीन किया जा सकता है; हालांकि, Carlsson एट अल पाया कि डीएनए एक डीएनए के लिए डबल बैंड बनाया आकार अधूरा धुंधला20के कारण । इस उपाय करने के लिए, डीएनए होने से डबल बैंड को रोकने के लिए रातोंरात दाग हो सकता है । यह प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है । यदि डाई एक लंबे समय के लिए पर्याप्त नहीं है, डाई-डीएनए संतुलन में नहीं हो सकता है और एक डबल बैंडिंग पैटर्न दे देंगे । यदि यह होती है, डीएनए डाई मिश्रण समय की एक लंबी अवधि के लिए equilibrate करने की अनुमति ।

अगले, एक प्रतिबंध एंजाइम डीएनए डाई मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया है और प्रत्येक एंजाइम के लिए एक विशिष्ट तापमान पर 2-4 ज के लिए पचा । डीएनए मिथाइल संवेदनशील एंजाइमों के लिए unmethylated होना चाहिए । यदि ऐसा नहीं है, मिथाइलयुक्त डीएनए मिथाइलयुक्त क्षेत्रों में डीएनए काटने से प्रतिबंध एंजाइम को बाधित करेगा । इसके अतिरिक्त, प्रतिक्रिया सही बफर और एंजाइम के लिए तापमान में मशीन किया जाना चाहिए । प्रत्येक एंजाइम बफ़र्स और प्रत्येक बफ़र में एंजाइम गतिविधि की एक सूची है । १००% पर एंजाइम गतिविधि के साथ बफर चुनें, यदि संभव हो तो । तापमान के लिए के रूप में, सुनिश्चित करें कि यह सही तापमान में मशीन है । यदि यह नहीं है, यह एंजाइम गतिविधि या स्वभाव खो अगर तापमान बहुत अधिक है के कारण हो सकता है । EDTA प्रतिक्रिया को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है । कंपनी जहां एंजाइमों खरीदा गया था कि एंजाइम के लिए इष्टतम तापमान और बफर शर्तों के साथ एक चार्ट होगा । यदि नियंत्रण सही आणविक भार पर बैंड की सही संख्या नहीं देता है, देखने के लिए जांच अगर एंजाइम समाप्त हो गया है, मशीन समय, या सुनिश्चित करें कि तापमान कि एंजाइम के लिए सही है बनाने के लिए जांच को बढ़ाने के लिए ।

एक बार प्रतिक्रिया पूरा हो गया है, नमूने एक जेल में लोड किया जा सकता है । सबसे पहले, एक जेल जेल कंटेनर में लोड और 1x ताे बफर में डूबे है । अगला, पचा डीएनए लोड हो रहा है डाई के साथ मिलाया जाता है और समाधान जेल के कुओं में भरी हुई है । ढक्कन पर गिरावट है और तार जेल बॉक्स से जुड़े हुए हैं । एक काले कागज, कि एक साथ टेप है, ढक्कन के शीर्ष पर रखा ढक्कन और पक्षों पर कपड़े कवर किया जाता है । एक और महत्वपूर्ण कदम यह है कि नमूने हर समय प्रकाश से सुरक्षित हैं, खासकर जबकि जेल चल रहा है । बिजली की आपूर्ति चालू होनी चाहिए और कमरे में लगी लाइटें बंद कर दी जाएं । आदेश में डीएनए की photocleavage को रोकने के लिए, नमूने प्रकाश से पूरे समय सुरक्षित हैं । अगर कोई अंधेरे कागज, एक काले कपड़े के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है । अगर डीएनए नहीं चलता है तो यह सुनिश्चित कर लें कि तार बॉक्स से जुड़े हैं और रन बटन दब गए हैं ।

सुबह में, जेल जेल बॉक्स से बाहर ले और एक कंटेनर है कि ethidium ब्रोमाइड शामिल में जेल लोड । Ethidium ब्रोमाइड हमें ब्लू लाइट transilluminator (चित्रा 2) के तहत डीएनए बैंड देखने के लिए अनुमति देता है । अन्य रंजक ethidium ब्रोमाइड के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है । जेल की तस्वीरों को कैद करने के लिए एक कैमरा ब्लू लाइट transilluminator के ऊपर चढ़कर जा सकता है । सेटअप के आधार पर, एक इमेजिंग स्टेशन भी उपयोग किया जा सकता है ।

इस विधि किसी भी डाई कि intercalates या दाग डीएनए, नहीं बस टोटो श्रृंखला के लिए उपयोग किया जा सकता है । Maschmann एट अल. संशोधित एक तकनीक मेंग एट अलद्वारा विकसित की है । यह निर्धारित करने के लिए अगर फ्लोरोसेंट दाग डीएनए प्रतिबंध एंजाइमों24,25के साथ पचा जा सकता है । यह केवल अगर पूर्व दाग डीएनए प्रतिबंध एंजाइम को प्रभावित करता है निर्धारित करने के लिए उपयोग तकनीक है । इस विधि प्रतिबंध व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइमों तक ही सीमित है, जब तक एक वैज्ञानिक अंय प्रतिबंध एंजाइमों कि वाणिज्यिक सूचीबद्ध नहीं है के लिए उपयोग किया है । डीएनए पर निर्भर करता है, चुना एंजाइम एक समझदार डीएनए बैंड पैटर्न और पर्याप्त बैंड (> 3) होना चाहिए अगर डीएनए अणु पूर्ण लंबाई है निर्धारित करने के लिए । साथ ही अगर मिथाइल सेंसिटिव एंजाइम्स का इस्तेमाल किया जाए तो डीएनए unmethylated होना चाहिए । यदि डीएनए मिथाइलयुक्त है, तो मिथाइल संवेदनशील एंजाइमों का उपयोग न करें.

इस विधि का उपयोग करने के लिए एक आसान तरीका है अगर प्रतिबंध एंजाइमों मांयता एक intercalating डाई के साथ दाग एक दिया काट साइट के लिए प्राइमरों डिजाइन की जरूरत के बिना पर डीएनए अणुओं में कटौती कर सकते है निर्धारित करने के लिए३४। इस विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए अगर एक प्रयोग से फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके पूर्ण लंबाई थे और डाइजेस्ट से डीएनए बैंड के आकार का निर्धारण या डीएनए के मिथाइल प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए निर्धारित किया जाएगा अणुओं. भविष्य के प्रयोगों को भी अगर निक एंजाइम cyanine रंजक या अन्य फ्लोरोसेंट रंगों से प्रभावित कर रहे हैं निर्धारित कर सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंस (NIGMS) (५६०५१००१२२००१), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Kearney में नेब्रास्का विश्वविद्यालय (UNK) ग्रीष्मकालीन छात्र अनुसंधान कार्यक्रम (SSRP) के एक घटक के लिए वित्त पोषित किया गया था, और UNK स्नातक रिसर्च फैलोशिप (URF) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Unmethylated lambda DNA NEB N3013S
YOYO-1 ThermoFisher Scientific Y3601
TOTO-1 ThermoFisher Scientific T3600
POPO-1 ThermoFisher Scientific P3580
BOBO-1 ThermoFisher Scientific B3582
YOYO-3 ThermoFisher Scientific Y3606
TOTO-3 ThermoFisher Scientific T3604
POPO-3 ThermoFisher Scientific P3584
BamHI NEB R0136S
PmlI NEB R0532S
ScaI NEB R3122S
EcoRI  NEB R0101S
HindIII NEB R0104S
SmaI NEB R0141S
Tris Fisher BP152-1 Irritant
EDTA Fisher S316-212 Toxic
HCl Fisher S25358 Corrosive and irritant
Buffer 1 NEB B7201S NEB 1.1
Buffer 2 NEB B7202S NEB 2.1
Buffer 3 NEB B7204S NEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gel Lonza 50041
Acetic Acid Fisher S25118 Hazardous
Blue light transilluminator Dark Reader DR196 Wear correct eyewear 
Ethidium bromide Fisher 15585011 Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I camera Cannon
Apogee Model H4 Biorad 1704510
Power Pac Basic Power Supply Biorad 1645050 
Ficoll Fisher Scientific BP525-25
Bromophenol blue Fisher Scientific B-392
Xylene Cyanol Eastmen T1579

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References

  1. Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
  2. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
  3. Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
  4. Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
  5. Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
  6. Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
  7. Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
  8. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  9. Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
  10. Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
  11. Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
  12. Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
  13. Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
  14. Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
  15. Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
  16. Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
  17. Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
  18. Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
  19. Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
  20. Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
  22. Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
  23. Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
  24. Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
  25. Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
  26. Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
  27. Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
  28. Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
  29. Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
  30. Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
  31. Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
  32. Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
  33. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).

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जैव रसायन अंक १३२ जेल ट्रो टोटो-1 योयो-1 POPO-1 बोबो-1 टोटो-3 योयो-3 POPO-3 बोबो-3 प्रतिबंध एंजाइम पाचन
अगर डीएनए एक Cyanine डाई के साथ दाग का निर्धारण प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा जा सकता है
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Maschmann, A., Masters, C., Davison, M., Lallman, J., Thompson, D., Kounovsky-Shafer, K. L. Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes. J. Vis. Exp. (132), e57141, doi:10.3791/57141 (2018).

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