Summary
Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.
Abstract
DNA replicatie timing is een belangrijke cellulaire kenmerk, vertonen belangrijke relaties waarbij de structuur van de chromatine, transcriptie en DNA mutatie tarieven. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden tijdens de ontwikkeling en in Kreeft, maar de timing van de replicatie rol speelt bij ontwikkeling en ziekte is niet bekend. Zebravis werden onlangs opgericht als een in vivo modelsysteem te bestuderen van de timing van de replicatie. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van de zebravis om DNA replicatie timing. Na het sorteren van cellen van embryo's en volwassen zebrafish, kunnen high-resolution genoom-brede DNA replicatie timing patronen worden geconstrueerd door het bepalen van de veranderingen in DNA exemplaaraantal door middel van analyse van de volgende generatie sequencing gegevens. De zebravis modelsysteem zorgt voor evaluatie van de timing replicatiewijzigingen die optreden in vivo in de gehele ontwikkeling, en kan ook worden gebruikt voor het beoordelen van wijzigingen in afzonderlijke celtypes, ziekte modellen of mutant lijnen. Deze methoden bestudering, onderzoek naar de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en onderhoud tijdens de ontwikkeling mogelijk maken, de timing van de replicatie rol speelt in de mutaties en tumorigenesis, en de gevolgen van de storing veroorzaakt de timing van de replicatie op ontwikkeling en ziekte.
Introduction
Voor cellen te verdelen met succes, moeten ze eerst nauwkeurig en getrouw repliceren hun gehele genoom. Genoom dubbel treedt op in een reproduceerbare patroon, bekend als de DNA replicatie timing programma1. DNA replicatie timing is gecorreleerd met de organisatie van de chromatine, epigenetische merken en gene expression2,3. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden in de gehele ontwikkeling, en zijn aanzienlijk aan transcriptionele gerelateerde programma's en aanpassingen aan de chromatine merken en organisatie4,5. Bovendien, replicatie timing is gecorreleerd met vogelgriepvirus frequenties en veranderingen in de timing zijn waargenomen bij verschillende soorten kanker6,7,8. Ondanks deze opmerkingen, de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en verordening zijn nog grotendeels onbekend, en de rol die het speelt bij ontwikkeling en ziekte is onbepaald. Bovendien, tot onlangs de genoom-brede replicatie had timing van de veranderingen die zich in de gehele gewervelde ontwikkeling voordoen alleen onderzocht in cel cultuur modellen.
Zebravis, Danio rerio, zijn zeer geschikt voor het studeren replicatie timing in vivo tijdens de ontwikkeling, zoals een enkele paring paar kan opleveren van honderden embryo's die ontwikkelen snel met veel gelijkenissen met zoogdieren ontwikkeling9, 10. Verder zijn er in de gehele ontwikkeling van de zebravis, wijzigingen in de celcyclus, chromatine organisatie en transcriptionele's die relaties met DNA replicatie timing11delen. Zebravis zijn ook een uitstekende genetische model, zoals ze zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door Transgenese, mutagenese en gerichte mutaties en genetische schermen hebben vele genen nodig zijn voor de ontwikkeling van de gewervelde12geïdentificeerd. Zebrafish kan daarom worden gebruikt om genen die betrokken zijn bij replicatie timing totstandbrenging en het beheer te identificeren en te observeren van de gevolgen van de deregulering van de replicatie timing op gewervelde ontwikkeling. Transgene lijnen kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de timing van de replicatie van afzonderlijke celtypes geïsoleerd op verschillende ontwikkelings timepoints of bij ziekte. Nog belangrijker is, zijn er verschillende zebrafish modellen van ziekten bij de mens die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van replicatie timing in ziekte vorming en progressie9,13,14.
Onlangs, waren de eerste replicatie timing profielen gegenereerd op basis van zebravis, tot vaststelling van het als een modelsysteem om te studeren van replicatie in vivo15timing. Om dit te bereiken, werden cellen verzameld uit zebrafish embryo's in meerdere stadia van ontwikkeling en in een celtype van volwassen zebrafish geïsoleerd. Cellen werden vervolgens gesorteerd FACS (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren) op basis van DNA-inhoud te isoleren van de G1 en S fase populaties. Kopiëren met behulp van de G1 voorbeeld als een numeriek besturingselement kopiëren, aantal variaties in de S-fase populaties werden bepaald en gebruikt voor het afleiden van de replicatie van de relatieve timing16. Veranderingen in de timing van de replicatie kunnen vervolgens direct worden vergeleken tussen verschillende ontwikkelings monsters en celtypes en dit werd gebruikt om te bepalen van de veranderingen in de timing van de replicatie die in vivo in gewervelde ontwikkeling optreden. Deze methode biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genomische methoden, vooral dat het niet nodig labelen met thymidine analogen of immunoprecipitation van DNA4,6.
Hier is de protocollen profiel genoom-brede DNA replicatie timing op gedetailleerde hoge resolutie in zebrafish. Deze protocollen zijn gebruikt om de relaties met de genomische en epigenetische functies in het genoom van de zebravis, evenals profilering van veranderingen in deze relaties die zich in de gehele ontwikkeling voordoen bepalen. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aangepast om te bestuderen van de veranderingen in de timing van de replicatie in gemuteerde stammen van zebravis en ziekte modellen. Bovendien bevatten deze methoden een stichting die kan worden uitgebreid om te bestuderen replicatie timing in specifieke celtypen, door de eerste sortering uit de individuele celtypes van de zebravis. De zebravis kan dienen als een uitstekende in-vivo modelsysteem te bestuderen van replicatie timing en uiteindelijk het onthullen van de biologische functies van deze belangrijke epigenetische trek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren waren behandeld in strikte overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Oklahoma medische onderzoek Stichting institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. het opzetten van volwassen zebrafish voor de fokkerij
- Gebruik een grote cohort van volwassen mannelijke en vrouwelijke zebrafish van een single strain voor de fokkerij. Er zijn kleine verschillen in de genetische samenstelling van zebravis van zelfs een single strain, gebruik van een grote cohort om resultaten zijn representatief voor de genetische variabiliteit van de bevolking en niet beperkt tot een kleine ondergroep van de bevolking.
- De nacht voordat embryo's worden verzameld, plaats tientallen fokken volwassenen in het fokken van tanks, gebruik maken van ongeveer gelijke nummers van mannetjes en vrouwtjes. Afhankelijk van het experiment, gebruikt u een van de volgende strategieën voor de fok.
- Fokken van strategie 1: plaats een paar mannelijke en vrouwelijke zebrafish in individuele fokken tanks, de mannetjes gescheiden van de vrouwtjes met een divider. Als deze benadering wordt gebruikt, setup veel verschillende fokken tanks en bundelen van de embryo's uit elk om ervoor te zorgen dat de biologische variabiliteit is representatief voor de bevolking.
- Fokken van strategie 2: combineren van tientallen mannelijke en vrouwelijke zebrafish in een grote fokken tank. Pas deze strategie toe, zolang er een voldoende groot aantal embryo's, het is redelijk te veronderstellen zij kwam uit een verscheidenheid van oprichters en zijn daarom genetisch representatief zijn voor de bevolking.
2. getimede verparingen - inzameling, sortering en huisvesting zebrafish embryo's voor experimenten
- Uitvoeren van getimede verparingen, begint zodra het licht cycli in de ochtend. Gooi embryo's 's nachts gegenereerd.
- Toestaan vis te kweken in ondiep water (3-5 cm) gedurende een periode van 10 minuten, met een valse bodem voor embryo's door kan ontsnappen.
- Na 10 min, verzamelen van embryo's door door een zeef gieten en in een 10-cm plaat met een fles van wassen spoelen. Zwembad alle embryo's verzameld op het zelfde tijdstip, markeren ze met moment van collectie en plaats onmiddellijk in een incubator bij 28,5 ° C.
- Honderden van embryo's kunnen worden verwacht van een enkele paring pair in een dag. Meerderjarigen tot broeden in 10 min cycli totdat het aantal embryo's verkregen minder dan twintig is.
- Ongeveer 1-1,5 h na het verzamelen, sorteren embryo's te verwijderen dode en onbevruchte embryo's. Als u wilt sorteren van embryo's, verwijder uit incubator en observeren onder een Microscoop ontleden.
- Tellen van embryo's en plaatsen bij een dichtheid van 100 embryo's per 10 cm plaat.
- Voeg verse E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) en embryo's terug te keren naar de 28,5 ° C incubator.
3. Dechorionate, deyolk, en op te lossen zebrafish embryo 's
Opmerking: Deze sectie van het protocol is ontworpen voor embryo's vóór 48u post bevruchting (hpf). Er is geen behoefte om te verwijderen van de chorions van embryo's in latere stadia van ontwikkeling (na 48 hpf), zoals ze vaak natuurlijk afvallen. Er is geen behoefte aan deyolk of het verwijderen van de chorions van vis oudere post de 5 dagen bevruchting (dpf).
- Wanneer embryo's gewenste developmental leeftijd hebben bereikt, controleert u of fasen van ontwikkeling morfologisch onder een lichte Microscoop volgens "Stadia van embryonale ontwikkeling van de zebravis"17.
- Tot 1500 geënsceneerde embryo's overbrengen in een conische buis 15 mL en meerdere malen wassen met E3.
- Voeg 1 mL E3 en 20 µL van Pronase-oplossing (30 mg/mL) voor elke 100 embryo's en zachtjes wervelen. Maximaal 1500 embryo's kunnen worden dechorionated in een enkele buis met 15 mL E3.
- Buis op zijn kant leggen en embryo's in een gelijkmatige laag om ervoor te zorgen maximale oppervlakte volumeverhouding te regelen. Zachtjes doorroeren buis elke 2-3 min tot alle chorions gedaald off van de embryo's. De totale dechorionation tijd zal variëren afhankelijk van de Pronase-activiteit.
- Bovendrijvende vloeistof verwijderen en voorzichtig spoelen embryo's 3 keer met 10 mL van E3. Plaats de embryo's op het ijs voor de rest van deze sectie van het protocol.
- Verwijderen van E3 en wassen van embryo's met vers bereide ijskoude deyolking buffer (0,5 x Ginzburg vis Ringer's oplossing, zonder calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1.25 mM NaHCO3).
- Voeg 1 mL ijskoud deyolking buffer voor maximaal 500 embryo's.
- Met behulp van een P1000, zachtjes Pipetteer embryo's op en neer 5 - 10 keer te verstoren dooier zak.
- 1 mL overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis en centrifugeer bij 4 ° C en 500 x g gedurende 5 min.
- Bezinken en wassen pellet met 1 mL ijskoud 1 x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,0) te verwijderen van Ringer's oplossing verwijderen. Centrifugeer bij 4 ° C en 500 x g gedurende 5 minuten.
- Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL 1 x PBS. Plaats de buis op ijs.
- Voeg 3 mL ijskoud ethanol (EtOH) tot een conische buis 15 mL. Vortex buis van EtOH zachtjes op laag instelling.
- Met behulp van een P1000, langzaam (1 druppel per seconde) druppelen zebrafish embryo celsuspensie in EtOH terwijl vortexing zachtjes.
- Voeg een totaal van 1 mL van de celsuspensie embryo, voor de oplossing van een definitieve vastlegging van 75% EtOH.
- Na 1 mL van cel is schorsing toegevoegd, voorzichtig swirl buis te mengen en plaats bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur. Het is aanbevolen om het plaatsen van de buizen aan hun kant te zorgen voor maximale oppervlakte volumeverhouding en verminderen van het aantal embryo's en cellen die plakken aan elkaar. Opgeslagen embryo cellen bij-20 ° C gedurende 2-3 weken.
4. vlekken van DNA en FACS embryo's sorteren
Opmerking: Deze sectie van het protocol is ontworpen voor embryo's in 1 dpf.
- EtOH-vaste embryo cellen verwijderen van-20 ° C en centrifugeer bij 4 ° C 1500 x g gedurende 5 min.
- Plaats de buis op ijs en zorgvuldig verwijderen supernatant. Met behulp van een P1000, zachtjes resuspendeer de cellen in 1 mL vers bereide koude PBS-BSA (1 x PBS, 1% bovien serumalbumine).
- Centrifugeer cellen bij 4 ° C en 1500 x g gedurende 5 minuten en plaats op ijs.
- Verwijderen supernatant en resuspendeer cellen in propidium jodide (PI) kleurstofoplossing (50 µg Mo/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), met behulp van 200 µL voor elke 1000 embryo's.
- Toestaan dat cellen te broeden in PI oplossing voor 30 min op ijs, voorzichtig mengen elke 5 min.
- Plaats een 40 µm nylon cel zeef op een 50 mL conische buis op ijs. Zachtjes Pipetteer cellen meng en filtreer door de Maas.
Opmerking: Als er meerdere buizen van embryo's uit de dezelfde timepoint werden verzameld in sectie 3 van het protocol, combineren deze embryo's op dit punt zodat ze samen worden gesorteerd. - Met behulp van de flat binnen einde van de zuiger van een injectiespuit, zachtjes verstoren alle resterende bosjes van cellen op de Maas.
- Spoel de cellen via het filter met 500 µL van koude PBS-BSA voor elke 1000 embryo's.
- Plaatst u een 40-µm net boven een 15 mL conische buis op ijs en filtreer de celsuspensie uit de conische buis van 50 mL een tweede keer in de buis 15 mL.
- Met behulp van een gewenste cel Sorteren instrument, stel de excitatie van de laser op 561-nm en emissie detectie tot 610/20 te detecteren propidium jodide.
- Mix 15 mL tube gekleurde cellen kort door vortexing en plaats in het instrument bij 4 ° C.
- De stem van de cellen op een langzame stroming, ideaal 1,0 mL/min, het verkrijgen van een schone celcyclus profiel en vermijden mengen G1 of G2/M cellen met de S fase bevolking uitvoeren.
- Eerst, poort voor FSC-A x SSC-een (forward scatter gebied door kant scatter gebied) te verwijderen van puin (figuur 1A).
Opmerking: Cellen van de embryo's kunnen worden verschillende maten, afhankelijk van het stadium en cel type. Filter met neutrale dichtheid (ND) wellicht worden geschakeld tussen 1.0 en 1.5 afhankelijk van de grootte van cellen aanwezig. Poort een groot gebied voor het verzamelen van de meeste cellen en het verwijderen van puin. - Tweede, poort voor SSC-gebied (WS-A) door PI-gebied (PI-A), verwijderen van puin en cel paren (figuur 1B).
- Ten derde poort voor SSC-A door SSC-W (breedte) te verwijderen van alle resterende cel paren (Figuur 1 c).
- Weergeven van de gated populaties in een histogram met celaantal (graaf) op de y-as en propidium jodide-gebied (PI-A) op de x-as. Voor 24 hpf embryo's moeten hierdoor een stereotiepe celcyclus profiel zoals in Figuur 1 d.
- Wilt sorteren de S fase bevolking, stelt u de poort vanaf de rechterkant van de G1 piek aan de linkerzijde van de G2 piek, met inbegrip van slechts een minimale hoeveelheid van de G1 en G2 populaties. Voor 24 hpf embryo's, zal dit meestal ongeveer 10-15% van de gated bevolking omvatten (Zie Figuur 1 d).
- Wilt sorteren de G1 bevolking, stelt u de poort aan de linkerkant van de piek van de G1, niet door te geven van de top van de piek. De breedte van de G1 poort zo smal mogelijk aanpassen (Zie Figuur 1 d).
- Een back-poort de G1 en S fase populaties om goede eerste gating (figuur 1E).
- Sorteren van de G1 en S fase populaties in 15 mL conische buisjes met 3 mL PBS-BSA. Het doel moet zijn om te verkrijgen tussen de 500.000 en 1 miljoen of meer gesorteerde cellen per fractie (G1 en S-fase).
- Nadat het sorteren is voltooid, centrifuge buizen op 1500 x g en 4 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: De pellet kleincellige moeilijk zal zijn om te zien en het is belangrijk om niet te verstoren het, dus gebruik bij voorkeur een swingende emmer rotor over een vaste hoek rotor. - Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL 1 x PBS. Cellen overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis en centrifugeer bij 6.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min.
- Verwijder voorzichtig alle vloeistof uit buis en het bevriezen van droge pellet bij-20 ° C. Bewaar de pellet bij-20 ° C gedurende 2-3 weken.
5. DNA isolatie, RNase behandeling en zuivering van DNA
- Verwijder cel pellet van-20 ° C en plaats op het ijs.
- Voeg 400 µL van SDS buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) pellet en resuspendeer.
- Proteïnase K toevoegen om een eindconcentratie van 0,2 mg/mL en meng door vortexing kort.
- Incubeer monsters bij 56 ° C gedurende 2 uur, vortex elke 15 min.
- Voer na 2U, fenol-chloroform extractie door 400 µL van fenol-chloroform (fenol: Chloroform: Isoamylalcohol 25:24:1, verzadigd met 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) toe te voegen.
- Vortex voor 20 s en centrifuge monster bij 16.000 x g gedurende 5 min om de fasen te scheiden.
- Verwijder voorzichtig de bovenste waterfase (400 µL) en overdracht aan een 1,5 mL-buis.
- Uitvoeren EtOH neerslag door 40 µL van 3M Natriumacetaat (pH 5.2), 2 µL van glycogeen, en 1 mL EtOH toe te voegen.
- Vortex meng en plaats bij-20 ° C's nachts te precipiteren DNA. Monster kan ook worden neergeslagen bij-80 ° C of op droog ijs gedurende 1 uur.
- Centrifuge monster bij 4 ° C en 16.000 x g gedurende 30 minuten aan pellet DNA.
- Discard supernatant en wassen pellet met 1 mL 70% EtOH. Centrifugeer bij 4 ° C en 16.000 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi supernatant en aan pellet bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
- Los van de pellet in 96 µL van gesteriliseerde met autoclaaf water, en voeg 4 µL van RNase A (2 mg/mL).
- Meng goed door vortexing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Fenol-chloroform extractie door toevoeging van 100 µL van fenol-chloroform en volgende procedure in stappen 5.2.1 - 5.2.2 uitvoeren
- Uitvoeren EtOH neerslag toevoegen 10 µL van 3M Natriumacetaat, 1 µL glycogeen en 250 µL van EtOH en na de procedure in stappen 5.3.1 - 5.3.5.
- Resuspendeer de pellet in 60 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) en DNA-concentratie met behulp van een kwantitatieve fluorescentie gebaseerde methode te bepalen. Winkel DNA bij-20 ° C.
Opmerking: Het is belangrijk te kwantificeren van DNA met behulp van DNA-bindende fluorescentie gebaseerde kleurstoffen of anderszins betrouwbaarder dan UV spectrometer gebaseerde methoden.
6. bereiding van DNA bibliotheken en de volgende generatie sequencing
Opmerking: Een G1 kopie nummer referentiemonster voor elk biologische bron is vereist voor elke sequencing run (d.w.z. WT, mutant, transgene, cellijn, etc). Vergelijk alle S fase monsters uit dezelfde biologische bron in de dezelfde volgorde uitvoeren op de dezelfde G1-objectverwijzing. Voer ten minste twee biologische replicatieonderzoeken van elk monster te zorgen voor samenhang tussen de monsters.
- Verdunnen 1 µg van DNA tot een eindvolume van 50 µL en transfer naar een gespecialiseerde buis voor ultrasoonapparaat.
- Schuintrekken genomic DNA voor een doel van 250-300 bp in een gerichte ultrasonicator, volgens de specificaties en het protocol van de fabrikant.
- Controleer of de kwaliteit en grootte van sheared genomic DNA met behulp van een geautomatiseerde elektroforese machine, volgens de specificaties en het protocol van de fabrikant. Zorgen er is een grote piek van ~ 250-300 bp voor de sheared genomic DNA.
- Bereiden sequencing bibliotheken met behulp van een DNA kit voor de voorbereiding van de bibliotheek met multiplex oligos voor het rangschikken op Illumina platform, volgens protocol van de fabrikant.
- Controleer of kwaliteit van bibliotheek prep met behulp van geautomatiseerde elektroforese machine, volgens protocol van de fabrikant. Zorgen er is een grote piek van ~ 400-450 bp, en er zijn minimale pieken voor inleidingsdimeer (80-85 bp) en adapter Dimeren (~ 120 bp).
- Kwantificeren van bibliotheken die een DNA kit voor de kwantificering van de bibliotheek gebruiken voor de volgende generatie DNA sequencing, volgens protocol van de fabrikant.
- Verdunde 15 µL van bibliotheek tot een concentratie van 5 nM en combineren multiplexed bibliotheken nodig om gewenste unieke toewijzing lezen tellingen per monster.
Opmerking: Het aantal unieke toewijzing leest per monster bepalend zijn voor de resolutie. Gebruik zo weinig als 5 miljoen toegewezen leest te beoordelen van replicatie timing voor de zebravis genoom. Het is raadzaam om te beginnen met 10-20 miljoen leest. - Uitvoeren gekoppeld-einde 100 bp hele genoom DNA sequentiebepaling van monsters op een volgende generatieplatform voor sequencing, volgens de instructies van de fabrikant.
7. analyse van de gegevens rangschikken
Opmerking: De instructies in dit gedeelte zijn bedoeld als leidraad voor analyse. Gebruik extra methoden voor sequencing uitlijning, filteren, verwerken, enz. Dit gedeelte van het protocol zal bezighouden met de geprefereerde methode voor de analyse in dit werk. Als extra methoden worden gebruikt, past u de parameters en functies aan die doeleinden. De onderstaande commando's worden ingevoerd in de Ubutnu of Mac terminal, met de juiste pakketten geïnstalleerd.
- Verkrijgen van de meest recente versies van het genoom van de zebravis (danRer10, vanaf wanneer dit protocol werd geschreven) vanuit UCSC genome browser met behulp van de volgende opdrachten:
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Decomprimeer het bestand fa.gz met de volgende opdracht:
gunzip danRer10.fa.gz - Sequencing gegevens uitlijnen op genoom BWA-mem met behulp van de volgende opdrachten gebruiken:
BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Decomprimeer het bestand fa.gz met de volgende opdracht:
- .Sam bestand converteren naar .bam bestand samtools met de volgende opdracht:
samtools bekijken -bS input.sam > output.bam- Sorteren de bestanden van de gebonden sequencing samtools met de volgende opdracht:
samtools sorteren output.bam > output_sorted.bam - Index van het .bam bestand samtools met de volgende opdracht:
samtools index output.bam
- Sorteren de bestanden van de gebonden sequencing samtools met de volgende opdracht:
- Mark PCR wordt gedupliceerd met Picard met behulp van de volgende opdrachten:
Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
INPUT=input.BAM
OUTPUT=output.BAM
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Genereren van tekstbestanden (.txt) van leesbewerkingen voor elk chromosoom met het volgende commando:
voor ik in {1,25}; CHROM doen = "chr" $i; ECHO $CHROM; samtools bekijken input.bam $CHROM | Cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; gedaan
Opmerking: De kolommen in de resulterende txt-bestand zijn vlag, locatie, mapQ, paar chr, paar locatie en de grootte van het fragment, respectievelijk. - .Txt-bestanden lezen in Matlab (of elke andere soortgelijke software) met behulp van de functie textscan.
- Toewijzing van lage kwaliteit leest uitfilteren door het instellen van een mapQ drempel van 30.
- Verwijder leest met vlaggen voor niet-primaire uitlijning, PCR duplicaten of paar toewijzing aan een ander chromosoom.
- Elke leest met hun paar boven de drempel van een afstand van 2000 bp uitfilteren.
- Evalueren van statistieken van de resulterende leest om te bepalen aantal lees statistieken, dekking, invoegen grootte en kwaliteit (Figuur 2).
- Lees dekking in 100 bp vaste windows voor elk monster bepalen door het tellen van het aantal leest in intervallen van 100 bp over de lengte van elk chromosoom.
- Bereken dat de mediaan lezen tellen voor alle vensters.
- Regio's van de hoge dekking uitfilteren door het verwijderen van windows groter is dan 5 standaardafwijkingen van de mediaan.
- Regio's voor analyse in de G1 referentiemonsters definiëren door het vinden van de segmenten langs elk chromosoom met 200 leest met behulp van schuiframen.
- Lees diepte in elk monster S fase bepalen door het tellen van het aantal S fase leest in de Vensters van de graaf van de 200-lezen gedefinieerd voor de begeleidende G1 verwijzing.
- De ruwe gegevens die met de csaps functie in de software, met een interpolatie-factor (p) van 10-16glad.
- Normaliseren afgevlakte gegevens naar z-score met een gemiddelde van 0 en een standaarddeviatie van 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van gepubliceerde replicatiegegevens timing, representatieve replicatie timing profielen en kwaliteitscontrole maatregelen dienen15. De eerste stappen van verwerking betrekken de gegevens rangschikken aan het genoom, lees lengte en genoom dekking statistieken te berekenen en het filteren van lage kwaliteit, ongepaarde, en PCR dubbele leest uitlijnen. Lezen statistieken voor een typische zebrafish sequencing steekproef zijn afgebeeld in Figuur 2. Na filtering, zijn lezen tellingen worden bepaald in variabele-gerangschikte vensters en de gegevens geëffend en genormaliseerd. Typische gladgestreken/genormaliseerd replicatie timing profielen van een representatieve zebrafish chromosoom voor biologische replicatieonderzoeken worden weergegeven in figuur 3A. De profielen voor biologische en experimentele replicatieonderzoeken moeten visueel zeer vergelijkbaar (Zie Figuur 3 bis) en ook weer hoge correlatie langs de lengte van het chromosoom (figuur 3B). Ze moeten ook weer hoge correlatie tussen timing waarden genoom-brede (Figuur 3 c). Autocorrelatie, een methode om te beoordelen van de continuïteit van de patroon, moet worden gebruikt voor de evaluatie van de mate van structuur in de gegevensset (figuur 3D). De autocorrelatiefunctie voor gestructureerde volwassen timing programma's moet hoog op korte afstanden en geleidelijk afnemen naarmate de afstand toeneemt. Monsters die aantonen dat hoge reproduceerbaarheid tussen biologische en experimentele gerepliceerd en een sterke autocorrelatie signaal moet worden beschouwd als monsters van hoge kwaliteit en kan worden gecombineerd om te verkrijgen van een hogere dekking monster.
Figuur 1: sorteren zebrafish embryo's voor replicatie timing analyse. (A) bevolking van alle cellen gesorteerd voor voorwaartse scatter gebied Gated (FSC-A) per kant scatter gebied (WS-A). De kleuren vertegenwoordigen de dichtheid van de opslaglocaties in de plot van de stip met hoog-laag-dichtheid vertegenwoordigd door kleuren variërend van aan-naar-RGB. (B) bevolking van het FSC x SSC gated cellen gesorteerd voor Gated SSC-A door propidium jodide gebied (PI-A). (C) bevolking van de wetenschappelijke stuurgroep x PI gated cellen gesorteerd voor Gated SSC-A door kant scatter breedte (WS-B). (D) Histogram van alle gated populaties een stereotiepe celcyclus profiel weergeven. Soort gates vakken voor cellen in G1 en S-fase worden weergegeven door de grijs gearceerde met zwarte lijnen. (E) Backgated G1 en S fase populaties laten zien dat de meerderheid van de cellen de oorspronkelijke gating gevangen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Sequencing lezen statistieken voor een steekproef van de typische zebrafish. (A)-Reap kwaliteit van de statistieken van de mapQ waarden in kaart te brengen. (B) Histogram van de verdeling van invoegen maten voor alle sequencing leest. (C) lezen statistieken voor totale toegewezen leest, leest met lage kwaliteit vlag, leest met paren toewijzen aan een ander chromosoom (paar diff chr), leest met paar dan afstand drempel (verre paar), en PCR duplicaten. (D) de representatieve aantal totaal toegewezen, ontkoppeld en ongepaarde leest, dekking, en resolutie voor een run van de typische volgorde van een zebravis monster gelezen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger zebrafish replicatie timing resultaten en kwaliteitscontrole maatregelen. (A) replicatie timing langs de lengte van een vertegenwoordiger van chromosoom voor twee biologische replicatieonderzoeken van 28 hpf embryo's (Siefert, 2017). (B) correlatie tussen replicatie timing waarden in 2 Mb windows langs de lengte van een representatieve chromosoom voor de biologische repliceert van 28 hpf embryo's die zijn weergegeven in figuur 3A. (C) genoom-brede correlatie tussen de waarden van de timing van de replicatie voor biologische (rep1 en rep2) en experimentele (rep3) wordt gerepliceerd, van de embryo's 28 hpf. De kleurkaart vertegenwoordigt van de Pearson correlatiecoëfficiënt. (D) autocorrelatie voor een gestructureerde volwassen timing programma geeft hoge autocorrelatie op nauwe afstanden die geleidelijk vermindert over steeds langere afstanden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis vormen een nieuwe en unieke in-vivo modelsysteem te bestuderen van DNA replicatie timing. Wanneer getimede verparingen zijn uitgevoerd als beschreven in deze experimentele protocol, duizenden embryo's kunnen worden verzameld in een enkele dag voor experimenten. Deze embryo's ontwikkelen synchroon door precies getimed en duidelijk gekenmerkt stadia van ontwikkeling. Zebrafish kan worden gemakkelijk en nauwkeurig enscenering morfologie met een stereomicroscoop, zoals zebrafish embryo's extern te ontwikkelen en optisch duidelijk zijn. Dit protocol gegevens het gebruik van zebravis embryo's te bestuderen van replicatie timing in de gehele gewervelde ontwikkeling.
Gebieden van het protocol dat kan problemen opleveren omvatten synchrone ontwikkeling van zebrafish de embryo's, verlies van cellen tijdens de voorbereiding, FACS sorteren en voorbereiding van de bibliotheek. De timing van de zebravis ontwikkeling is temperatuur afhankelijk zijn, dus gebruik zebrafish aangepast aan de licht/donker cycli en gehuisvest bij 28,5 ° C voor experimenten. Synchrone om ontwikkeling te garanderen, precies getimede verparingen uitvoeren, en het verzamelen van de embryo's die in zeer kleine tijd-windows (10 min of minder). Het is essentieel voor embryo's bij 28,5 ° C te handhaven en ervoor te zorgen dat zij minimale tijd doorbrengen bij kamertemperatuur. De timing van de zebravis ontwikkeling is ook sterk afhankelijk van de dichtheid van embryo's in een bepaald gebied. Het is van cruciaal belang om niet huis embryo's bij een dichtheid hoger dan 100 embryo's per 10 cm plaat, of ze niet goed zal ontwikkelen. De optimale tijd om te verwijderen dode en onbevruchte embryo's is wanneer ze zijn gevorderd tot het stadium van de cel 4-16 en kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als bevruchte ("Stadia van embryonale ontwikkeling van de zebravis"17 als gids). Dode embryo's worden meestal weergegeven als zwarte ballen en onbevruchte embryo's als 1-cel. Werken zo snel mogelijk om de tijd bij kamertemperatuur.
Wanneer dechorionating embryo's, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle chorions zijn verwijderd uit de embryo's. Embryo's in pronase oplossing houden totdat de meeste chorions hebben loskomen. Verwijderen van alle resterende embryo's met chorions intact of verwijderen van hun chorions met een tang. Pipetteer embryo's met behulp van een langzame en soepele beweging. Niet Pipetteer snel als het zal de cellen overmatige stress en resulteren in verlies van cellen. Het is ook belangrijk niet te gebruiken een P200 als dit kan leiden tot verhoogde schuifspanning die in breuk van cellen resulteert. Omgekeerd, een kunststof overdracht pipet wellicht niet een klein genoeg droeg of bieden genoeg schuifspanning om adequaat verstoren de dooier zak en gedesag van de cellen. Alternatieve pipetten gebruikt kunnen worden voorzien van de boring en schuintrekken zou gelijkwaardig zijn aan de optimale P1000.
Wanneer FACS sorteren 28 hpf, als een stereotiepe cel cyclus profiel wordt niet verkregen, de spanning op de PI laser zodanig aanpassen dat de G1 piek is gecentreerd rond de 50K. De voordelen voor de FSC en SSC kunnen ook moeten worden aangepast zodat de gating en cel populaties op Figuur 1 lijken. Als er nog steeds moeite, de ND-filter moet worden ontstoken, en de spanningen van het FSC en SSC aangepast zodat de meerderheid van de cellen liggen op de poort. Het moet duidelijk of er nu PI kleuring, zo zal er een bereik dat dubbelspel voor de PI-A. benadert Het histogram moet twee duidelijke pieken, een grote piek in 2N DNA voor de G1-cellen en een kleinere piek bij dubbel de intensiteit voor de 4N DNA inhoud weergeven van G2/M cellen. Als dit nog niet is verkregen ofwel kan er lage aantallen cellen intact, problemen met de PI kleuring of problemen met bevestiging en het protocol zal moeten dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd.
Cellen van het vroege embryo's (vóór 10 hpf) geeft geen typische celcyclus profielen, zoals een hoog percentage van deze cellen in de S-fase. Deze monsters kunnen worden behandeld als de S fase monsters, en in vergelijking met een referentie van de G1 van 24 hpf embryo's. Embryo's tussen 10 hpf 24 hpf tussenliggende celcyclus profielen kunnen geven en indien gewenst kunnen worden gesorteerd. De bevolking van de S-fase kan ook worden geïdentificeerd en gesorteerd door het opnemen van thymidine analogen zoals EDU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) of BrdU (Bromodeoxyuridine) in korte pulsen voorafgaand aan de fixatie, dit is echter niet nodig zijn voor nauwkeurige bepaling van replicatie timing.
Ideaal is de voorbereiding van de bibliotheek moet worden begonnen met 1 microgram van DNA. Theoretisch ~ 300.000 gesorteerde cellen ongeveer 1 microgram van DNA zou opleveren (schatten ~3.3 pg/kern), echter, is er altijd verlies in het gehele protocol. 500.000 tot 1 miljoen gesorteerde cellen moeten geven van meer dan 1 µg van DNA. Een typische 24 hpf embryo zal hebben ongeveer 18.000 cellen, waarvan 10-15% in de S-fase worden zal. Embryo's in eerdere stadia van ontwikkeling zal aanzienlijk minder cellen echter zal hebben hogere percentages van cellen in de S-fase.
Het uitvoeren van nauwkeurige zuivering en maat keuze met behulp van magnetische kralen is kritiek aan het wegwerken van ongewenste elementen van de voorbereiding van de bibliotheek. Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig en aanvullende optimalisatie kan worden geëist. Een kleine hoeveelheid PCR Dimeren is meestal niet een groot probleem, maar de adapter Dimeren zal zeer efficiënt volgnummer zodat zij moeten worden geminimaliseerd. Dit kan worden bereikt door de eerste adapter DNA/verhouding aan te passen, en het uitvoeren van nauwkeurige grootte selectie tijdens de voorbereiding van de bibliotheek.
Single-end sequencing mogelijk ook geschikt is voor verschillende experimentele behoeften. Single-end is goedkoper en biedt de meeste van de vereiste informatie omdat deze aanpak is gebaseerd op het tellen van leest; gekoppeld-einde biedt een hogere mogelijkheid om PCR en optische duplicaten te verwijderen en op te lossen gebieden van repetitieve sequenties en andere structurele varianten (die gangbaar zijn in het genoom van de zebravis). Het analyse gedeelte hieronder zal alleen bezighouden met gekoppeld-einde sequencing leest. Kortere sequencing leest kunnen ook dienstig. Dit zorgt voor een hoger aantal leest tegen een lagere kostprijs, maar het leest wellicht moeilijker om toe te wijzen. De onderstaande analyse-gedeelte is geoptimaliseerd voor 100 bp leest en aanpassingen nodig zijn als kortere lees lengte wordt gebruikt kunnen worden.
Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor extra toepassingen van de zebravis model. Het is al gebruikt voor analyse van zebravis staartvin fibroblasten (ZTF cellen), een oplaadbare batterij cultuur lijn geïsoleerd van volwassen zebrafish verving. Studeren geïsoleerde celtypes van zebravis, kunnen transgene markeringen worden gebruikt om te identificeren en individuele celtypes isoleren voordat kleuring en sorteren voor DNA-inhoud. Een mogelijke strategie zou gebruiken een transgene lijn uiting geven aan een fluorescerende marker voortgestuwd door een promotor weefsel-specifieke, en in de eerste geïsoleerde cellen door FACS sorteren, fixatie gevolgd en sorteren voor DNA-inhoud. Bovendien is het gebruik van cel permeabele DNA kleurstoffen kunnen voor gelijktijdige isolatie van individuele celtypes evenals G1 en S fase populaties. Deze aanpassingen bij dit protocol kunnen ook replicatie timing studies in andere in vivo modellen.
Een spannende mogelijkheid voor het toekomstige gebruik van dit protocol is het bestuderen van de rol van replicatie timing in ziekte. Er zijn verschillende kanker modellen in zebrafish, sommige spontane en andere afleidbare, die kunnen worden gebruikt om te bepalen wanneer de veranderingen in de timing van de replicatie tijdens oncogenese plaatsvinden. Hierdoor zal de evaluatie van de timing van de replicatie rol speelt in de progressie van tumorvorming en ziekte. Bovendien, zebravis zijn een uitstekend model voor drug screening en kan worden gebruikt voor het identificeren van geneesmiddelen die van invloed zijn op replicatie timing verordening, die de mogelijkheden voor gebruik in de behandeling van kanker hebben.
De zebravis is een veelbelovend nieuw model om te studeren replicatie timing. Dit protocol zal veroorloven vele anderen kunnen gebruik maken van dit model bij het bestuderen van de rol van replicatie timing bij ontwikkeling en ziekte. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met andere in vivo developmental modelsystemen, zoals Drosophila melanogaster Xenopus laevisen kijken uit naar toekomstige bevindingen uit deze en andere organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health door verleent 5P20GM103636-02 (inclusief Stroom Cytometry core ondersteuning) en 1R01GM121703, evenals awards van de Oklahoma-centrum voor volwassen stamcel Onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
