Summary
Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.
Abstract
DNA çoğaltma zamanlaması Kromatin yapısı, transkripsiyon ve DNA mutasyon oranları önemli ilişkiler sergileyen bir önemli hücresel özelliği olduğunu. Geliştirme sırasında ve kanser, çoğaltma zamanlaması değişiklikler gerçekleşir ama gelişiminde rolü çoğaltma zamanlaması çalış ve hastalık olmadığı bilinmiyor. Zebra balığı son zamanlarda çoğaltma zamanlaması çalışmaya vivo içinde modeli sistemi kuruldu. İşte Zebra balığı DNA çoğaltma zamanlaması belirlemek için olacak kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Embriyo ve yetişkin Zebra balığı hücrelerden sıraladıktan sonra yüksek çözünürlüklü genom çapında DNA çoğaltma zamanlaması desenleri DNA kopya sayısı sonraki nesil sıralama veri analizi ile değişiklikler belirlenerek oluşturulabilir. Zebra balığı modeli sistemi içinde geliştirme vivo ortaya ve değişiklikleri tek tek hücre tipleri, hastalık modelleri ve mutant hattındaki değerlendirmek için de kullanılabilir çoğaltma zamanlaması değişiklikleri değerlendirilmesi için izin verir. Bu yöntemler çalışmalar araştırma geliştirme sırasında mekanizmaları ve çoğaltma zamanlaması kuruluş ve bakım belirleyicileri olanak tanır, mutasyonlar ve tumorigenesis ve perturbing etkileri rolü çoğaltma zamanlaması çalış çoğaltma zamanlamasını geliştirme ve hastalık.
Introduction
Başarılı bir şekilde bölmek hücreler için onlar ilk doğru ve sadakatle tüm onların genom çoğaltması gerekir. DNA çoğaltma zamanlama programı1olarak bilinen bir tekrarlanabilir model genom çoğaltma oluşur. DNA çoğaltma zamanlaması Kromatin organizasyon, epigenetik işaretleri ve gen ifade2,3ile ilişkilidir. Çoğaltma zamanlaması değişiklikleri geliştirme ortaya ve Kromatin işaretleri ve organizasyon4,5için değişiklik ve transkripsiyon için önemli ölçüde ilgili programlar vardır. Ayrıca, çoğaltma zamanlaması mutational frekansları ile ilişkilidir ve kanser6,7,8çeşitli zamanlama değişimler gözlenmektedir. Bu gözlemler rağmen mekanizmaları ve çoğaltma zamanlaması kuruluş ve yönetmelik belirleyicileri hala büyük ölçüde bilinmeyen ve bu gelişmede rol ve belirsiz bir hastalıktır. Ayrıca, son zamanlarda genom çapında çoğaltma kadar omurgalı geliştirme meydana gelen değişiklikler zamanlama yalnızca hücre kültür modellerinde muayene.
Zebra balığı, Danio rerio, geliştirme sırasında çoğaltma zamanlaması vivo içinde çalışmaya uygun olarak tek bir çiftleşme çift, geliştirmek embriyolar yüzlerce memeli geliştirme9birçok benzerlikler ile hızla yol açabilir, 10. Ayrıca, Zebra balığı geliştirme, hücre döngüsü, Kromatin organizasyon ve ilişkileri DNA çoğaltma zamanlaması11ile paylaşan transkripsiyon programları değişiklik vardır. Zebra balığı da mükemmel bir genetik model özellikle transgenesis, mutagenesis ve hedeflenen mutasyonlar tarafından manipülasyon için mükellef olduklarını, ve vardır birçok genlerin omurgalı geliştirme12için gerekli genetik ekranlar belirledik. Bu nedenle, Zebra balığı genler çoğaltma zamanlaması kuruluş ve bakım dahil tanımlamak ve çoğaltma zamanlaması omurgalı geliştirme yapmak etkilerini gözlemlemek için kullanılabilir. Transgenik satırları tek tek hücre tipleri, farklı gelişim timepoints veya hastalık ortamlarda izole üzerinden çoğaltma zamanlaması değerlendirmek için kullanılabilir. Önemlisi, çoğaltma zamanlaması, hastalık oluşumu ve ilerleme9,13,-14rolünü araştırmak için kullanılan insan hastalık çeşitli Zebra balığı modelleri vardır.
Son zamanlarda, ilk çoğaltma zamanlaması profilleri Zebra balığı vivo içinde15zamanlama çoğaltma çalışma modeli sistemi kurulması, oluşturulan. Bunu yapmak için hücreleri Zebra balığı embriyo gelişimi ve yetişkin Zebra balığı izole bir hücreye birden fazla aşamalarında toplanmıştır. Hücreleri sonra G1 ve S faz popülasyonlar izole etmek için DNA içeriğine göre (floresan aktif hücre sıralama) FACS tarafından sıralanır. G1 örnek kopya numarası denetimi olarak kullanarak, numara varyasyonları nüfus tespit ve göreli çoğaltma zamanlaması16anlaması için kullanılan S aşamasında kopyalayın. Çoğaltma zamanlaması değişiklikleri daha sonra doğrudan farklı gelişim örnekleri ve hücre tipleri arasında karşılaştırılabilir ve bu vivo omurgalı geliştirme boyunca oluşan çoğaltma zamanlaması değişiklikleri belirlemek için kullanılmıştır. Bu yöntem esas bu timidin analogları veya DNA4,6immunoprecipitation ile etiketleme gerektirmez genomik diğer yöntemler üzerinde birçok avantaj sunar.
İşte profil genom çapında DNA çoğaltma zamanlaması, iletişim kurallarını ayrıntılı yüksek çözünürlüklü Zebra balığı. Bu protokoller geliştirme oluşan bu ilişkiler değişimler profil oluşturma yanı sıra, Zebra balığı genom genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkileri belirlemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralları da kolayca değişiklikler çoğaltma zamanlaması Zebra balığı mutant suşu ve hastalık modelleri çalışmaya adapte. Buna ek olarak, bu yöntemleri üzerine çoğaltma zamanlaması belirli hücre türleri, Zebra balığı tek hücre türlerinden ilk sıralama tarafından çalışma için genişletilebilir bir temel sağlar. Zebra balığı çoğaltma zamanlaması çalışmaya ve sonuçta bu önemli epigenetik özellik biyolojik fonksiyonları ortaya çıkarmak için bir mükemmel vivo içinde modeli sistemi olarak hizmet verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar Oklahoma tıbbi araştırma Vakfı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri ile sıkı uygun olarak ele.
1. yetişkin Zebra balığı üreme için ayarlama
- Tek bir baskı yetişkin erkek ve dişi Zebra balığı büyük bir kohort üremek için kullanın. Zebra balığı bile tek bir baskı genetik makyaj küçük farklılıklar vardır, büyük bir kohort sonuçların nüfusun genetik değişkenliği temsilcisi ve nüfusun küçük bir alt kümesi değil sınırlı olduğundan emin olmak için kullanın.
- Embriyo toplanan önceki gece üreme yetişkin onlarca tank doğurmak içine yerleştirin, kadın ve erkek yaklaşık olarak eşit sayıda kullanın. Deneme bağlı olarak, aşağıdaki üreme stratejileri kullanın.
- Strateji 1 ıslahı: bireysel üreme tanklarda birkaç erkek ve dişi Zebra balığı yerleştirin, bir bölücü dişilerle erkekler ayrı. Bu yaklaşım kullandıysanız, birçok farklı üreme tankları tertibat ve embriyo her biyolojik değişkenlik temsilcisi nüfusun olduğundan emin olmak için havuz.
- Strateji 2 üreme: erkek ve dişi Zebra balığı büyük yetiştirme tankında onlarca birleştirir. Bu strateji kullanmak yeterli sayıda embriyo vardır sürece, kurucuları ve vardır bu nedenle nüfus genetiği temsil eden çeşitli geldiler varsaymak makul.
2. matings - toplama, sıralama ve deneyler için Zebra balığı embriyo konut zaman aşımına uğradı
- Zamanlanmış matings, sabahları olmak ışık döngüleri en kısa zamanda başlayan gerçekleştirin. Gecede oluşturulan herhangi bir embriyo atmak.
- Balık (3-5 cm) sığ sularda üremeye embriyo ile kaçmak için yanlış alt ile 10 dakika süreyle izin verir.
- 10 dakika sonra embriyo bir süzgeç aracılığıyla dökme ve 10 cm tabak yıkama şişe içine durulama tarafından toplamak. Tüm embriyoların aynı zaman noktada toplanan havuzu işaretle onları toplama ve hemen bir kuluçka 28.5 ° C'de yer zamanla
- Embriyolar yüzlerce tek bir çiftleşme çift bir günde beklenebilir. Yetişkinler 10 min elde edilen embriyo sayısı daha az yirmi kadar devir doğurmak için izin.
- Yaklaşık 1-1.5 h koleksiyonu, ölü ve döllenmemiş embriyo kaldırmak için sıralama embriyo sonra. Embriyo sıralamak için kuluçka kaldır ve diseksiyon mikroskop altında gözlemlemek.
- Embriyo sayısı ve 10 cm tabak başına 100 embriyo yoğunluğu yerleştirin.
- Taze E3 orta (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) eklemek ve embriyo 28.5 ° C kuluçka dönmek.
3. Dechorionate, deyolk ve Zebra balığı embriyo düzeltmek
Not: Bu bölümde protokolü 48 saat sonrası döllenme (hpf) önce embriyo için tasarlanmıştır. Daha sonra yaşlardaki embriyo chorions kaldırmak için gerek yoktur (48 sonra hpf), onlar genellikle doğal düşmek gibi. Deyolk veya chorions kaldırmak için gerek yoktur balık büyük 5 gün fertilizasyon (dpf) sonrası.
- Embriyoların istenen gelişimsel yaşa gelince, "Aşamaları, embriyonik geliştirme, Zebra balığı"17göre hafif mikroskopla morfolojik gelişimi uygun sahne doğrulayın.
- 15 mL konik tüp 1500 aşamalı embriyo transfer ve birkaç kez E3 ile yıkayın.
- E3 1 mL ve 100 her embriyo için Pronase çözümü (30 mg/mL) 20 µL ekleyin ve hafifçe girdap. 1500 embriyolar kadar dechorionated E3 15 mL ile tek bir tüp içinde olabilir.
- Tüp yan yattı ve embriyo maksimum hacim oranı yüzeye emin olmak için bile bir katmanda düzenlemek. Yavaşça tüm chorions kadar her 2-3 dk embriyo kapalı düşmüş tüp kışkırtmak. Toplam dechorionation süre Pronase etkinlik bağlı olarak değişir.
- Süpernatant kaldır ve yavaşça embriyo 3 kez ile E3 10 mL durulayın. Embriyo Protokolü'nün bu bölümün geri kalanında buz yerleştirin.
- E3 kaldırmak ve yıkama embriyo ile taze hazırlanmış buz gibi deyolking arabellek (0.5 x kalsiyum olmadan Ginzburg balık zil'ın çözüm: 55 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO3).
- Buz gibi deyolking arabellek 500 embriyolar için 1 mL ekleyin.
- Bir P1000 kullanarak yavaşça pipet embriyo yukarı ve aşağı 5 - 10 kat için sarısı çuval bozabilir.
- 1 mL 1.5 mL microfuge tüp ve 5 min için 4 ° C ve 500 x g santrifüj aktarın.
- Buz gibi 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, pH 7,0) zil'ın çözümü kaldırmak için 1 mL ile süpernatant ve yıkama Pelet kaldırın. Santrifüj 4 ° C'de ve 5 min için 500 x g.
- Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 1 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend. Tüp Buza koyun.
- Buz gibi soğuk etanol (alkol) 3 mL 15 mL konik tüp ekleyin. Alkol girdap tüp düşük ayarı hafifçe üfleyin.
- P1000 yavaş yavaş (saniyede 1 damla) damla Zebra balığı embriyo hücre süspansiyon alkol içine vortexing ederken yavaşça kullanarak.
- 1 ml embriyo hücre süspansiyon % 75'i son fiksasyon çözüm için bir toplam eklemek alkol.
- Hücre sonra 1 mL süspansiyon eklendi, hafifçe karıştırın ve en az 1 h için-20 ° C'de yer için girdap tüp. Bu tüpler maksimum hacim oranı yüzeye emin olun ve embriyo ve birbirine destek hücrelerinin sayısını azaltmak için onların yanına koyun için tavsiye edilir. Embriyo hücreleri-20 ° C'de 2-3 hafta için saklayın.
4. DNA ve embriyo sıralama FACS boyama
Not: Bu bölümde Protokolü'nün 1 dpf, embriyo için tasarlanmıştır.
- Alkol-sabit embriyo hücreleri-20 ° C ve 5 min için 4 ° C 1500 x g, santrifüj kaldırın.
- Tüp buz ve Kaldır süpernatant üzerinde dikkatlice yerleştirin. Bir P1000 kullanarak, yavaşça 1 mL taze hazırlanmış soğuk PBS-BSA (1 x PBS, %1 sığır serum albümin) hücrelerde resuspend.
- 4 ° C ve 5 min için 1500 x g hücreleri santrifüj kapasitesi ve Buza koyun.
- Çözüm (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0) Boyama Kaldır süpernatant ve resuspend hücrelerinde propidium iyodür (PI) 200 µL için her 1000 embriyo kullanarak.
- 30 dk buz üzerinde hafifçe her 5 dk karıştırma için PI çözümde kuluçkaya hücrelere izin.
- Bir 40 µm naylon hücre süzgeç 50 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirin. Yavaşça karıştırın ve mesh filtrelemek için hücreleri pipet.
Not: Eğer embriyo aynı timepoint üzerinden birden çok tüpler protokol madde 3 te toplanmıştır, tüm birlikte sıralanır Bu embriyoların bu noktada birleştirmek. - Düz bir şırınga dalgıç sonu içinde kullanarak, yavaşça mesh sayfasında bulunan bir hücreler kalan herhangi bir kümeleri bozabilir.
- Hücreleri ile soğuk PBS-BSA 500 µL Filtresi için her 1000 embriyo ile yıkayın.
- 40-µm kafes 15 mL konik tüp buz üzerine getirin ve hücre süspansiyon 50 mL konik tüp ikinci kez 15 mL tüp içine filtre.
- Uygun bir hücre enstrüman sıralama kullanarak, lazer uyarma 561-nm ve emisyon algılama propidium iyodür algılamak için 610/20 için ayarlayın.
- Kısaca vortexing ve alet 4 ° C'de yer tarafından lekeli hücrelerinin Mix 15 mL tüp
- Hücreleri yavaş akış oranı, ideal 1.0 mL/temiz hücre döngüsü profil elde etmek ve G1 karıştırma önlemek üzere min, ya da nüfus G2/M hücreleri S ile faz çalıştırın.
- İlk olarak, FSC-A x SSC için kapı-bir (ileri dağılım alanı) yan dağılım alanına göre enkaz (şekil 1A) kaldırmak için.
Not: Embriyo hücreleri boyutları sahne ve hücre türüne bağlı olarak farklı. Nötr yoğunluk (ND) filtre 1.0 ve hücreleri mevcut büyüklüğüne bağlı olarak 1.5 arasında açık olması gerekir. En hücreleri toplamak ve enkaz kaldırmak için geniş bir alana kapı. - İkinci, kapı SSC-alan (SSC-A) PI-enkaz, hücre birini (şekil 1B) kaldırmak için alanı tarafından (PI-A), için.
- Üçüncü olarak, için kapı SSC-A SSC-kalan herhangi bir hücre birini (şekil 1 c) kaldırmak için W (genişlik) tarafından.
- Cep numarasını (sayısı) ile bir çubuk grafik üzerinde nüfus geçişli görüntü y ekseni ve propidium iyodür alanında x ekseni (PI-A). 24 hpf embriyolar için bu rakam 1 dolduğu gibi klişeleşmiş hücre döngüsü profil vermelidir.
- S faz nüfus şekilde, G1 ve G2 nüfusu en az bir miktarı G2 tepe sol tarafına G1 tepe sağ taraftan kapıyı ayarlarsınız. 24 hpf embriyolar için bu genellikle kapı nüfusunun yaklaşık % 10-15 kapsar (bkz. şekil 1 d).
- G1 nüfus şekilde, G1 en yüksek tepe üstünde değil geçmek için sol taraftaki geçidi ayarlarsınız. G1 kapıya kadar dar genişliğini ayarlayın (bkz. şekil 1 d).
- Kapı G1 ve S faz popülasyonlar uygun ilk gating (şekil 1E) emin olmak için geri.
- G1 ve S faz nüfus 3 mL ile 15 mL konik tüpler içine PBS-BSA sıralayın. Kesir (G1 ve S fazı) başına 500.000 ve 1 milyon veya daha fazla sıralanmış hücreleri arasında elde etmek için gereken hedefi.
- Sıralama tamamlandıktan sonra 1500 g x ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj tüpleri.
Not: Küçük hücreli Pelet görmek zor olacaktır ve bu engellemeden önlemek için bu yüzden tercihen bir sabit açılı rotor üzerinde sallanan bir kova rotor kullanmak önemlidir. - Dikkatle süpernatant kaldırmak ve Pelet 1 mL 1 x PBS ile resuspend. Hücreleri bir 1.5 mL microfuge tüp ve santrifüj 6.000 x g ve 4 ° C 5 min için transfer.
- Dikkatle tüm sıvı tüpünden çıkarın ve kuru Pelet-20 ° C'de dondurmak Pelet-20 ° C'de 2-3 hafta için saklayın.
5. DNA izolasyon, RNase bakım ve DNA arıtma
- -20 ° C ve buz üzerinde yer hücre Pelet kaldırın.
- Cips ve resuspend için SDS arabelleği (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, % 0.5 SDS) 400 µL ekleyin.
- İndinavir K 0.2 mg/mL nihai bir konsantrasyon ve vortexing tarafından kısa bir süre karıştırın.
- Örnekleri 56 ° c 2 h, girdap her 15dk için kuluçkaya.
- 2 h sonra fenol kloroform (fenol: kloroform: izoamil alkol 25:24:1, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA ile doymuş) 400 µL ekleyerek fenol kloroform ayıklama gerçekleştirmek.
- 16.000 x g aşamaları ayırmak 5 min için de 20 s ve santrifüj örnek için girdap.
- Üst sulu faz (400 µL) ve 1.5 mL tüp transferi dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Alkol yağış 40 µL 3 M sodyum asetat (pH 5.2), 2 µL glikojen ve 1 mL alkol ekleyerek gerçekleştirin.
- Girdap iyice karıştırın ve -20 ° DNA çökelti C gecede yerleştirmek için. Örnek ayrıca-80 ° C'de veya 1 h için kuru buzda çöktürülmüş.
- 4 ° C ve 16.000 x g Pelet DNA için 30 dk santrifüj örnek.
- Atma süpernatant ve yıkama Pelet 1 mL % 70 alkol. Santrifüj 4 ° C'de ve 16.000 x g 5 min için.
- 2-3 dakika için ortam sıcaklığında süpernatant ve air-dry Pelet atmak.
- Pelet 96 µL autoclaved su içinde dağıtılması ve 4 µL RNase A, (2 mg/mL) ekleyin.
- De vortexing tarafından mix ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Fenol kloroform ayıklama adımları 5.2.1 - 5.2.2 fenol kloroform ve aşağıdaki yordamı 100 µL ekleyerek gerçekleştirin.
- Alkol yağış ekleyerek 10 µL 3 M sodyum asetat, 1 µL glikojen ve alkol ve aşağıdaki yordamı adımla 5.3.1 - 5.3.5 250 µL yerine getirilir.
- Pelet TE arabellek (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH8.0)) 60 µL içinde resuspend ve kantitatif floresan tabanlı yöntemi kullanma DNA konsantrasyonu belirlemek. Mağaza DNA-20 ° C'de
Not: DNA DNA bağlama floresan-esaslı boyalar veya başka bir yöntemle UV Spektrometre tabanlı yöntemlerden daha güvenilir kullanarak ölçmek önemlidir.
6. DNA kütüphaneler ve sonraki nesil sıralamanın hazırlanması
Not: G1 kopya numarası örneği biyolojik her kaynak için (Yani WT, mutant, transgenik, hücre kültürünü, vb) her sıralama çalışması için gereklidir. Tüm S aşama örnekleri aynı G1 referansı çalıştırmak aynı sıralama aynı biyolojik kaynaktan karşılaştırın. Örnekler arasındaki tutarlılığı sağlamak için her örneğinin çalışma en az iki biyolojik çoğaltır.
- DNA 1 µg son hacmi 50 µL ve sonication için özel bir tüp aktarmak için sulandırmak.
- 250-300 BP üreticisinin teknik özellikleri ve iletişim kuralı göre odaklanmış bir ultrasonicator içinde bir hedef için genomik DNA kesme.
- Kalite ve üreticisinin teknik özellikleri ve iletişim kuralı göre bir otomatik Elektroforez makinasıyla yamultulmuş genomik DNA boyutunu doğrulayın. ~ 250-300 büyük bir zirve sağlamak bp yamultulmuş genomik DNA'ın.
- Bir DNA Kütüphane hazırlık seti ile çok katmanlı oligos sıralama Illumina platformda için kullanarak sıralama kitaplıkları üreticisinin protokole göre hazırlayın.
- Otomatik Elektroforez makinasıyla Kütüphane hazırlık kalitesini üreticisinin protokole göre doğrulayın. ~ 400-450 büyük bir zirve sağlamak bp, ve astar dimer (80-85 bp) ve bağdaştırıcı dimer en az tepeler vardır (~ 120 bp).
- Kitaplık üreticisinin protokolüne göre yeni nesil DNA sıralama için bir DNA Kütüphane miktar kit kullanarak ölçmek.
- 5 nM ve birleştirmek bir konsantrasyon kitaplığına seyreltik 15 µL multiplexed kitaplıkları benzersiz olarak istenilen elde etmek için gerektiği şekilde eşleme örnek başına sayıları oku.
Not: Örnek başına benzersiz olarak eşleme okuma sayısı çözünürlüğünü belirler. Zebra balığı genom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için kullanım 5 milyon eşlenen az okur. Bu 10-20 milyon okuma ile başlatmak için tavsiye edilir. - Eşleştirilmiş uç 100 bp tüm genomu DNA sıralama örneklerinin bir sonraki nesil sıralama, üreticinin talimatlarına göre platformunda.
7. sıralama veri analizi
Not: Bu bölümünde yer alan yönergeleri analiz için bir kılavuz olarak hazırlanmıştır. Ek yöntemleri, işleme, vb filtreleme sıralama hizalama için kullanın. Bu bölüm iletişim kuralının tercih edilen bu eser analiz yöntemi ele alacağız. Ek yöntemler kullandıysanız, bu amaçlar uyacak işlevleri ve parametrelerini ayarlamak. Aşağıdaki komutları Ubutnu veya Mac terminal, yüklü uygun paketleri ile girilir.
- Zebra balığı genom en son sürümlerini edinmek (danRer10, aynı derecede-in bu iletişim kuralı ne zaman yazılmıştır) aşağıdaki komutları kullanarak UCSC Genom tarayıcı:
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Aşağıdaki komutu ile fa.gz dosyasını açın:
gunzip danRer10.fa.gz - Genom BWA-mem aşağıdaki komutları kullanarak kullanarak sıralama verileri hizalama:
BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Aşağıdaki komutu ile fa.gz dosyasını açın:
- .Sam dosya .bam dosya samtools ile aşağıdaki komutu kullanarak dönüştürmek:
samtools -bS input.sam göster > output.bam- Samtools birlikte aşağıdaki komutu kullanarak hizalanmış sıralama dosyaları Sırala:
samtools sıralama output.bam > output_sorted.bam - Samtools birlikte aşağıdaki komutu kullanarak .bam dosyasını dizin:
samtools dizin output.bam
- Samtools birlikte aşağıdaki komutu kullanarak hizalanmış sıralama dosyaları Sırala:
- Mark PCR aşağıdaki komutları kullanarak Picard'la çoğaltır:
Java-Xmx2g-picard.jar MarkDuplicates kavanoz \
Input=input.bam
OUTPUT=OUTPUT.bam
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Aşağıdaki komutu kullanarak her kromozom için okuma metin (.txt) dosya oluştur:
Ben içinde {1,25}; Krom yapmak "chr" $i; = echo $CHROM; samtools input.bam $CHROM göster | -f 2,4,5,7,8,9 kesmek > readsChr$ {i} .txt; bitmiş
Not: Bayrak, sütunlar elde edilen .txt dosyası konumu, mapQ, çifti chr, çifti yer ve parça boyutu, anılan sıraya göre. - Matlab (veya herhangi bir diğer benzer bilgisayar yazılımı) textscan işlevini kullanarak .txt dosyaları okur.
- Düşük eşleme kalite okur 30 mapQ eşik ayarlayarak filtre uygulamak.
- Okuma bayrakları ile değil birincil hizalama, PCR çoğaltmaları veya farklı bir kromozom çifti eşleme için kaldırın.
- Herhangi bir okuma 2000 bp bir mesafe eşiğin ötesinde onların çifti ile filtre.
- İstatistikler elde edilen okuma okuma istatistikleri, kapsamı, INSERT boyutu ve kalitesi (Şekil 2) sayısını belirlemek için değerlendirin.
- Okuma kapsamı içinde 100 bp sabit pencere eşiği her örnek için her kromozom uzunluğu boyunca 100 bp aralıklarla okuma sayısı sayarak belirler.
- Ortanca okuma sayısı tüm windows için hesaplayın.
- Yüksek kapsama bölgelerinde medyan windows 5 standart sapmalar büyük kaldırarak filtre.
- Analiz için bölgeleri G1 başvuru örnekleri sürgülü windows kullanarak 200 okuma ile segmentleri her kromozom boyunca bularak tanımlayın.
- Her S faz örnek Okuma derinlemesine S faz okuma sayısı eşlik eden G1 başvuru için tanımlanan 200-Okunma Sayısı Windows sayarak belirler.
- Yazılım, bir ilişkilendirme faktörü (p), 10-16ile csaps işlevini kullanarak ham veri düz.
- Z-skor 0 ortalaması ve standart sapması 1 ile düzgünleştirilmiş verileri normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yayımlanan çoğaltma zamanlama verilerini kullanarak, temsilci çoğaltma zamanlaması profilleri ve kalite kontrol tedbirleri15temin edilmektedir. İlk adımlar işleme hizalayarak genom, okuma uzunluğu ve genom kapsamı istatistikleri hesaplama ve unpaired, düşük kaliteli, filtreleme ve PCR yinelenen okuma için sıralama veri içerir. Okuma istatistikleri için tipik Zebra balığı sıralama örnek Şekil 2' de gösterilir. Süzme sonra sayıları değişken boyutlu windows ve veri belirlenir okuma düzeltti ve normalleştirilmiş. Tipik düzeltti/normalleştirilmiş çoğaltma zamanlaması profilleri temsilcisi Zebra balığı kromozom biyolojik çoğaltır için şekil 3Aiçinde gösterilir. Biyolojik ve deneysel çoğaltır profilleri görsel olarak çok benzer (bakınız şekil 3A) olmalı ve ayrıca yüksek korelasyon kromozom (şekil 3B) uzunluğu boyunca görüntüler. Ayrıca zamanlama değerleri genom genelinde (şekil 3 c) arasında yüksek korelasyon göstermek gerekir. Otokorelasyon, desen süreklilik, değerlendirmek için bir yöntem veri kümesi (şekil 3D) yapısında derecesini değerlendirmek için kullanılmalıdır. Otokorelasyon yapılandırılmış olgun zamanlama programları için kısa mesafelerde yüksek olmalı ve mesafe arttıkça yavaş yavaş azaltmak. Biyolojik ve deneysel arasında yüksek tekrarlanabilirlik göstermek örnekleri çoğaltır ve güçlü otokorelasyon sinyal yüksek kaliteli örnekleri düşünülmesi gereken ve daha yüksek bir kapsama örnek almak için kombine edilebilir.
Şekil 1: Zebra balığı embriyo çoğaltma zamanlaması analiz için sıralama. (A)tüm hücreler için ileri dağılım alanı göre nüfusu geçişli yan dağılım alanına göre (FSC-A) (SSC-A). Renkleri nokta arsa kutulara yoğunluğu ile kırmızı-için-yeşil-için-mavi değişen renkleri temsil yüksek düşük yoğunluk gösterir. (B) nüfus için sıralanmış geçişli FSC x SSC hücrelerinin Gated SSC-A propidium iyodür alanına göre (PI-A). (C) x PI Geçitli hücreler için sıralanmış SSC nüfusu Gated SSC-A yan dağılım genişliği (SSC-W) tarafından. (D) Histogram tüm geçişli nüfusun klişeleşmiş hücre döngüsü Profil görüntüleniyor. İçin gölgeli gri tarafından G1 ve S faz hücrelerinde görüntülendikleri sıralama gates ile siyah çizgiler kutulu. (E) Backgated G1 ve S faz popülasyonlar ilk geçişi hücreleri çoğunluğu ele göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sıralama okumak tipik Zebra balığı örnek istatistiklerini. (A)Reap istatistiklerinden kalitesini mapQ değerleri eşleme. (B) çubuk grafik ekleme boyutları dağıtım tüm sıralama okur. Toplam eşlenen okuma, okuma istatistiklerini okur düşük kaliteli bayrak, içeren (C) okur için farklı bir kromozom eşleme çiftleri ile (çift diff chr), mesafe eşik (uzak çift) ve PCR çoğaltmaları ötesinde çiftiyle okur. (D) temsil eden sayıları toplam, eşlenmeyen ve unpaired okuma, kapsamı, eşlenen ve çözünürlük Zebra balığı örneği bir tipik sıralama için okuyun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi Zebra balığı çoğaltma zamanlaması sonuçları ve kalite kontrol önlemleri. (A)çoğaltma bir temsilcisi uzunluğu boyunca kromozom 28 hpf embriyo (Siefert, 2017) iki biyolojik çoğaltır için zamanlama. (B) korelasyon arasında çoğaltma zamanlama değerleri 2 Mb Windows biyolojik için temsil edici bir kromozom uzunluğu boyunca 28 hpf embriyo şekil 3Aiçinde gösterilen çoğaltır. (C) genom çapında çoğaltma zamanlama değerleri için biyolojik (rep1 ve rep2) ve deneysel (rep3) çoğaltır 28 hpf embriyolar arasında korelasyon. Renk eşlemi Pearson korelasyon katsayısı temsil eder. (D) otokorelasyon yapılandırılmış olgun zamanlama programı için yavaş yavaş giderek daha uzun mesafelerde azalır yakın mesafelerde yüksek otokorelasyon görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı DNA çoğaltma zamanlaması eğitim için yeni ve benzersiz vivo içinde modeli sistemi sağlar. Ne zaman zamanlanmış matings olarak yapılmaktadır bu deneysel protokol için ayrıntılı, embriyo binlerce deneyler için tek bir gün içinde toplanabilir. Bu embriyoların zaman uyumlu olarak tam zamanlı ve net olarak karakterize aşamalarında gelişme geliştirmek. Zebra balığı kolayca ve doğru bir şekilde Zebra balığı embriyo dışarıdan geliştirmek ve optik net gibi bir stereomicroscope kullanarak Morfoloji tarafından sahnelenen. Bu iletişim kuralı çoğaltma zamanlaması omurgalı geliştirme boyunca çalışmaya Zebra balığı embriyo kullanımı ayrıntıları.
Alanlarda sorunları takdim Protokolü'nün Zebra balığı embriyolar, hazırlık, FACS sıralama ve Kütüphane hazırlık sırasında hücrelerinin kaybı zaman uyumlu gelişimi sağlanması içerir. Zebra balığı geliştirme zamanlaması bağımlı, bu nedenle kullanımı Zebra balığı ışık/karanlık döngüleri için uyarlanmış ve deneyler için 28.5 ° C'de muhafaza sıcaklığıdır. Zaman uyumlu geliştirme sağlamak için tam zamanlı matings gerçekleştirmek ve toplamak çok küçük zaman-windows embriyo (10 dakika veya daha az). Embriyo 28.5 ° C'de korumak ve ortam sıcaklığında en az zaman harcamak emin olmak çok önemlidir. Zebra balığı geliştirme zamanlaması da son derece belirli bir alanda embriyo yoğunluğu bağlıdır. 10 cm tabak başına 100 embriyolar daha yüksek bir yoğunluk, değil ev embriyolar için önemlidir, ya da onlar düzgün gelişecektir değil. 4-16 hücre Sahne Alanı'na hayli ilerlemiştir ve kolayca döllenmiş (kullanım "Aşamaları, embriyonik geliştirme, Zebra balığı"17 bir rehber olarak) olarak tanımlanan ölü ve döllenmemiş embriyo kaldırmak için en iyi zamanıdır. Ölü embriyolar genellikle siyah topları ve döllenmemiş embriyo 1-hücre görünür. Ortam sıcaklığında süreyi azaltmak için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çalışır.
Ne zaman dechorionating embriyo, tüm chorions embriyo kaldırılır emin olmak önemlidir. Çoğu chorions gelmiş kadar embriyo pronase çözümde tutun. Chorions sağlam ile kalan herhangi bir embriyo atın veya onların chorions Forseps ile kaldırın. Yavaş ve yumuşak hareket kullanan embriyo pipet. Hücreleri aşırı stres ve hücre kaybı sonucu tabi gibi hızla pipet değil. Bu hücreler kırılma sonuçları artan kesme stres neden olabilir gibi bir P200 kullanmak önemlidir. Bunun tersi olarak, bir plastik transfer pipet bir küçük yeterince delik veya yeterince sarısı çuval bozabilir ve hücreleri disaggregate için yeterince kesme stres sağlamak olabilir. Alternatif Pipetler delik sağlanan kullanılabilir ve yamultma için en uygun P1000 eşdeğer olacaktır.
Zaman 28 sıralama FACS profil klişeleşmiş bir hücre döngüsü Eğer hpf değil elde edilir, PI lazer üzerinde gerilim G1 zirve yaklaşık 50 K ortalanacak şekilde ayarlayın. FSC ve SSC için Kazançlar da geçişi ve hücre popülasyonları şekil 1' e benzer görünür şekilde ayarlanması gerekebilir. Eğer hala zorluk, ND filtre açık olması ve hücreleri çoğunluğu sağlamak için ayarlanabilir FSC ve SSC gerilim içinde kapısı vardır. Boyama PI olsun, olarak orada çiftler PI-a için tahmini olarak gösteren bir dizi olacak açık olmalı Histogram iki açık tepeler, 2N DNA G1 hücreleri için büyük bir zirve ve çift yoğunluğu daha küçük bir zirve için 4N DNA G2/M hücreleri içerik göstermelidir. Bu'hala elde değil de sağlam hücreleri, PI boyama ile ilgili sorunlar veya fiksasyon ile ilgili sorunlar az sayıda olabilir ve protokol buna göre optimize edilmiş olması gerekir.
Erken embriyo hücreleri (10 önce hpf) bu hücreler yüksek bir yüzdesi gibi S aşamasında tipik hücre döngüsü profilleri, vermek istemiyorum. Bu örnekler S aşama örnekleri kabul ve G1 referansı 24 hpf embriyo karşılaştırıldığında. Embriyo 10 arası hpf ve 24 hpf ara hücre döngüsü profilleri verebilir ve istenirse sıralanabilir. S-faz nüfus da tespit ve fiksasyon önce kısa darbeleri timidin analogları EDU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) veya BrdU (Bromodeoxyuridine) gibi dahil ederek sıralanır, ancak, bu doğru bir şekilde belirlenmesi için gerekli değildir Çoğaltma zamanlaması.
İdeal kitaplık hazırlık ile DNA'ın 1 µg başlatılmalıdır. Teorik olarak ~ 300.000 sıralanmış hücreleri DNA'ın yaklaşık 1 µg (~3.3 pg/çekirdek tahmin ediliyor) verim, ancak, her zaman kaybı protokol boyunca. 500.000 ila 1 milyon sıralanmış hücreleri DNA'ın 1'den fazla µg vermelidir. Tipik bir 24 hpf embriyo yaklaşık 18.000 hücreleri olan 10-%15 S-aşamasında olacak, olacak. Embriyoların gelişim önceki aşamasında önemli ölçüde daha az hücre olacak ama S-faz hücrelerinde daha yüksek oranlarda olacaktır.
Doğru arıtma ve Boyut seçimi manyetik boncuklar kullanılarak performans kitaplığı hazırlık istenmeyen unsurların ortadan kaldırmak için önemlidir. Üreticinin yönergeleri dikkatle izleyin ve ek optimizasyon gerekli olabilir. PCR dimer az miktarda genellikle büyük bir sorun değil, ama onlar indirilmelidir böylece bağdaştırıcısı dimer çok verimli sıra. Bu DNA oranı ilk bağdaştırıcıya ayarlamak ve doğru boyutu seçme Kütüphane hazırlık sırasında performans elde edilebilir.
Tek taraflı kenar sıralama aynı zamanda farklı deneysel ihtiyaçları için uygun olabilir. Tek taraflı kenar ucuzdur ve okuma güveniyor bu yaklaşım kullanır beri gerekli bilgilerin çoğunu sağlar; eşleştirilmiş uç PCR ve optik Yinelenenleri kaldırmak için ve tekrarlayan dizileri ve diğer yapısal çeşitleri (Zebra balığı genom ortak olan) alanlarda gidermek için daha yüksek bir yeteneği sağlar. Aşağıdaki analizi bölümü yalnızca eşleştirilmiş uç sıralama okuma ile ilgileneceğiz. Daha kısa sıralama okur da uygun olabilir. Bu okuma daha düşük maliyetle daha yüksek bir sayıda sağlayacaktır ancak okuma eşleştirmek daha zor olabilir. Aşağıdaki analizi bölümü 100 bp okuma için optimize edilmiştir ve ayarlamalar kısa okuma uzunluğu kullanılması durumunda gerekli olabilir.
Bu iletişim kuralı da kolayca Zebra balığı modeli ek anlamları için adapte edilebilir. Zaten kullanılan Zebra balığı yeri fibroblastlar (ZTF hücreleri) analiz için bir birincil hücre kültür yetişkin Zebra balığı yeri izole hattı. Zebra balığı türlerinden izole hücre çalışmaya, transgenik işaretleyicileri tanımlamak ve boyama ve DNA içeriği için sıralama önce tek tek hücre tipleri yalıtmak için kullanılabilir. Bir potansiyel strateji floresan bir işaretleyici doku özel Organizatör tarafından ve ilk tahrik ifade bir transgenik satırını kullanmak için sıralama, fiksasyon takip ve DNA içeriği için sıralama FACS tarafından hücreleri izole olacaktır. Ayrıca, hücre geçirgen DNA boya kullanımı için tek tek hücre tipleri hem de G1 ve S faz popülasyonlar eşzamanlı yalıtım izin verebilir. Bu iletişim kuralı için bu uyarlamalar Ayrıca çoğaltma zamanlaması çalışmalar diğer in vivo modellerinde sağlayabilirsiniz.
Bu protokol ileride kullanmak için heyecan verici bir olasılık çoğaltma zamanlaması hastalığında rolü incelemektir. Zebra balığı, bazı spontan ve diğer indüklenebilir, değişiklikleri çoğaltma zamanlaması oncogenesis sırasında olduğunda belirlemek için kullanılan çeşitli kanser modelleri vardır. Bu değerlendirme rolü çoğaltma zamanlaması tumorigenesis ve hastalığın ilerlemesinde çalış sağlayacaktır. Ayrıca, Zebra balığı uyuşturucu tarama için mükemmel bir model ve çoğaltma zamanlaması yönetmelik, etkileyen ilaçlar kanser tedavisinde kullanımı için potansiyele sahip tanımlamak için kullanılabilir.
Zebra balığı çoğaltma zamanlaması çalışmaya gelecek vaat eden bir yeni modeldir. Bu iletişim kuralı diğerleri çoğaltma zamanlaması geliştirme ve hastalık rolü eğitim bu modeli kullanmak için fırsat gerçekleştirecek. Bu iletişim kuralı Drosophila melanogaster ve Xenopus laevisve bakmak ileri gelecek için bulgu--dan bunlar ve diğer organizmalar gibi diğer vivo içinde gelişimsel model sistemleri ile kullanmak için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser tarafından desteklenen Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler Ulusal Sağlık Enstitüleri ile 5P20GM103636-02 (dahil Akış Sitometresi çekirdek desteği) ve 1R01GM121703 verir, hem de erişkin kök hücre için Oklahoma Merkezi'nden Ödülleri Araştırma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
