Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.
Summary
Zebrafisk blev for nylig brugt som en in vivo modelsystemet for at studere DNA replikation timing under udvikling. Her er detaljerede protokoller for at bruge zebrafisk embryoner til profil replikering timing. Denne protokol kan tilpasses nemt for at studere replikering timing i mutanter, enkelte celletyper, sygdomsmodeller og andre arter.
Abstract
DNA replikation timing er en vigtig cellulær karakteristiske, udviser betydelige relationer med kromatin struktur, transskription og DNA mutation satser. Forekomme ændringer i replikering timing under udvikling og i kræft, men rolle replikering timing spiller i udvikling og sygdom er ikke kendt. Zebrafisk blev for nylig etableret som en i vivo modelsystem til at studere replikering timing. Her er detaljerede protokoller for at bruge zebrafisk for at bestemme DNA replikation timing. Efter sortering celler fra embryoner og voksen zebrafisk, kan høj opløsning genome-wide DNA replikation timing mønstre konstrueres ved at fastslå ændringer i DNA eksemplarnummer gennem analyse af næste generation sequencing data. Zebrafisk modelsystem giver mulighed for vurdering af replikering timing ændringer, der sker in vivo i hele udvikling, og kan også bruges til at vurdere ændringer i enkelte celletyper, sygdomsmodeller eller mutant linjer. Disse metoder gør det muligt studier undersøger de mekanismer og determinanter for replikering timing etablering og vedligeholdelse under udvikling, rolle replikering timing spiller i mutationer og tumordannelse og virkningerne af prøvningen replikering timing på udvikling og sygdom.
Introduction
For celler at kunne opdele, skal de først præcist og trofast gentage deres hele genom. Genome dobbeltarbejde opstår i en reproducerbar mønster, kendt som DNA replikation timing program1. DNA replikation timing er korreleret med kromatin organisation, epigenetiske marks og gen expression2,3. Ændringer i replikering timing opstår i hele udvikling, og er betydeligt relateret til transcriptional programmer og ændringer af kromatin mærker og organisation4,5. Derudover replikering timing er korreleret med mutationsmønstre frekvenser, og ændringer i tidsplanen overholdes i de forskellige typer af kræft6,7,8. Trods disse bemærkninger, mekanismer og determinanter for replikering timing etablering og regulering er stadig stort set ukendt, og rollen det spiller i udvikling og sygdom er uafklaret. Derudover indtil for nylig genome-wide replikeringen havde timing forandringer, der sker i hele hvirveldyr udvikling kun undersøgt i celle kultur modeller.
Zebrafisk, Danio rerio, er velegnet til at studere replikering timing i vivo under udviklingen, som en enkelt parring par kan udbytte af hundredvis af embryoner, der udvikler sig hurtigt med mange ligheder med pattedyr udvikling9, 10. Derudover hele zebrafisk udvikling er der ændringer til celle cyklus, kromatin organisation og transcriptional programmer, der deler relationer med DNA replikation timing11. Zebrafisk er også en fremragende genetiske model, som de er særligt åbne over for manipulation ved transgenese, mutagenese og målrettede mutationer, og genetiske skærme har identificeret mange gener kræves for hvirveldyr udvikling12. Zebrafisk kan derfor bruges til at identificere gener involveret i replikering timing etablering og vedligeholdelse og at observere effekterne af deregulering replikering timing på hvirveldyr udvikling. Transgene linjer kan også bruges til at vurdere replikering timing fra enkelte celletyper isoleret på forskellige udviklingsmæssige timepoints eller i sygdomstilstande. Vigtigere, er der forskellige zebrafisk modeller af menneskers sygdom, der kan bruges til at undersøge rollen af replikering timing i sygdom dannelse og progression9,13,14.
For nylig, de første replikering timing profiler blev genereret fra zebrafisk, etablere det som et modelsystem til at studere replikering timing i vivo15. For at opnå dette, blev celler indsamlet fra zebrafisk embryoner i flere faser af udvikling og i en celletype isoleret fra voksen zebrafisk. Celler blev derefter sorteret efter FACS (Fluorescens-aktiveret celle sortering) baseret på DNA indhold at isolere G1 og S fase populationer. Bruger eksemplet G1 som en kopi nummer kontrol, kopiere antal variationer i S fase populationer var bestemt og bruges til at udlede relative replikering timing16. Ændringer i replikering timing kan derefter sammenlignes direkte mellem forskellige udviklingsmæssige prøver og celletyper og det blev brugt til at bestemme forandringer i replikering timing, der forekommer i vivo hele hvirveldyr udvikling. Denne metode giver flere fordele sammenlignet med andre genomisk metoder, først og fremmest at det ikke kræver mærkning med thymidine analoger eller immunoprecipitation af DNA4,6.
Her er detaljerede protokoller til profil genome-wide DNA replikation timing på høj opløsning i zebrafisk. Disse protokoller er blevet brugt til at fastslå relationer med genomisk og epigenetiske funktioner i zebrafisk genom, samt profilering ændringer i disse relationer, der opstår i hele udvikling. Disse protokoller er også let tilpasses for at studere ændringer i replikering timing i mutantstammen af zebrafisk og sygdomsmodeller. Derudover disse metoder til at give et fundament, der kan udvides ved for at studere replikering timing i bestemte celletyper, ved første sortering ud de enkelte celletyper fra zebrafisk. For zebrafisk kan tjene som en fremragende i vivo modelsystem til at studere replikering timing og i sidste ende afslører de biologiske funktioner af denne vigtige epigenetiske træk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk giver et nyt og unikt i vivo modelsystem at studere DNA replikation timing. Når tidsindstillet parringer er udført som beskrevet i denne forsøgsplan, tusindvis af embryoner kan indsamles i en enkelt dag til eksperimenter. Disse embryoner udvikle synkront gennem netop timet og tydeligt præget faser af udvikling. Zebrafisk kan nemt og præcist iscenesat af morfologi ved hjælp af et stereomikroskop, som zebrafisk embryoner udvikle eksternt og optisk klare. Denne protokol beskriver i detaljer brug af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health gennem tilskud 5P20GM103636-02 (herunder Flow flowcytometri core support) og 1R01GM121703, samt priser fra Oklahoma Center for voksne stamceller Forskning.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
