Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

Published: April 30, 2018 doi: 10.3791/57146
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

Summary

واستخدمت مؤخرا الزرد كنظام نموذجي في فيفو لدراسة توقيت تكرار الحمض النووي أثناء التطوير. وإليك تفاصيل البروتوكولات لاستخدام الأجنة الزرد إلى توقيت النسخ المتماثل الشخصية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لدراسة توقيت النسخ المتماثل في طفرات وأنواع الخلايا الفردية ونماذج الأمراض والأنواع الأخرى.

Abstract

توقيت تكرار الحمض النووي سمة هامة خلوية، نستعرض علاقات هامة مع هيكل الكروماتين، والنسخ، ومعدلات الطفرة في الحمض النووي. تحدث التغييرات في توقيت النسخ المتماثل أثناء التطوير والسرطان، ولكن توقيت النسخ المتماثل دور يؤديه في التنمية والمرض غير معروف. الزرد أنشئت مؤخرا كنظام نموذجي في فيفو لدراسة توقيت النسخ المتماثل. وإليك تفاصيل البروتوكولات لاستخدام في الزرد لتحديد توقيت تكرار الحمض النووي. وبعد فرز الخلايا من الأجنة والبالغين الزرد، يمكن بناؤها على نطاق الجينوم الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها النقوش ذات الدقة العالية بتحديد التغيرات في عدد نسخ الحمض النووي من خلال تحليل البيانات تسلسل الجيل القادم. يتيح هذا النظام النموذجي الزرد لتقييم توقيت النسخ المتماثل للتغييرات التي تحدث في المجراة في التنمية، ويمكن أيضا استخدامها لتقييم التغيرات في أنواع الخلايا الفردية أو نماذج المرض أو خطوط المسخ. هذه الأساليب سيمكن دراسات التحقيق في آليات ومحددات للنسخ المتماثل لتوقيت إنشاء وصيانة خلال التنمية، وتوقيت النسخ المتماثل لدور تلعبه في الطفرات وتوموريجينيسيس، وآثار مقاومة توقيت النسخ المتماثل في التنمية والمرض.

Introduction

للخلايا لتقسيم بنجاح، يجب أن أولاً بدقة وإخلاص النسخ المتماثل الجينوم أكمله. حدوث ازدواج الجينوم في نمط استنساخه، المعروفة باسم ال DNA النسخ المتماثل توقيت البرنامج1. ويرتبط توقيت تكرار الحمض النووي مع منظمة الكروماتين وعلامات جينية والتعبير الجيني2،3. التغييرات في توقيت النسخ المتماثل تحدث في جميع أنحاء التنمية، والبرامج ذات الصلة إلى حد كبير إلى النسخي والتعديلات لعلامات الكروماتين وتنظيم4،5. وعلاوة على ذلك، يرتبط توقيت النسخ المتماثل مع الترددات حيث، وهي تلاحظ تغييرات في توقيت في أنواع مختلفة من السرطان6،،من78. وعلى الرغم من هذه الملاحظات، الآليات والمحددات للنسخ المتماثل لتوقيت إنشاء وتنظيم لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، والدور الذي تؤديه في التنمية ومرض غير محدد. وباﻹضافة إلى ذلك، حتى مؤخرا في النسخ المتماثل على نطاق الجينوم توقيت التغييرات التي تحدث في جميع أنحاء تطوير الفقارية فقط بحثت في نماذج الثقافة الخلية.

الزرد، دانيو rerio، مناسبة تماما لدراسة النسخ المتماثل توقيتها في فيفو أثناء التطوير، كما يمكن أن تسفر عن زوج التزاوج واحد من مئات أجنة التي تتطور سريعاً مع العديد من أوجه التشابه إلى التنمية الثدييات9، 10. وعلاوة على ذلك، في جميع أنحاء تطوير الزرد، هناك تغييرات في دورة الخلية، تنظيم الكروماتين والنسخي البرامج التي تشترك في علاقات مع الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها11. الزرد أيضا نموذج وراثية ممتازة، كما هم خاصة قابلة للتلاعب من قبل ترانسجينيسيس، والطفرات والتحولات المستهدفة، والشاشات الوراثية حددت العديد من الجينات المطلوبة لتطوير الفقارية12. ولذلك، يمكن استخدام الزرد لتحديد الجينات المشاركة في النسخ المتماثل توقيت إنشاء وصيانة ومراقبة آثار رفع الضوابط عن توقيت النسخ المتماثل في التنمية الفقاريات. يمكن أيضا استخدام خطوط محوره وراثيا لتقييم توقيت النسخ المتماثل من أنواع الخلايا الفردية المعزولة في تيميبوينتس التنموية المختلفة، أو في ظروف المرض. الأهم من ذلك، هناك نماذج مختلفة من الزرد من الأمراض البشرية التي يمكن استخدامها للتحقيق في دور النسخ المتماثل توقيتها في المرض تشكيل وتطور9،،من1314.

في الآونة الأخيرة، تم إنشاؤها الملامح توقيت النسخ المتماثل الأولى من الزرد، تجعله كنظام نموذجي لدراسة النسخ المتماثل توقيتها في فيفو15. لتحقيق هذا الهدف، تم جمع الخلايا من الأجنة الزرد في مراحل متعددة من التنمية، وفي نوع خلية عزلها من الزرد الكبار. ثم تم فرز الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية (الأسفار تنشيط الخلية الفرز) استناداً إلى محتوى الحمض النووي لعزل السكان المرحلة G1 و S. استخدام نموذج G1 كعنصر تحكم عدد نسخ، نسخ عدد الاختلافات في مرحلة ثانية السكان كانت مصممة وتستخدم للاستدلال على النسخ المتماثل النسبي توقيت16. التغييرات في توقيت النسخ المتماثل يمكن مقارنتها مباشرة ثم بين نماذج إنمائية مختلفة وأنواع الخلايا، وكان يستخدم هذا لتحديد التغيرات في توقيت النسخ المتماثل التي تحدث في فيفو طوال إعداد الفقاريات. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا الأخرى الأساليب الجينومية، أساسا أنه يتطلب وضع العلامات مع النظير thymidine أو إيمونوبريسيبيتيشن للحمض النووي4،6.

هنا مفصلة على الشخصية على نطاق الجينوم الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها في البروتوكولات عالية الدقة في الزرد. استخدمت هذه البروتوكولات لتحديد العلاقات مع ميزات الجينوم وجينيه في الجينوم الزرد، فضلا عن تحديد ملامح التغييرات في هذه العلاقات التي تحدث في جميع أنحاء التنمية. هي أيضا بسهولة تكييف هذه البروتوكولات لدراسة التغيرات في توقيت النسخ المتماثل في سلالات متحولة من الزرد ونماذج المرض. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الأساليب أساسا التي يمكن توسيعها عند دراسة توقيت النسخ المتماثل في أنواع محددة من الخلايا، بفرز أول أنواع خلايا فردية من الزرد. يمكن أن تكون الزرد ممتازة في فيفو نموذج نظام لدراسة توقيت النسخ المتماثل وتكشف الوظائف البيولوجية لهذا سمة جينية هامة في نهاية المطاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كل الحيوانات عولجت يتفق بشكل صارم مع بروتوكولات وافق أوكلاهوما البحوث الأساس المؤسسي الحيوان الرعاية الطبية واستخدام اللجنة.

1. إعداد الزرد الكبار لتربية

  1. استخدام مجموعة كبيرة من الزرد البالغين الذكور والإناث من سلالة واحدة لتربية. هناك اختلافات صغيرة في التركيب الوراثي الزرد حتى سلالة واحدة، واستخدام مجموعة كبيرة لضمان النتائج تمثيلاً للتنوع الجيني للسكان، ولا تقتصر على مجموعة فرعية صغيرة من السكان.
  2. في الليلة السابقة سيتم جمع الأجنة، وضع عشرات من تربية الكبار في تربية الدبابات، استخدم أعدادا متساوية تقريبا من الذكور والإناث. اعتماداً على التجربة، استخدام إحدى استراتيجيات تربية التالية.
    1. تربية استراتيجية 1: ضع الزرد عدد قليل من الذكور والإناث في خزانات تربية الفرد، وفصل الذكور عن الإناث مع مقسم. إذا تم استخدام هذا النهج، إعداد العديد من الدبابات تربية مختلفة وتجميع الأجنة من كل منهما لضمان التنوع البيولوجي هو الممثل للسكان.
    2. تربية الاستراتيجية 2: تجمع العشرات من الزرد الذكور والإناث في خزان لتربية كبيرة. تستخدم هذه الاستراتيجية ما دام هناك عدد كبير بما فيه الكفاية للأجنة، فمن المعقول أن نفترض أنها جاءت من مجموعة متنوعة من المؤسسين وهم ولذلك وراثيا تمثيلية للسكان.

2-توقيت ماتينجس-جمع وفرز والإسكان أجنة الزرد للتجارب

  1. أداء ماتينجس موقوت، ابتداء من أقرب دورات الضوء في الصباح. تجاهل أي الأجنة التي تولد بين عشية وضحاها.
  2. تسمح الأسماك تتوالد في المياه الضحلة (3-5 سم) لمدة 10 دقائق، مع قاع كاذبة للأجنة للهروب من خلال.
  3. بعد 10 دقيقة، جمع الأجنة التي تتدفق من خلال مصفاة والشطف في صفيحة 10 سم مع زجاجة غسيل. تجمع جميع الأجنة التي يتم جمعها في نفس الوقت نقطة، وضع علامة عليها مع مرور الوقت لجمع، والمكان فورا في حاضنة في 28.5 درجة مئوية.
  4. يمكن توقع مئات أجنة من زوج التزاوج واحد في يوم واحد. السماح للكبار إلى تولد في 10 دقيقة دورات حتى عدد الأجنة التي تم الحصول عليها أقل من عشرين.
  5. حوالي 1-1.5 ح بعد جمع وفرز الأجنة لإزالة أجنة ميتة والمخصبة. لفرز الأجنة، إزالة من الحاضنة ومراقبة تحت مجهر تشريح.
    1. مكان في كثافة الأجنة 100 كل لوح 10 سم وعدد الأجنة.
    2. إضافة جديدة E3 المتوسطة (مم كلوريد الصوديوم، 0.17 مم بوكل، 0.33 مم كاكل2، 0.33 مم MgSO4من 5) وإرجاع الأجنة للحاضنة 28.5 درجة مئوية.

3-ديتشوريوناتي، ديلك، وإصلاح الأجنة الزرد

ملاحظة: تم تصميم هذا الجزء من البروتوكول للأجنة قبل 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf). ليس هناك حاجة لإزالة تشوريونس الأجنة في مراحل لاحقة من التنمية (بعد 48 هبف)، كما أنها بطبيعة الحال كثيرا ما تسقط. ليست هناك حاجة ديلك أو إزالة تشوريونس في الأسماك الأكبر سنا بعد 5 أيام الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية).

  1. عند الأجنة الذين يبلغون سن الإنمائية المرجوة، تحقق من المرحلة المناسبة للتنمية شكلياً تحت مجهر خفيفة وفقا "مراحل التنمية الجنينية من الزرد"17.
  2. نقل الأجنة نظموا يصل إلى 1500 إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتغسل عدة مرات مع E3.
    1. إضافة 1 مل E3 و 20 ميليلتر من حل برنس (30 ملغ/مل) لكل 100 الأجنة ودوامه بلطف. ما يصل إلى 1500 الأجنة يمكن أن تكون ديتشوريوناتيد في أنبوب واحد مع 15 مل E3.
    2. وضع أنبوب على جانبها وترتيب الأجنة في طبقة حتى لضمان أقصى السطح إلى نسبة الحجم. بلطف تحرض أنبوب انخفضت كل 2-3 دقيقة حتى تشوريونس جميع الخروج من الأجنة. الوقت الإجمالي ديتشوريونيشن ستختلف تبعاً للنشاط برنس.
  3. إزالة المادة طافية وشطف الأجنة 3 مرات مع 10 مل E3 بلطف. وضع الأجنة على الجليد لما تبقى من هذا الفرع من البروتوكول.
  4. إزالة E3 وتغسل الأجنة مع المخزن المؤقت دييولكينج المثلج الطازجة (0.5 × الحل "غينزبورغ الأسماك المسابقة"، دون الكالسيوم: 55 مم كلوريد الصوديوم، 1.8 مم بوكل، 1.25 مم ناكو3).
    1. أضف 1 مل من المخزن المؤقت دييولكينج المثلج لاجنة تصل إلى 500.
    2. استخدام P1000، بلطف "الماصة؛" الأجنة صعودا وهبوطاً 5-10 مرات لعرقلة كيس الصفار.
    3. نقل مل 1 إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 500 x ز لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة بيليه طاف ويغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج (الفوسفات مخزنة المالحة، درجة الحموضة 7.0) إزالة الحل للمسابقة. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و g x 500 لمدة 5 دقائق.
  6. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. ضع الأنبوبة في الجليد.
  7. أضف 3 مل إيثانول المثلج (EtOH) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أنبوب دوامة من EtOH برفق على إعداد منخفض.
    1. استخدام P1000، ببطء (قطره 1 في الثانية الواحدة) بالتنقيط الزرد الجنين خلية تعليق في EtOH أثناء فورتيكسينج برفق.
    2. إضافة إجمالي 1 مل من تعليق خلية الجنين، لحل تثبيت نهائي 75% EtOH.
  8. بعد 1 مل خلية تعليق المضاف، بلطف أنبوب دوامة لخلط ووضع في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1. من المستحسن وضع الأنابيب إلى جانبهم لضمان أقصى السطح إلى نسبة الحجم وتقليل عدد الأجنة والخلايا التي تلتصق ببعضها البعض. تخزين خلايا الأجنة في-20 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.

4-تلطيخ الحمض النووي ونظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الأجنة

ملاحظة: تم تصميم هذا الجزء من البروتوكول للأجنة في 1 إدارة الشرطة الاتحادية.

  1. إزالة خلايا الأجنة ثابتة EtOH من-20 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في ز 1500 x 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    1. ضع الأنبوبة في الجليد وإزالة المادة طافية بعناية. برفق باستخدام P1000، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل BSA برنامج تلفزيوني الباردة الطازجة (1 x PBS، ألبومين المصل البقري 1%).
    2. الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجة مئوية و 1500 غ س لمدة 5 دقائق ثم ضع على الجليد.
  2. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في يوديد propidium (PI) تلطيخ الحل (50 ميكروغرام/مل PI، 100 ميكروغرام/مل رناسي A، PBS، درجة الحموضة 7.0)، استخدام 200 ميليلتر لكل 1000 الأجنة.
    1. السماح للخلايا لاحتضان في حل بي مدة 30 دقيقة على الجليد، والاختلاط بلطف كل 5 دقائق.
    2. ضع مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية على الجليد. بلطف "الماصة؛" الخلايا لخلط وتصفيتها من خلال الشبكة.
      ملاحظة: إذا تم جمع أنابيب متعددة الأجنة من تيميبوينت نفسه في المادة 3 من البروتوكول، الجمع بين هذه الأجنة في هذه المرحلة حيث يتم فرزها جميعا معا.
    3. استخدام الشقة داخل نهاية المكبس حقنه، بلطف تعطيل أي كتل المتبقية من الخلايا في الشبكة.
    4. شطف الخلايا عن طريق التصفية مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة-جيش صرب البوسنة لكل 1000 من الأجنة.
    5. 40-ميكرون عبر أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد وتصفية تعليق خلية من 50 مل أنبوبة مخروطية الشكل لمرة ثانية في أنبوب 15 مل.
  3. باستخدام خلية مناسبة فرز الصك، تعيين الإثارة الليزر للكشف عن 561-شمال البحر الأبيض المتوسط والانبعاثات إلى 610/20 للكشف عن يوديد propidium.
    1. ميكس 15 مل أنبوب خلايا ملطخة بإيجاز قبل فورتيكسينج ومكان في الصك عند 4 درجة مئوية.
    2. تشغيل معدل الخلايا في تدفق بطيء، من الناحية المثالية 1.0 مل/دقيقة، للحصول على ملف تعريف دورة الخلية نظيفة وتجنب خلط G1 أو G2/M الخلايا مع S المرحلة السكان.
    3. أولاً، بوابة لمنتدى التعاون الأمني-أ x SSC-(منطقة مبعثر إلى الأمام بالجانب مبعثر المنطقة) لإزالة الأنقاض (الشكل 1A).
      ملاحظة: يمكن تكون الخلايا من الأجنة متفاوتة الأحجام تبعاً لنوع المرحلة وخلية. مرشح الكثافة محايدة (ND) قد تحتاج إلى تبديل بين 1.0 و 1.5 تبعاً لحجم الخلايا الحالية. بوابة منطقة كبيرة لجمع معظم الخلايا وإزالة الحطام.
    4. بوابة ثانية، للتعاون بين بلدان الجنوب-المنطقة (SSC-أ) بمنطقة PI (PI-أ)، لإزالة الحطام وخلية دوبليتس (الشكل 1B).
    5. ثالثا، بوابة للتعاون بين بلدان الجنوب، بالتعاون بين بلدان الجنوب-العرض (W) لإزالة أي doublets الخلية المتبقية (الشكل 1).
  4. عرض السكان المبوب في الرسم بياني مع عدد الخلايا (العدد) في منطقة يوديد المحور الصادي و propidium (PI-أ) على المحور س. 24 هبف الأجنة، لهذا ينبغي أن تعطي صورة نمطية دورة الخلية كما في الشكل 1.
    1. لفرز السكان المرحلة S، تعيين البوابة من الجانب الأيمن من ذروة G1 إلى الجانب الأيسر من ذروة G2، بما في ذلك سوى قدر ضئيل من السكان G1 و G2. للأجنة هبف 24، هذا سوف تتضمن عادة حوالي 10-15 في المائة من السكان بوابات (انظر الشكل 1).
    2. لفرز السكان G1، تعيين البوابة على الجانب الأيسر من ذروة G1، لا لتمرير أعلى الذروة. قم بضبط عرض البوابة G1 ضيقة قدر الإمكان (انظر الشكل 1).
    3. عودة البوابة G1 و S المرحلة السكان لضمان المناسبة الأولى النابضة (الشكل 1E).
  5. فرز G1 و S السكان المرحلة إلى 15 مل أنابيب مخروطية الشكل مع 3 مل من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة. ينبغي أن يكون الهدف الحصول على بين 500,000 و 1 مليون أو أكثر من الخلايا تم فرزها كل جزء (المرحلة G1 و S).
  6. بعد الانتهاء من فرز، أنابيب الطرد المركزي في 1500 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: بيليه الخلية الصغيرة سيكون من الصعب أن نرى، ومن المهم تجنب الإخلال بأنه، لذلك يفضل استخدام دوار دلو يتأرجح عبر دوار زاوية ثابتة.
  7. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. نقل الخلايا إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. بعناية إزالة جميع السائل من أنبوب وتجميد بيليه الجافة عند-20 درجة مئوية. تخزين بيليه في-20 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.

5-الحمض النووي العزلة والعلاج رناسي، وتنقية الحمض النووي

  1. إزالة خلية بيليه من-20 درجة مئوية، ومكان على الجليد.
    1. إضافة 400 ميليلتر من مخزونات النشر الاستراتيجي المخزن المؤقت (مم تريس-HCl (pH 8.0)، 10 مم يدتا، 1 م كلوريد الصوديوم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% من 50) بيليه وريسوسبيند.
    2. إضافة بروتيناز ك إلى تركيز نهائي من 0.2 مغ/مل ومزيج من فورتيكسينج بإيجاز.
    3. احتضان عينات من 56 درجة مئوية ل 2 ح، دوامة كل 15 دقيقة.
  2. بعد ح 2، أداء استخراج الفينول كلوروفورم بإضافة 400 ميليلتر من الفينول-كلوروفورم (25:24:1 الفينول: كلوروفورم: إيسواميل "الكحول"، مشبعة 10 ملم تريس، pH 8.0، 1 مم يدتا).
    1. دوامة للعينة s والطرد المركزي 20 في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق مراحل منفصلة.
    2. بعناية إزالة المرحلة المائية العليا (400 ميليلتر) ونقل إلى أنبوب 1.5 مل.
  3. أداء EtOH هطول الأمطار بإضافة 40 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (5.2 درجة الحموضة)، 2 ميليلتر من الجليكوجين، ومل 1 من EtOH.
    1. الدوامة مزيج دقيق ووضع في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعجل بالحمض النووي. يمكن أيضا أن تكون عجلت عينة في-80 درجة مئوية أو على الثلج الجاف ح 1.
    2. عينة للطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 16,000 ز س لمدة 30 دقيقة للحمض النووي بيليه.
    3. تجاهل بيليه طاف ويغسل مع 1 مل 70% EtOH. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية وز س 16,000 لمدة 5 دقائق.
    4. تجاهل بيليه طاف وأيردري في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
  4. حل بيليه في 96 ميليلتر من الماء يعقم، وإضافة 4 ميليلتر من رناسي A (2 مغ/مل).
    1. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
  5. القيام باستخراج الفينول كلوروفورم بإضافة 100 ميليلتر من الفينول كلوروفورم والإجراء التالي في الخطوات 5.2.1-5.2.2.
  6. تنفيذ EtOH هطول الأمطار بواسطة ميليلتر 10 إضافة خلات الصوديوم م 3، 1 ميليلتر الجليكوجين و 250 ميليلتر EtOH واتباع الإجراء في الخطوات 5.3.1-5.3.5.
  7. ريسوسبيند بيليه في 60 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl (pH 8.0)، يدتا 10 ملم (pH8.0)) وتحديد تركيز الحمض النووي باستخدام أسلوب الأسفار-على أساس كمي. تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم تحديد كمية الحمض النووي باستخدام الأصباغ ربط الحمض النووي القائم على الأسفار، أو وسائل أخرى أكثر موثوقية من الأساليب المستندة إلى مطياف الأشعة فوق البنفسجية.

6-إعداد مكتبات الحمض النووي وتسلسل الجيل القادم

ملاحظة: عينة G1 نسخة رقم مرجع لكل مصدر من مصادر بيولوجية مطلوب لكل تشغيل التسلسل (أي وزن، وخط الخلية متحولة، محوره وراثيا،، إلخ). قارن جميع عينات المرحلة S من نفس المصدر البيولوجي في نفس تسلسل تشغيل على نفس مرجع G1. يتطابق البيولوجية تشغيل اثنين على الأقل لكل عينة لضمان الاتساق بين العينات.

  1. تمييع 1 ميكروغرام للحمض النووي لوحدة تخزين نهائي 50 ميليلتر ونقل إلى أنبوب متخصصة ل sonication.
  2. قص الحمض النووي لهدف 250-300 بي بي في أولتراسونيكاتور مركزة، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة والبروتوكول.
  3. التحقق من نوعية وحجم المنفصمة الحمض النووي باستخدام جهاز التفريد الآلي، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة والبروتوكول. ضمان وجود ذروة كبيرة ~ 250-300 بي بي للحمض النووي الجينومي المنفصمة.
  4. تعد المكتبات التسلسل باستخدام مجموعة أدوات إعداد مكتبة الحمض النووي مع أوليجوس متعدد لتعاقب على منصة إيلومينا، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  5. التحقق من جودة الإعدادية المكتبة باستخدام الجهاز الآلي التفريد، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. ضمان وجود ذروة كبيرة ~ 400-450 شركة بريتيش بتروليوم، وهناك قمم الحد الأدنى مبلمر (80-85 bp) و dimers محول (~ 120 bp).
  6. التحديد الكمي للمكتبات باستخدام مجموعة أدوات القياس الكمي مكتبة الحمض النووي لتسلسل الحمض النووي من الجيل التالي، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  7. متعدد ميليلتر 15 مخفف من مكتبة إلى تركيز 5 نانومتر والجمع بين المكتبات كما هو مطلوب لتحقيق المطلوب فريد قراءة تعيين تهم كل عينة.
    ملاحظة: سوف تحدد عدد فريد على تعيين ما يلي كل عينة القرار. استخدام عدد قليل من 5 مليون المعينة ما يلي لتقييم توقيت النسخ المتماثل للجينوم الزرد. من المستحسن أن تبدأ مع 10 مليون على ما يلي.
  8. أداء إقران-نهاية 100 شركة بريتيش بتروليوم الجينوم كله تسلسل الحمض النووي من عينات على منصة تسلسل جيل القادم، طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.

7-تحليل البيانات التسلسل

ملاحظة: تهدف الإرشادات الموجودة في هذا المقطع كمبدأ توجيهي للتحليل. استخدام أساليب إضافية لمحاذاة التسلسل، التصفية، التجهيز، إلخ. وسيتناول هذا الجزء من البروتوكول الأسلوب المفضل للتحليل في هذا العمل. إذا استخدمت أساليب إضافية، ضبط المعلمات والوظائف التي تناسب هذه الأغراض. يتم إدخال الأوامر أدناه في أوبوتنو أو ماك المحطة الطرفية، مع الحزم المناسبة مثبتة.

  1. الحصول على أحدث الإصدارات من الجينوم الزرد (danRer10، وحتى عندما كتب هذا البروتوكول) من مستعرض الجينوم التسخن باستخدام الأوامر التالية:
    مجلد مشترك ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
    1. إلغاء ضغط الملف fa.gz باستخدام الأمر التالي:
      gunzip danRer10.fa.gz
    2. محاذاة البيانات تسلسل الجينوم استخدام التحالف-الفنزويلية باستخدام الأوامر التالية:
      التحالف mem-t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
  2. تحويل ملف.sam إلى الملف.bam باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي:
    عرض سامتولس input.sam-بكالوريوس > output.bam
    1. فرز الملفات تسلسل محاذاة باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي:
      فرز سامتولس output.bam > output_sorted.bam
    2. فهرسة الملف.bam باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي:
      سامتولس فهرس output.bam
  3. مارك PCR التكرارات مع بيكار باستخدام الأوامر التالية:
    جافا--Xmx2g--جرة picard.jar ماركدوبليكاتيس \
    INPUT=input.bam
    OUTPUT=output.bam
    REMOVE_DUPLICATES = false
    METRICS_FILE=output_metrics.txt
  4. إنشاء الملفات النصية (.txt) لما يلي لكل كروموسوم باستخدام الأمر التالي:
    لأني في {1.25}؛ هل معدن الكروم = "مركز حقوق الإنسان" $i؛ صدى $CHROM؛ عرض سامتولس input.bam $CHROM | قص--و 2,4,5,7,8,9 > ريادشر ${i}.txt؛ عمله
    ملاحظة: الأعمدة الموجودة في ملف.txt الناتج هي العلم، زوج الموقع، مابق، مركز حقوق الإنسان وموقع زوج وحجم الشظايا، على التوالي.
  5. قراءة ملفات txt. في Matlab (أو أي برامج أخرى مشابهة) باستخدام الدالة تيكستسكان.
    1. تصفية تعيين منخفضة الجودة ما يلي بتحديد عتبة مابق من 30.
    2. قم بإزالة ما يلي مع إشارات للمحاذاة لا الأولية أو PCR التكرارات تعيين زوج كروموسوم مختلفة.
    3. تصفية أية قراءات مع الزوج تتجاوز عتبة مسافة من شركة بريتيش بتروليوم عام 2000.
    4. تقييم الإحصاءات الناتجة عن ذلك ما يلي: تحديد عدد لقراءة الإحصاءات والتغطية، وإدراج حجم ونوعية (الشكل 2).
  6. تحديد التغطية القراءة في windows bp ثابتة 100 لكل عينة بإحصاء عدد يقرأ في 100 شركة بريتيش بتروليوم فترات عبر طول كل كروموسوم.
    1. حساب المتوسط عدد مرات لكافة إطارات القراءة.
    2. تصفية مناطق التغطية العالية بإزالة windows أكبر من الانحرافات المعيارية 5 من الوسيط.
  7. تحديد المناطق لتحليل العينات المرجعية G1 بإيجاد قطاعات على طول كل كروموسوم مع 200 ما يلي: استخدام النوافذ المنزلقة.
    1. تحديد عمق القراءة في كل عينة المرحلة S بإحصاء عدد القراءات مرحلة ثانية في windows عدد مرات القراءة 200 تعريف للإشارة G1 المصاحبة لها.
  8. البيانات الأولية باستخدام الدالة كسابس في البرنامج، مع عامل استيفاء (ف) من 10-16على نحو سلس.
  9. تطبيع البيانات ممهدة لدرجة z مع متوسط 0 والانحراف المعياري 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام بيانات توقيت نشر النسخ المتماثل، يتم توفير النسخ المتماثل الممثل توقيت التشكيلات الجانبية وتدابير مراقبة الجودة15. وتشمل الخطوات الأولية لمعالجة محاذاة البيانات تسلسل الجينوم، حساب طول القراءة والجينوم تغطية الإحصاءات، وتصفية منخفضة الجودة، مزاوج، وبكر مكررة ما يلي. قراءة الإحصاءات لنموذج تسلسل الزرد نموذجية مبينة في الشكل 2. بعد تصفية، ممهدة قراءة التهم مصممون في ويندوز متغير الحجم والبيانات وتطبيعها. النسخ المتماثل النموذجية ممهدة تطبيع توقيت لمحات من الكروموسوم الزرد الممثل ل replicates البيولوجي مبينة في الشكل 3 ألف. التشكيلات الجانبية ل replicates البيولوجية والتجريبية ينبغي بصريا جداً مماثلة (انظر الشكل 3 ألف) وأيضا عرض ارتباط عالية على طول الكروموسوم (الشكل 3B). وعليها أن تظهر أيضا ارتباط عالية بين قيم التوقيت على نطاق الجينوم (الشكل 3). ينبغي استخدام ترابط تلقائي، أسلوب لتقييم نمط الاستمرارية، لتقييم درجة الهيكل في مجموعة البيانات (3D الشكل). ترابط تلقائي لتوقيت ناضجة منظم برامج ينبغي أن تكون عالية في المسافات القصيرة وتنخفض تدريجيا مع ازدياد المسافة. العينات التي تظهر إمكانية تكرار نتائج عالية بين البيولوجي والتجريبية وإنشاء نسخ متماثلة وإشارة قوية ترابط تلقائي ينبغي أن تعتبر عينات ذات جودة عالية ويمكن الجمع بين الحصول على عينة تغطية أعلى.

Figure 1
رقم 1: فرز الأجنة الزرد للنسخ المتماثل توقيت التحليل. (أ) بوابة السكان من كافة الخلايا التي تم فرزها لمنطقة المبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) بمنطقة مبعثر الجانب (SSC-أ). تمثل الألوان كثافة سلال في المؤامرة نقطة ذات الكثافة العالية إلى المنخفضة ممثلة بألوان تتدرج من الأحمر إلى الأخضر إلى الأزرق. (ب) بوابات سكان الخلايا x SSC منتدى التعاون الأمني عن طريق بوابة فرزها للتعاون بين بلدان الجنوب-بحسب مجال يوديد propidium (PI-أ). (ج) بوابات السكان ال SSC × PI بوابات الخلايا التي تم فرزها للتعاون بين بلدان الجنوب-A بجانب العرض مبعثر (SSC-ث). (د) الرسم البياني لجميع السكان بوابات عرض صورة نمطية دورة الخلية. فرز البوابات ليتم عرض الخلايا في المرحلة G1 و S بالرمادي مظللة محاصر مع خطوط سوداء. السكان المرحلة G1 (E) باكجاتيد وق تبين أن النابضة أولى أسروا غالبية الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تسلسل قراءة الإحصاءات عن عينة نموذجية الزرد. تعيين جودة الإحصاءات القيم مابق ريب (A). (ب) الرسم البياني لتوزيع أحجام إدراج لكل تسلسل القراءات. (ج) يقرأ قراءة الإحصاءات لمجموع القراءات المعينة، التي تحتوي على علامة منخفضة الجودة، يقرأ مع أزواج رسم الخرائط إلى كروموسوم مختلفة (المهرجان زوج لجنة حقوق الإنسان)، يقرأ مع زوج أبعد مسافة عتبة (زوج بعيدة)، وبكر التكرارات. (د) إعداد الممثل من مجموع معين، غير المعينة، ومزاوج على ما يلي: التغطية، وقراءة القرار لتشغيل تسلسل نموذجية من عينة الزرد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الزرد ممثل النسخ المتماثل توقيت النتائج وتدابير مراقبة الجودة- (أ) النسخ المتماثل توقيت على طول ممثل كروموسوم اثنان replicates البيولوجية 28 هبف الأجنة (سيفيرت، 2017). (ب) العلاقة بين قيم توقيت النسخ المتماثل في windows 2 ميغا بايت على طول الكروموسوم الممثل البيولوجية يتطابق 28 هبف الأجنة هو موضح في الشكل 3 ألف. (ج) المجين على صعيد الترابط بين قيم التوقيت النسخ المتماثل البيولوجية (rep1 و rep2) والتجريبية (rep3) replicates 28 هبف الأجنة. خريطة ملونة تمثل معامل الارتباط بيرسون. (د) ترابط تلقائي لبرنامج توقيت ناضجة منظم يعرض ترابط تلقائي عالية على مسافات قريبة الذي يتناقص تدريجيا عبر مسافات أطول تزداد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الزرد توفير نظام نموذجية جديدة وفريدة من نوعها في فيفو لدراسة توقيت تكرار الحمض النووي. عندما يتم تنفيذ ماتينجس موقوت مفصلة في هذا البروتوكول التجريبي، يمكن جمع آلاف أجنة في يوم واحد للتجارب. هذه الأجنة تطوير شكل متزامن من خلال دقة توقيت ووضوح تتسم مراحل التنمية. يمكن تقسيم الزرد بسهولة ودقة مورفولوجيا ستيريوميكروسكوبي، باستخدام أجنة الزرد وتطور خارجياً بصريا واضحة. تفاصيل هذا البروتوكول استخدام الأجنة الزرد لدراسة توقيت النسخ المتماثل في جميع أنحاء تطوير الفقاريات.

وتشمل مجالات البروتوكول الذي قد يقدم مشاكل ضمان التنمية المتزامنة للأجنة الزرد، فقدان الخلايا أثناء إعداد وفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية وإعداد المكتبة. توقيت الزرد التنمية هو درجة الحرارة تعتمد، ولذلك استخدام الزرد تتكيف مع دورات الضوء/الظلام ومقره 28.5 درجة مئوية للتجارب. ولضمان التنمية المتزامنة، أداء دقة توقيت ماتينجس، وجمع الأجنة في إطارات زمنية صغيرة جداً (10 دقيقة أو أقل). من المهم الحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية والتأكد من أنهم يقضون وقتاً أقل في درجة الحرارة المحيطة. توقيت الزرد التنمية أيضا تعتمد اعتماداً كبيرا على كثافة الأجنة في مجال معين. من الأهمية بمكان أن لا بيت في الأجنة في كثافة أعلى من الأجنة 100 كل لوح 10 سم، أو أنها لن تطور بشكل صحيح. الوقت الأمثل لإزالة أجنة ميتة والمخصبة عندما انتقلت إلى مرحلة الخلية 4-16 ويمكن التعرف عليها بسهولة المخصبة (استخدم "مراحل التنمية الجنينية من الزرد"17 كدليل). أجنة ميتة تظهر عادة كالكرات السوداء والأجنة المخصبة تظهر ك 1-الخلية. العمل بأقصى سرعة ممكنة لتقليل الوقت في درجة حرارة الغرفة.

عندما ديتشوريوناتينج الأجنة، من المهم لضمان إزالة جميع تشوريونس من الأجنة. تبقى الأجنة في حل برنس حتى تشوريونس معظم قد تؤتي ثمارها. تجاهل أي الأجنة المتبقية مع تشوريونس سليمة أو إزالة تلك تشوريونس بالملقط. اقتراحا ببطء وسلاسة باستخدام أجنة ماصة. لا "الماصة؛" سريعاً كما سوف تخضع الخلايا لضغوط لا داعي لها ويؤدي فقدان الخلايا. من المهم أيضا عدم استخدام P200 كما يمكن أن يسبب هذا زيادة إجهاد القص الذي ينتج عن كسر خلايا. على العكس من ذلك، قد لا يكون ماصة بلاستيكية نقل صغيرة ما يكفي تتحمل أو توفير ما يكفي إجهاد القص لعرقلة كيس الصفار على نحو كاف وتصنيف الخلايا. يمكن أن تستخدم الماصات البديلة المقدمة تتحمل والقص يكون معادلاً ل P1000 الأمثل.

عند فرز 28 نظام مراقبة الأصول الميدانية هو عدم الحصول على هبف، إذا كانت خلية نمطية دورة الشخصية، وضبط الجهد على الليزر بي بحيث يتركز في ذروة G1 حوالي 50 ك. المكاسب التي تحققت لمنتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب قد تحتاج أيضا إلى تعديلها حيث أن السكان النابضة وخلية يظهر مشابه الرقم 1. إذا كان لا يزال هناك صعوبة، ينبغي أن تحول عامل تصفية ND، وتعديلها لضمان أغلبية الخلايا الفولتية منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب داخل البوابة. فإنه ينبغي أن يكون واضحا سواء كان هناك PI تلطيخ، ستكون هناك مجموعة يقارب الزوجي ل PI-ألف. الرسم البياني ينبغي إظهار اثنين من قمم واضحة وذروة كبيرة في 2N الحمض النووي للخلايا G1 وذروة أصغر في ضعف الكثافة للحمض النووي 4N محتوى خلايا G2/M. إذا كان ذلك لا يزال لم يتم الحصول على أما قد يكون هناك انخفاض عدد خلايا سليمة، والمشاكل مع تلطيخ PI، أو مشاكل في التثبيت والبروتوكول سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل تبعاً لذلك.

خلايا من الأجنة في وقت مبكر (قبل 10 هبف) لن تعطي الملامح النموذجية دورة الخلية، كما أن نسبة عالية من هذه الخلايا يتم في مرحلة ثانية. هذه العينات يمكن أن تعامل كعينات المرحلة S، ومقارنة بمرجع G1 من 24 هبف الأجنة. الأجنة بين 10 هبف و 24 هبف قد تعطي لمحات المتوسطة دورة الخلية ويمكن فرزها إذا رغبت في ذلك. يمكن أيضا تحديد السكان S-المرحلة وفرزها بإدراج النظير thymidine مثل إيدو (5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني) أو بردو (بروموديوكسيوريديني) في نبضات قصيرة قبل التثبيت، ولكن هذا ليس ضروريا لتحديد دقيق توقيت النسخ المتماثل.

ومن الناحية المثالية ينبغي أن تبدأ إعداد مكتبة مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي. نظرياً ~ 300,000 فرز الخلايا سينتج حوالي 1 ميكروغرام للحمض النووي (تقدير ~3.3 جزء من الغرام/النواة)، ومع ذلك، هناك دائماً الخسارة في جميع أنحاء البروتوكول. ينبغي أن تعطي خلايا تم فرزها 500,000 إلى 1 مليون أكثر من 1 ميكروغرام من الحمض النووي. جنينا هبف 24 نموذجي سيكون حوالي 18,000 الخلايا، وسوف يكون 10-15 في المائة منها في مرحلة ثانية. الأجنة في المراحل الأولى من التنمية سيكون أقل الخلايا إلى حد كبير، ولكن سوف يكون أعلى النسب المئوية للخلايا في مرحلة ثانية.

أداء تنقية دقيقة واختيار حجم الخرز المغناطيسي باستخدام أمر حاسم للقضاء على العناصر غير المرغوب فيها من إعداد المكتبة. اتبع إرشادات الشركة المصنعة بعناية والتحسين إضافية قد تكون مطلوبة. عادة كمية صغيرة من PCR dimers ليس مشكلة كبيرة، ولكن سوف تسلسل محول dimers كفاءة عالية حيث أنها ينبغي التقليل. هذا يمكن أن يتحقق بضبط المحول الأولية إلى نسبة الحمض النووي، والقيام بتحديد حجم دقيقة أثناء إعداد المكتبة.

أيضا قد يكون تسلسل واحد في نهاية ملائمة للاحتياجات التجريبية المختلفة. نهاية واحد هو أرخص ويوفر معظم المعلومات المطلوبة نظراً لهذا النهج يعتمد على عد ما يلي؛ ويوفر نهاية الاقتران بقدرة أعلى لإزالة التكرارات البصري وبكر وحل المناطق تسلسلات متكررة والاختلافات الهيكلية الأخرى (وشائعة في الجينوم الزرد). الجزء التحليل أدناه سوف تتناول فقط يقرأ إقران نهاية التسلسل. قد يكون من المناسب أيضا ما يلي تسلسل أقصر. وهذا ستوفر عددا أكبر من القراء بتكلفة أقل، ولكن ما يلي: قد يكون من الأصعب خريطة. الجزء التحليل أدناه هو الأمثل ليقرأ bp 100، وتعديلات قد تكون ضرورية إذا كان يتم استخدام أقصر من طول القراءة.

هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاستخدامات إضافية من طراز الزرد أيضا بسهولة. وقد استخدمت فعلا لتحليل الزرد تيلفين الليفية (زتف الخلايا)، ثقافة خلية الابتدائية خط عزلها من الزرد الكبار تيلفين. دراسة أنواع الخلايا المعزولة من الزرد، يمكن استخدام علامات المحورة وراثيا لتحديد وعزل أنواع الخلايا الفردية قبل التلوين والفرز لمحتوى الحمض النووي. ستكون إحدى الاستراتيجيات المحتملة لاستخدام خط المعدلة وراثيا معربا عن علامة نيون مدفوعة بمروج الأنسجة على حدة، وأن أول عزل الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز، وتابعت التثبيت والفرز لمحتوى الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، قد يسمح استخدام الأصباغ الحمض النووي نفاذية الخلية لعزل واحد من أنواع الخلايا الفردية، فضلا عن السكان المرحلة G1 و S. يمكن تمكين هذه التعديلات على هذا البروتوكول أيضا النسخ المتماثل توقيتها دراسات في نماذج أخرى في فيفو .

إمكانية مثيرة لاستخدام هذا البروتوكول في المستقبل دراسة دور توقيت النسخ المتماثل في المرض. وهناك عدة نماذج السرطان في الزرد، بعضها عفوية وأخرى إيندوسيبلي، التي يمكن استخدامها لتحديد عند حدوث تغييرات في توقيت النسخ المتماثل أثناء أونكوجينيسيس. سيسمح هذا التقييم لتوقيت النسخ المتماثل دور يلعب في التقدم توموريجينيسيس والمرض. وعلاوة على ذلك، الزرد نموذجا رائعا لفحص المخدرات ويمكن استخدامها للتعرف على المخدرات التي تؤثر على تنظيم توقيت النسخ المتماثل، التي تنطوي على إمكانية لاستخدامها في علاج السرطان.

الزرد نموذج جديدة واعدة لدراسة توقيت النسخ المتماثل. هذا البروتوكول سيتيح العديد من الآخرين الفرصة للاستفادة من هذا النموذج في دراسة دور توقيت النسخ المتماثل في التنمية والمرض. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام مع أنظمة النموذج التنموي في فيفو ، مثل melanogaster المورفولوجية والنمو ليفيس، والنتائج التي توصلت إليها إلى الأمام إلى المستقبل نظرة من هذه وغيرها من الكائنات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم "المعاهد الوطنية للصحة" عن طريق المنح 5P20GM103636-02 (بما في ذلك الدعم الأساسي التدفق الخلوي) و 1R01GM121703، فضلا عن جوائز من مركز أوكلاهوما "الخلايا الجذعية من البالغين" البحث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Fisher Scientific P217-500
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
MgSO4 EMD Millipore MMX00701
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
Pronase Sigma 10165921001 protease solution
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D1408
Ethanol (EtOH) KOPTEC V1016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9647-100G
Propidium Iodide (PI) Invitrogen P3566
Tris-HCl Fisher Scientific BP153-500
EDTA Sigma E9844
SDS Santa Cruz sc-24950
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:Chloroform Sigma P3803-100ML
Sodium acetate J.T.Baker 3470
Glycogen Ambion AM9510
RNase A Thermo Scientific EN0531
Quanit-iT Invitrogen Q33130 Reagents for fluorescence-based DNA quantification
Covaris AFA microTUBE Covaris 520045 specialized tube for sonication
Covaris E220 Sonicator Covaris E220 focused ultrasonicator
Agilent 4200 Tapestation Agilent G2991AA automated electrophoresis machine
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 Reagents for automated electrophoresis machine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB Cat#E7370L DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) NEB Cat#E7335S multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) NEB Cat#E7500S additional multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina NEB E7630L quantification kit for library preparation
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 magnetic beads
Illumina HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 next generation DNA sequencing platform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm VWR 89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 VWR 89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color Denville Scientific C2170 (1001002) Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2 Scientific Industries SI-0236
Wash Bottles VWR 16650-022 Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer VWR 470092-440 6.9 cm, fine mesh
Corssing tank Aquaneering ZHCT100 individual breeding tank
iSpawn Techniplast N/A large breeding tank
FACSAria II BD biosciences N/A cell sorting machine
Wild M5a steromicroscope Wild Heerbrugg N/A dissecting microscope
Qubit 3 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration
Matlab Mathworks version 2017a
Matlab Statistics Toolbox Mathworks version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox Mathworks version 3.5.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  4. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
  5. Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
  6. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  7. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  8. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  9. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  10. Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
  11. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  14. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  15. Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
  16. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).

Tags

علم الوراثة، العدد 134، تكرار الحمض النووي، والنسخ المتماثل توقيتها، الزرد، المجراة في، التنمية، النسخ، الكروماتين، تسلسل الجيل القادم، الاختلافات عدد النسخ، والطفرات، والسرطان، ونظام مراقبة الأصول الميدانية
التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي <em>في فيفو</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siefert, J. C., Clowdus, E. A.,… More

Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Goins, D., Koren, A., Sansam, C. L. Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System. J. Vis. Exp. (134), e57146, doi:10.3791/57146 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter