Summary
Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.
Abstract
DNA 복제 타이밍은 중요 한 세포 특성, 전시 chromatin 구조, 전사, 및 DNA 돌연변이 속도와 중요 한 관계 이다. 복제 타이밍에 변화가 개발 과정 및 암, 하지만 역할 복제 타이밍 개발에서 활약 하 고 질병 알려져 있지 않다. Zebrafish 최근 연구 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 설립 되었다. 여기 상세한 DNA 복제 타이밍을 결정 하는 제 브라를 사용 하기 위한 프로토콜. 성인 zebrafish 태아에서 셀 정렬 후 다음 세대 시퀀싱 데이터의 분석을 통해 DNA 복사본 수에 변화를 확인 하 여 고해상도 게놈 전체 DNA 복제 타이밍 패턴을 생성할 수 있습니다. Zebrafish 모델 시스템은 개별 세포 유형, 질병 모델, 또는 돌연변이 라인에 변화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 개발, 걸쳐 vivo에서 발생 하는 복제 타이밍 변경의 평가 대 한 수 있습니다. 이러한 방법을 개발 하는 동안 메커니즘 및 복제 타이밍 설립 및 유지 보수의 결정 요인 조사 연구 하면, 역할 복제 타이밍 돌연변이 tumorigenesis, 및 perturbing의 효과 개발 및 질병에 복제 타이밍입니다.
Introduction
셀 분할 성공적으로, 그들은 먼저 정확 하 고 충실 하 게 복제 해야 그들의 전체 게놈입니다. 게놈 복제 재현할 패턴, DNA 복제 타이밍 프로그램1에서 발생 합니다. DNA 복제 타이밍 chromatin 조직, 후 성적인 부호 및 유전자 식2,3와 상관 된다. 복제 타이밍에 변화 개발, 걸쳐 발생 되며 크게 transcriptional 관련된 프로그램 및 변경 chromatin 마크와 조직4,5. 또한, 복제 타이밍 mutational 주파수와 상관 및 타이밍에서 변경 다양 한 유형의 암6,7,8에서 관찰 된다. 이러한 관측에도 불구 하 고 메커니즘 및 복제 타이밍 설립 및 규정의 결정 요인 여전히 크게 알려지지 않은, 하 고 개발에서 재생 역할 질병 결정 됩니다. 또한, 최근 게놈 넓은 복제까지 타이밍 척추 개발에 걸쳐 발생 하는 변화 했다만 되어 검사 셀 문화 모델에.
Zebrafish, Danio rerio는 개발 하는 동안 복제 타이밍에서 vivo에서 공부 하는 데 적합 한 짝짓기 쌍 포유류 개발9, 많은 유사점을 빠르게 개발 하는 배아의 수백의 얻을 수 있습니다. 10. 또한, zebrafish 개발에 걸쳐 세포 주기, chromatin 조직과 DNA 복제 타이밍11관계를 공유 하는 transcriptional 프로그램에 변화가 있다. Zebrafish는 또한 우수한 유전자 모델 그들은 특히 순종 transgenesis, mutagenesis, 그리고 타겟된 돌연변이, 조작 하 고 유전 스크린 척 추가 있는 발전12에 필요한 많은 유전자를 확인 했다. 따라서, zebrafish 복제 타이밍 설립 및 유지 보수에 관련 된 유전자를 식별 하 고 deregulating 척추 개발에 복제 타이밍의 효과 관찰을 사용할 수 있습니다. 유전자 변형 라인 복제 타이밍 개별 셀 형식 다른 발달 timepoints 또는 질병 조건에서 고립에서 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 인간 질병 질병 형성 및 진행9,,1314복제 타이밍의 역할을 조사 하는 데 사용할 수의 다양 한 zebrafish 모델 있다.
최근, 첫 번째 복제 타이밍 프로필 zebrafish, 복제 vivo에서15시간을 공부 하는 모델 시스템으로 수립에서 생성 되었습니다. 이 위해 세포는 성인 제 브라에서 고립 된 셀 형식 및 개발의 여러 단계에서 zebrafish 태아에서 수집 되었다. 셀은 다음 FACS (형광 활성화 된 세포 분류) DNA 내용에 따라 g 1과 S 단계 인구를 분리 하 여 정렬 됩니다. G 1 샘플을 사용 하 여 복사 번호 컨트롤로 복사 번호 유사 S 단계 인구에서 결정 되었고 상대 복제 타이밍16를 유추 하는 데 사용. 복제 타이밍에 있는 변화 다음 비교 될 수 있다 직접 다른 발달 샘플 및 세포 유형 사이 고이 비보에 척추 개발에 걸쳐 발생 하는 복제 타이밍에 변화를 결정 하는 데 사용 되었다. 이 방법은 제공 합니다 다른 게놈 방법에 비해 몇 가지 장점을 주로 티 미 딘 아날로그 또는 DNA4,6의 immunoprecipitation로 필요 하지 않습니다 그.
여기 상세한 프로필 게놈 전체 DNA 복제에서 타이밍에 프로토콜 zebrafish에 고해상도. 이러한 프로토콜 zebrafish 게놈으로 개발 하는 동안 발생 하는 이러한 관계에 변화를 프로 파일링에서 게놈 그리고 후 성적인 기능 관계를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 프로토콜은 또한 쉽게 복제 타이밍 zebrafish의 돌연변이 체 긴장 및 질병 모델에에서 변화를 공부에 적응 됩니다. 또한이 메서드는 첫 번째는 제 브라에서 개별 셀 유형을 밖으로 정렬 하 여 특정 세포 유형에서 복제 타이밍을 연구에 따라 확장 될 수 있는 토대를 제공 합니다. Zebrafish는 우수한 vivo에서 모델 시스템으로 복제 타이밍을 공부 하 고 궁극적으로 중요 한이 후 성적인 특성의 생물 학적 기능을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물은 오클라호마 의료 연구 재단 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 처리 합니다.
1. 성인 zebrafish 번 식에 대 한 설정
- 단일 스트레인의 성인 남성과 여성의 zebrafish의 대형 코 호트를 사용 하 여 번 식. 심지어 단일 스트레인의 zebrafish의 유전 메이크업에 있는 작은 차이, 큰 코 호트를 사용 하 여 결과 인구의 유전 가변성의 인구의 작은 부분 집합에 제한 되지 않도록.
- 배아는 수집 전에 밤 사육 탱크에 수십 번 식 성인, 수 컷과 암컷의 약 동일한 번호를 사용 하 여. 실험에 따라 다음 번 식 전략 중 하나를 사용 합니다.
- 번 식 전략 1: 개별 사육 탱크에 몇 남성과 여성의 zebrafish, 분배기와 여성에서 남성을 분리. 이 접근을 사용 하는 경우 많은 다른 사육 탱크를 설치 하 고 생물 다양성은 인구의 대표 되도록 각 배아 수영장.
- 번 식 전략 2: 큰 사육 탱크에 남성과 여성의 zebrafish의 수십을 결합. 이 전략을 사용 하 여 배아의 충분히 큰 수 있다, 그것은 그들의 창시자 인구의 따라서 유전자 대표 다양 한에서 온 가정 하는 합리적.
2. 초과 matings-수집, 정렬 및 zebrafish 태아 실험 주택
- 시작 하자마자 빛 주기는 아침에 있는 시간 초과 matings를 수행 합니다. 하룻밤 사이 생성 된 모든 배아를 폐기.
- 배아를 통해 탈출에 대 한 거짓 바닥 10 분 동안 얕은 물 (3-5 cm)에 사육 하는 물고기를 허용 합니다.
- 10 분 후 스 트레이너를 통해 쏟아지는 고 세척 병으로 10 cm 격판덮개로 rinsing 하 여 배아를 수집 합니다. 수영장 같은 시간 지점에서 모든 배아 수집 수집, 및 28.5 ° c.에 인큐베이터에서 즉시의 시간으로 표시
- 배아의 수백 하루에 단일 짝짓기 쌍에서 예상 될 수 있다. 성인 10 분 사이클까지 얻은 배아의 수를 미만 20 번 식을 허용 합니다.
- 컬렉션, 죽음과 unfertilized 배아를 제거 하려면 정렬 배아 후 약 1-1.5 h. 배아를 정렬 하려면 인큐베이터에서 제거 하 고 해 현미경으로 관찰 합니다.
- 배아를 계산 하 고 10 cm 접시 당 100 배아의 밀도에 장소.
- 신선한 E3 매체 (5 m m NaCl, 0.17 m m KCl, 0.33 m m CaCl2, 0.33 m m MgSO4)을 추가 하 고 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 반환.
3. Dechorionate, deyolk, 그리고 zebrafish 태아를 수정
참고:이 섹션은 프로토콜의 48 h 게시물 수정 (hpf) 이전 배아에 대 한 설계 되었습니다. 개발의 나중 단계에서 배아의 chorions 제거 필요가 없습니다 (48 후 hpf), 그들은 종종 자연스럽 게 떨어지. 필요가 없습니다 deyolk 또는 제거는 chorions 물고기 이전 5 일 게시물 수정 (dpf).
- 배아 원하는 발달 연령에 도달, "단계의 배아 개발의는 제 브라"17에 따라 가벼운 현미경 형태학 상으로 개발의 적절 한 단계를 확인 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브에 1500 무대 배아를 전송 하 고 e 3로 여러 번 씻어.
- E 3의 1 mL 및 모든 100 배아에 대 한 나 솔루션 (30 mg/mL)의 20 µ L을 추가 하 고 부드럽게 소용돌이. 1500 배아까지 e 3의 15 mL 단일 튜브에 dechorionated 일 수 있다.
- 튜브의 측면에 누워 볼륨 비율 최대 표면 되도록도 계층에 배아를 배열 한다. 부드럽게 튜브 배아에서 떨어진 모든 chorions까지 모든 2-3 분 교 반 하십시오. 총 dechorionation 시간 나 활동에 따라 달라 집니다.
- 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 씻어 3 번 e 3의 10 mL와 배아. 프로토콜의이 섹션의 나머지 부분에 대 한 얼음에 배아를 놓습니다.
- E 3를 제거 하 고 씻어 갓 준비 얼음 deyolking 버퍼와 배아 (칼슘 없이 Ginzburg 물고기 벨의 솔루션 x 0.5: 55 m m NaCl, 1.8 m m KCl, 1.25 m m NaHCO3).
- 최대 500 개의 배아에 대 한 차가운 deyolking 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
- P1000를 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 배아를 위아래로 5-10 회를 노 른 자 자루를 방해.
- 1.5 mL microfuge 관을 5 분 동안 500 x g 4 ° C에서 원심 분리기 1 mL를 전송 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 1 x PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7.0) 벨의 솔루션을 제거 하려면 1 mL로 세척 하 고 표면에 뜨는 펠 릿을 제거 합니다. 4 ° C에서 원심 분리기 그리고 5 분 동안 500 x g.
- 신중 하 게 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 1 mL에 셀. 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 15 mL 원뿔 튜브를 얼음 처럼 차가운 에탄올 (EtOH) 3 mL를 추가 합니다. 낮은 설정에 부드럽게 EtOH의 소용돌이 관.
- 부드럽게 P1000, 천천히 (초당 1 방울) 물방울 zebrafish 태아 세포 현 탁 액 EtOH에 vortexing 동안를 사용 하 여.
- 배아 세포 현 탁 액, 75%의 최종 고정 솔루션에 대 한의 1 mL의 총 추가 EtOH.
- 셀의 1 mL 후 서 스 펜 션 추가 되었습니다, 부드럽게 혼합 하 고 적어도 1 시간 동안-20 ° C에 소용돌이 관. 볼륨 비율 최대 표면을 고 태아와 함께 하는 셀의 수를 줄이기 위해 그들의 편에서 튜브를 배치 하는 것이 좋습니다. 2-3 주 동안-20 ° C에서 배아 세포를 저장 합니다.
4. 얼룩이 DNA 및 FACS 배아를 정렬
참고:이 섹션은 프로토콜의는 1 dpf에서 태아에 대 한 설계 되었습니다.
- -20 ° C와 5 분 동안 4 ° C 1500 x g에서 원심 분리기에서 EtOH 고정 배아 세포를 제거 합니다.
- 얼음에 신중 하 게 제거 상쾌한 튜브를 배치 합니다. 갓된 차가운 PBS-BSA (1 x PBS, 1% 소 혈 청 알 부 민)의 1 mL에 셀 resuspend 부드럽게 한 P1000 사용 하 여.
- 4 ° C와 5 분 동안 1500 x g 세포를 원심 고 얼음에 놓습니다.
- 제거 상쾌한 및 resuspend 셀 propidium 요오드 화물 (PI)에 얼룩이 솔루션 (50 µ g/mL PI, 100 µ g/mL RNase A, PBS, pH 7.0), 200 µ L를 사용 하 여 모든 1000 배아에 대 한.
- 얼음에 30 분 마다 5 분을 부드럽게 혼합 PI 솔루션에서 품 어를 셀 수 있습니다.
- 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에 40 µ m 나일론 셀 여과기를 놓습니다. 부드럽게 혼합 하 고 메시를 통해 필터링 셀 플라스틱.
참고: 여러 개의 튜브 같은 timepoint에서 배아의 프로토콜의 섹션 3에서에서 수집 된 경우 결합이 배아가 시점에서 그들은 모두 함께 정렬 있도록. - 메쉬 셀의 모든 나머지 덩어리 중단 부드럽게 주사기 플런저의 끝 내부 평면을 사용 하 여.
- 모든 1000 배아에 대 한 차가운 PBS-BSA의 500 µ L로 필터를 통해 세포를 씻어.
- 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 40 µ m 메쉬를 놓고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브에서 두 번째 시간을 필터링 합니다.
- 악기를 정렬 하는 적절 한 셀을 사용 하 여 레이저 여기 561-및 방출 감지 610/20 propidium 요오드 화물 검색을 설정 합니다.
- Vortexing와 4 ° c.에 악기에 의해 짧게 스테인드 셀의 혼합 15 mL 튜브
- 셀 느린 흐름에 속도, 이상적으로 1.0 mL/min, 깨끗 한 세포 주기 프로필을 가져올 하 고 g 1를 혼합 하지 마십시오 또는 S와 G2/M 세포 인구 단계를 실행 합니다.
- 첫째, FSC-A x SSC에 대 한 게이트-는 (앞으로 피해 지역 측면 분산형 지역) 파편 (그림 1A)를 제거 하.
참고: 세포는 배아에서 무대와 셀 유형에 따라 크기 변화 수 있습니다. 중간 농도 (ND) 필터는 1.0 및 현재 셀의 크기에 따라 1.5 사이 전환 될 필요가 있습니다. 대부분의 세포를 수집 파편을 제거 하는 큰 지역 게이트 - PI-지역 (PI-A), 파편 및 셀 남자 (그림 1B)를 제거 하 여 SSC-지역 (SSC-A)에 대 한 두 번째, 게이트.
- 셋째, 대 한 게이트 SSC-A SSC-W (폭) 모든 나머지 셀 남자 (그림 1C)을 제거 하 여.
- Y 축과 propidium 요오드 화물 지역에 셀 번호 (카운트) 히스토그램에 문이 인구를 표시 (PI-A)는 x 축에. 24 hpf 배아에 대 한이 그림 1D처럼 틀에 박힌 세포 주기 프로필을 주어 야 한다.
- S 단계 인구를 정렬 하려면 최소한의 양의 g 1과 g 2 인구를 포함 하 여 g 2 피크의 왼쪽 게이트 g 1의 오른쪽에서 설정 합니다. 24 hpf 배아에 대 한이 일반적으로 문이 인구의 약 10-15%를 구성 된다 ( 그림 1D참조).
- G 1 인구를 정렬 하려면 g 1 피크 피크의 상단을 통과 하는 하지의 왼쪽에는 게이트를 설정 합니다. 조정 가능한 좁은 G1 게이트의 폭 ( 그림 1D참조).
- 다시 g 1과 S 단계 인구 적절 한 초기 제어 (그림 1E) 되도록 합니다.
- G 1과 S 단계 인구 3 mL 15 mL 원뿔 튜브에 PBS BSA의 정렬. 목표는 분수 (g 1과 S 단계) 당 500, 000 그리고 1 백만 이상의 정렬된 셀 사이 해야 합니다.
- 정렬이 완료 되 면, 1500 g x와 10 분 동안 4 ° C 원심 분리기 튜브 합니다.
참고: 작은 셀 펠 릿 어려운 볼 수 있을 것입니다 그리고 그것을 방해 하지 않도록, 그래서 사용 선호 진동 물통 회전자 고정 각도 터를 통해 하는 것이 중요 하다. - 신중 하 게 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 1 mL와 펠 릿. 1.5 mL microfuge 관을 원심 분리기에서 6000 x g와 4 ° C 5 분에 대 한 셀을 전송 합니다.
- 조심 스럽게 튜브에서 모든 액체를 제거 하 고 동결 건조 펠 릿-20 ° c.에 2-3 주 동안-20 ° C에서 펠 릿을 저장 합니다.
5. DNA 고립과 RNase 처리, DNA 정화
- -20 ° C와 얼음에 장소에서 셀 펠 릿을 제거 합니다.
- SDS 버퍼 (50 mM Tris HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.5 %SDS) 펠 렛 및 resuspend의 400 µ L를 추가 합니다.
- 가수분해 K 0.2 mg/mL의 최종 농도에 추가 하 고 vortexing에 의해 짧게 혼합.
- 2 h, 소용돌이 매 15 분을 위한 56 ° C에서 샘플을 품 어.
- 2 시간 후 페 놀-클로 프롬 추출 (페 놀: 클로 프롬: Isoamyl 알콜 25:24:1, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA와 포화) 페 놀을 클로 프롬의 400 µ L을 추가 하 여 수행 합니다.
- 16000 x g 단계 구분을 5 분에서 20 및 원심 분리기 샘플 소용돌이.
- 조심 스럽게 위 수성 단계 (400 µ L) 및 1.5 mL 튜브에 제거.
- EtOH 강수량 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2), 2 µ L의 glycogen, 그리고 1 mL EtOH 40 µ L을 추가 하 여 수행 합니다.
- 철저 하 게 혼합 하 여-20 ° C 하룻밤 DNA를 침전에 소용돌이. 샘플-80 ° C에 또는 1 시간을 위한 드라이 아이스에 또한 침전 수 있습니다.
- 4 ° C와 30 분 펠 릿 DNA 16000 x g에서 원심 분리기 샘플.
- 1 mL 70%와 함께 폐기 세척 하 고 표면에 뜨는 펠 릿 EtOH. 4 ° C에서 원심 분리기 그리고 5 분 동안 16000 x g.
- 2-3 분에 대 한 주위 온도에 표면에 뜨는 고 air-dry 펠 릿을 삭제 합니다.
- 압력가 마로 소독 물 96 µ L에 펠 릿을 녹이 고 4 µ L의 RNase A (2 mg/mL) 추가.
- Vortexing에 의해 잘 혼합 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 페 놀-클로 프롬 추출 단계 5.2.1-5.2.2에서에서 페 놀-클로 프롬 및 다음 절차의 100 µ L을 추가 하 여 수행 합니다.
- EtOH 강수량 3 M 나트륨 아세테이트, 1 µ L glycogen, 그리고 EtOH와 절차 단계 5.3.1-5.3.5에에서 따라 250 µ L의 추가 10 µ L을 수행 합니다.
- TE 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH8.0))의 60 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 양적 형광 기반 방법을 사용 하 여 DNA 농도 결정 합니다. -20 ° c.에 DNA가
참고: 그것은 DNA DNA 바인딩 형광 기반 염료, 또는 자외선 분 광 계 기반 방법 보다 더 신뢰할 수 있는 다른 수단을 사용 하 여 계량 하는 것이 중요.
6. DNA 라이브러리 및 다음 세대 시퀀싱 준비
참고: G1 복사 번호 참조 샘플 각 생물 소스는 각 시퀀싱 실행 (즉, WT, 돌연변이, 유전자 변형, 세포 선, 등)에 대 한 필요 합니다. 같은 g 1은 참조를 실행 하는 동일한 시퀀싱에 동일한 생물학 소스에서 모든 S 단계 샘플을 비교 합니다. 샘플 간의 일관성을 보장 하기 위해 각 샘플의 실행된 2 생물 복제 합니다.
- 1 µ g의 DNA 50 µ L 쥡니다 위한 특수 튜브에 최종 볼륨을 희석.
- 제조업체의 사양 및 프로토콜에 따라 초점 을된 ultrasonicator에 250-300 bp의 대상에 대 한 게놈 DNA 전단
- 제조업체의 사양 및 프로토콜에 따라 자동화 된 전기 기계를 사용 하 여 전단된 genomic DNA의 품질 및 크기를 확인 합니다. 확인 ~ 250-300의 큰 피크 깎된 genomic DNA에 대 한 혈압.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱 Illumina 플랫폼에 대 한 다중 oligos을 DNA 도서관 준비 키트를 사용 하 여 시퀀싱 라이브러리를 준비 합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 자동화 된 전기 기계를 사용 하 여 라이브러리 준비의 품질을 확인 합니다. 400 ~ 450의 큰 피크 확인 혈압, 있다 뇌관 이합체 (80-85 bp)와 어댑터 이합체에 대 한 최소한의 봉우리 (~ 120 bp).
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 다음-세대 DNA 연속을 위한 DNA 도서관 정량화 키트를 사용 하 여 라이브러리를 계량.
- 라이브러리 5 nM와 결합의 농도의 희석 15 µ L로 고유 하 게 원하는 달성 하는 데 필요한 라이브러리를 다중화 매핑 읽기 샘플 당 수.
참고: 샘플 당 고유 매핑 읽기 수 해상도 결정 합니다. 사용 최소 5 백만 매핑된 zebrafish 게놈에 대 한 복제 타이밍을 평가 하기 위해 읽습니다. 10-20 백만 읽기로 시작 하는 것이 좋습니다. - 제조업체의 지침에 따라 다음 세대 시퀀싱 플랫폼에 샘플의 100 쌍-엔드 bp 전체 게놈 DNA 시퀀싱을 수행 합니다.
7입니다. 시퀀싱 데이터의 분석
참고:이 섹션의 지침 분석에 대 한 지침으로 위한 것입니다. 추가 메서드를 사용 하 여 시퀀싱 정렬, 필터링, 처리, 등등. 이 섹션은 프로토콜의이 작품에서 분석의 기본 방법으로 처리 됩니다. 추가 메서드를 사용 하는 경우 매개 변수 및 그 목적에 맞게 기능 조정 합니다. 아래 명령은 설치 적절 한 패키지와 함께 Ubutnu 또는 맥 터미널에 입력 됩니다.
- Zebrafish 게놈의 최신 버전 얻기 (danRer10,이 프로토콜 작성 때 기준) 다음 명령을 사용 하 여 UCSC 게놈 브라우저에서:
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- 다음 명령 사용 하 여 fa.gz 파일을 압축 해제:
gunzip danRer10.fa.gz - BWA mem 다음 명령을 사용 하 여를 사용 하 여 게놈 시퀀싱 데이터 정렬:
bwa mem t-8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- 다음 명령 사용 하 여 fa.gz 파일을 압축 해제:
- .Sam 파일 samtools 다음 명령을 사용 하 여.bam 파일을 변환:
samtools 볼-bS input.sam > output.bam- Samtools 다음 명령을 사용 하 여 정렬 된 시퀀스 파일 정렬:
samtools 정렬 output.bam > output_sorted.bam - Samtools 다음 명령을 사용 하 여.bam 파일을 색인:
samtools 인덱스 output.bam
- Samtools 다음 명령을 사용 하 여 정렬 된 시퀀스 파일 정렬:
- 다음 명령을 사용 하 여 피와 함께 마크 PCR 중복:
자바-Xmx2g-picard.jar MarkDuplicates jar \
INPUT=input.bam
OUTPUT=output.bam
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - 다음 명령을 사용 하 여 각 염색체에 대 한 읽기의 텍스트 (.txt) 파일을 생성:
나에 (1.25); CHROM 할 "chr" $i; = 에코 $CHROM; samtools 보기 input.bam $CHROM | -f 2,4,5,7,8,9 컷 > readsChr$ {i}.txt; 완료
참고: 열 결과.txt 파일에는 플래그, 위치, mapQ, 쌍 chr, 쌍 위치 및 조각 크기, 각각. - Matlab (또는 기타 유사한 소프트웨어) textscan 함수를 사용 하 여.txt 파일을 읽을.
- 30의 mapQ 임계값을 설정 하 여 낮은 매핑 품질 읽기를 필터링 하십시오.
- 읽기 플래그와 하지 기본 정렬, PCR 중복 또는 다른 염색체 쌍 매핑을 제거 합니다.
- 모든 읽기 2000 bp의 거리 임계값을 넘어 그들의 쌍을 필터링.
- 평가 결과 읽기 읽기 통계, 범위, 삽입 크기 및 품질 (그림 2)의 수를 결정 하는 통계.
- 각 염색체의 길이 걸쳐 읽기 100 bp 간격에서의 수를 계산 하 여 각 샘플에 대 한 100 bp 고정 윈도우에서 읽기 범위를 결정 합니다.
- 평균 읽기 모든 창에 대 한 수를 계산 합니다.
- 중간에서 5 표준 편차 보다 큰 윈도우를 제거 하 여 높은 범위의 영역을 필터링.
- 슬라이딩 윈도우를 사용 하 여 200 읽기와 함께 각 염색체에 따라서 세그먼트를 찾는 하 여 g 1 참조 샘플에 분석에 대 한 영역을 정의 합니다.
- 200-읽기 개수 창 동반 g 1 참조에 대 한 정의에서 S 단계 읽기의 수를 계산 하 여 각 S 단계 샘플에서 읽기 깊이 결정 합니다.
- 10-16의 보간 계수 (p)와 소프트웨어에서 csaps 함수를 사용 하 여 원시 데이터를 부드럽게.
- 0의 평균 및 표준 편차 1의 z-점수를 반반 하 게 데이터를 정상화.
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Representative Results
게시 된 복제 타이밍 데이터를 사용 하 여 대표 복제 타이밍 프로필 및 품질 관리 측정은15을 제공 됩니다. 처리의 초기 단계는 게놈, 읽기 길이 및 게놈 검사 통계, 계산 및 낮은 품질, 짝이 없는, 필터링 및 PCR 중복 읽기를 시퀀싱 데이터 정렬 포함. 전형적인 zebrafish 연속 샘플에 대 한 읽기 통계는 그림 2에 표시 됩니다. 필터링 후 읽기 카운트 변수 크기의 창과 데이터에서 결정 됩니다 부드럽게 하 고 정상화. 생물 복제에 대 한 대표적인 zebrafish 염색체의 일반적인 부드럽게/정규화 복제 타이밍 프로필 그림 3A에 표시 됩니다. 생물학 및 실험 복제에 대 한 프로필 시각적으로 매우 유사한 ( 그림 3A참조) 하 고 또한 염색체 (그림 3B)의 길이 따라 높은 상관 관계를 표시 해야 합니다. 그들은 또한 타이밍 값 게놈 넓은 (그림 3C) 사이의 높은 상관 관계를 표시 한다. 상관, 패턴 연속성을 평가 하는 방법 구조 데이터 세트 (그림 3D)의 정도 평가 하기 위해 사용 되어야 한다. 성숙한 타이밍 구조적된 프로그램의 상관 짧은 거리에서 높은 것 하 고 점차적으로 거리 증가 감소 해야 합니다. 생물학 및 실험 사이 높은 재현성을 보여 주는 샘플 복제 그리고 강한 상관 신호 고품질 샘플으로 간주 하 고 더 높은 범위 샘플을 얻기 위해 결합 될 수 있다.
그림 1: 복제 타이밍 분석을 위한 zebrafish 태아 정렬. (A) 문이 앞으로 피해 지역에 대 한 정렬 하는 모든 셀의 인구 (FSC-A) 측 피해 지역 (SSC-A). 색상은 빨강-녹색-파랑에서 배열 하는 색깔에 의해 대표 하는 높은-낮은 밀도와 점 플롯에 쓰레기통의 밀도를 나타냅니다. (B) 문이 정렬 문이 FSC x SSC 세포의 인구 propidium 요오드 화물 지역으로 SSC-A (PI-A). (C) 정렬 문이 파이 셀 x SSC의 인구 문이 SSC-A 사이드 분산형 폭 (SSC-W). (D) 히스토그램 표시 하는 틀에 박힌 세포 주기 프로필 모든 문이 인구의. 정렬 게이트 g 1과 S 단계에서 셀 음영 회색으로 표시 됩니다에 대 한 블랙 라인 박스. (E) Backgated g 1과 S 단계 인구는 세포의 대부분을 점령 초기 게이팅 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시퀀싱 전형적인 zebrafish 샘플에 대 한 통계를 읽고. (A) 립 mapQ 값의 통계에서 품질을 매핑. (B) 모든 시퀀싱에 대 한 삽입 크기 분포의 히스토그램을 읽습니다. (C) 총 매핑된 읽기, 읽기 통계 읽고 낮은 품질 플래그를 포함 하는 다른 염색체를 쌍 읽습니다 (쌍 diff chr), 거리 임계값 (먼 쌍), 그리고 PCR 중복 넘어 쌍으로 읽습니다. 총의 (D) 대표 번호, 매핑되지 않은와 짝이 없는 읽기, 적용, 매핑되고 zebrafish 샘플의 일반적인 시퀀싱 실행에 대 한 해상도 읽을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 zebrafish 복제 타이밍 결과 및 품질 관리 조치. (A) 복제 28 hpf 배아 (Siefert, 2017)의 두 생물 학적 복제에 대 한 염색체는 담당자의 길이 따라 타이밍. 생물학에 대 한 대표적인 염색체의 길이 따라 2 Mb windows에 복제 타이밍 값 사이의 상관 관계 (B) 그림 3A에서 28 hpf 배아의 복제 합니다. (C) 게놈 넓은 28 hpf 배아의 실험 (rep3) 복제 생물 (rep1 및 rep2)에 대 한 복제 타이밍 값 사이 상관 관계가. 컬러 지도 Pearson의 상관 계수를 나타냅니다. 구조화 된 성숙한 타이밍 프로그램 (D) 상관 점점 더 긴 거리를 통해 점차적으로 감소 하는 가까운 거리에서 높은 상관을 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Zebrafish는 새롭고 독특한 vivo에서 모델 시스템 공부 DNA 복제 타이밍을 제공 합니다. 타임된 matings로 수행 되는 때이 실험 프로토콜에 자세히, 배아의 수천을 수집할 수 있습니다에 실험에 대 한 하루. 이러한 배아 동기적으로 정확 하 게 초과 하 고 분명히 특징이 개발의 단계를 통해 개발. 제 브라 수 있습니다 쉽고 정확 하 게 준비 zebrafish 태아 외부에서 개발 하 고 광학 투명 한 stereomicroscope를 사용 하 여 형태학에 의해. 이 프로토콜 척추 개발에 걸쳐 복제 타이밍 공부 zebrafish 태아의 사용을 자세히 설명 합니다.
문제가 발생할 수 있습니다 프로토콜의 지역 동기 개발 zebrafish 태아의 준비, FACS 정렬 및 라이브러리 준비 하는 동안 세포의 손실을 보장 포함 됩니다. Zebrafish 개발의 타이밍은 온도 의존, 따라서 사용 zebrafish 명암 주기를 적응 및 실험을 위한 28.5 ° C에서 지 내게. 동기 개발을 보장 하기 위해, 초과 matings 정확 하 게 수행 하 고 아주 작은 시간 창에서 배아를 수집 (10 분 이내). 배아 28.5 ° C에서 유지 하 고 그들은 주위 온도에 최소한의 시간을 확인 하기 긴요 하다. Zebrafish 개발의 타이밍은 또한 매우 특정된 지역에서 배아의 밀도에 의존. 그것은 중요 하지 집 배아 10 cm 접시 당 100 배아 보다 더 높은 밀도에서 또는 그들은 제대로 개발 하지 않습니다. 죽음과 unfertilized 배아를 제거 하는 최적의 시간 때 그들은 4-16 셀 단계에 진행 하 고 수정된 (사용 "단계의 배아 개발의는 제 브라"17 가이드로) 쉽게 식별 될 수 있습니다. 죽은 태아는 일반적으로 검은 공을으로 나타나고 unfertilized 배아 1 셀으로 표시 됩니다. 주위 온도에 시간을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 작동 합니다.
때 dechorionating 배아, 그것은 모든 chorions는 태아에서 제거 되도록 해야 합니다. 대부분의 chorions 온 때까지 배아 나 솔루션에 유지. 그대로 chorions와 모든 잔여 배아를 폐기 하거나 집게로 그들의 chorions를 제거 합니다. 배아는 느리고 부드러운 모션을 사용 하 여 플라스틱 마십시오 하지 플라스틱 급속 하 게로 그것은 과도 한 스트레스와 셀의 손실에 결과 셀을 적용 됩니다. 그것은 또한 중요 하지 않습니다는 p 200을 사용 하 여이 셀의 파손 결과 증가 전단 응력을 발생할 수 있습니다. 반대로, 플라스틱 전송 피 펫에는 충분히 작은 구멍 또는 충분 한 전단 응력을 적절 하 게 노 른 자 자루를 방해 하 고 세포를 세분화를 제공 할 수 없습니다. 다른 펫은 구멍을 제공 하는 사용할 수 하 고 전단 최적의 P1000에 해당 될 것 이다.
때 28 정렬 FACS hpf, 틀에 박힌 세포 주기 프로 파일 하는 경우는 취득 하지, g 1은 피크는 약 50 K를 중심으로 PI 레이저에 전압 조정. FSC 그리고 SSC에 대 한 이익 또한 게이팅 및 셀 인구 그림 1과 유사한 표시 되도록 조정할 수 필요가 있습니다. 어려움은 여전히, ND 필터 전환 한다, 그리고 세포의 대다수를 위해 조정 하는 FSC 그리고 SSC 전압은 게이트 내. 그것은 PI 얼룩 인지 거기 PI-a 복식에 근접 하는 범위 있을 것입니다 분명해 야 합니다. 히스토그램 표시 합니다 두 분명 봉우리, G1 셀 2N DNA에 큰 피크와 두 배 강렬에 작은 피크 4N DNA에 대 한 G2/M 세포의 콘텐츠. 이것은 아직 얻지도 낮은 수가 그대로 셀, PI 얼룩과 문제 또는 고정에 문제가 있을 수 있습니다 그리고 프로토콜 따라 최적화가 필요 합니다.
초기 배아에서 세포 (10 이전 hpf) S 단계에서 이러한 셀의 높은 백분율은 전형적인 세포 주기 프로필을 제공 하지 것입니다. 이러한 샘플 S 단계 샘플으로 처리 하 고 24 hpf 배아에서 G1 참조에 비해 수 있습니다. 10 사이 배아 hpf 24 hpf 중간 세포 주기 프로필을 줄 수 있고 원하는 경우 정렬할 수 있습니다. 그러나, 이것의 정확한 확인을 위해 필요 하지 않습니다, 그리고 S 상 인구 수 또한 확인 하 고 고정 하기 전에 짧은 펄스에 티 미 딘 아날로그 듀 (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) BrdU (Bromodeoxyuridine) 등을 통합 하 여 정렬 복제 타이밍입니다.
이상적으로 1 µ g의 DNA와 라이브러리 준비를 시작 한다. 그러나 이론적으로 ~ 300000 정렬된 셀 (~3.3 pg/핵 추정) 약 1 µ g의 DNA 얻을 것 이다,, 거기는 항상 프로토콜을 통해 손실. 500000 1 백만 정렬된 셀 이상 1 µ g의 DNA 주어 야 한다. 전형적인 24 hpf 배아 약 18000 셀, 10-15%는 S 단계에 있을 것입니다 해야한다. 배아 개발의 초기 단계에서 상당히 적은 셀, 하지만 S 단계에서 세포의 더 높은 백분율을 있을 것 이다.
정확한 정화 및 크기 선택 마그네틱 비즈를 사용 하 여 수행 하는 것은 라이브러리 준비에서 원치 않는 요소를 제거 하기 위해 중요 합니다. 제조업체의 지침을 따르십시오 그리고 추가적인 최적화가 필요할 수 있습니다. PCR 이합체의 작은 금액은 일반적으로 중요 한 문제, 하지만 그들은 최소화 해야 어댑터 이합체 매우 효율적으로 시퀀싱 합니다. 이 DNA 비율, 초기 어댑터를 조정 하 고 정확한 크기 선택 라이브러리 준비 하는 동안 수행 하 여 얻을 수 있습니다.
싱글-엔드 시퀀싱 다른 실험적인 요구에 적합 한 수도 있습니다. 일자형은 저렴 하 고 이후 읽기; 계산에 의존 하는이 방법은 대부분의 필요한 정보를 제공 합니다. 쌍 간 PCR 및 광학 중복 제거 하 고 반복적인 시퀀스 및 (일반적인 zebrafish 게놈에 있는) 다른 구조 변화를 해결 하려면 더 높은 기능을 제공 합니다. 아래 분석 부분 쌍-엔드 시퀀싱 읽습니다만 처리 됩니다. 짧은 연속 읽기 적절 한 수도 있습니다. 이것은 읽기 낮은 비용에 높은 수를 제공 하지만 읽기 지도 하기 더 어려울 수 있습니다. 100 bp 읽기, 아래 분석 부분 최적화 그리고 짧은 읽기 길이 사용 하는 경우 조정 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 또한 쉽게 zebrafish 모델의 추가 사용에 대 한 적용할 수 있습니다. 그것은 이미 사용 되었습니다 zebrafish 이다 섬유 아 세포 (ZTF 셀)의 분석을 위해 1 차 셀 라인 성인 zebrafish 이다에서 고립 된 문화. 제 브라에서 고립 된 세포 유형 공부, 유전자 변형 표시를 식별 하 여 얼룩 하 고 DNA 콘텐츠 정렬 하기 전에 개별 셀 종류를 분리 사용할 수 있습니다. 한 잠재적인 전략 조직-특정 발기인에 의해 그리고 처음 구동 형광 마커를 표현 유전자 변형 라인을 사용 하 여 절연 FACS 정렬, 뒤에 고정 및 DNA 콘텐츠에 대 한 정렬 셀 것입니다. 또한, 세포 투과성 DNA 염료를 사용 하 여 개별 셀 유형으로 g 1과 S 단계 인구 동시 격리에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜을 이러한 적응도 다른 비보에 모델에서 복제 타이밍 연구 활성화 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용 하는 미래에 대 한 흥미 진 진한 가능성 복제 타이밍 질병에서의 역할을 연구 하는 것입니다. 변경 복제 타이밍에 발암 중 발생 하는 경우 결정 하는 데 사용할 수 있습니다 zebrafish, 일부 자연 및 다른 유도할 수 있는 여러 가지 암 모형이 있다. 이 역할 복제 타이밍의 평가 tumorigenesis 및 질병 진행에서 재생을 허용할 것 이다. 또한, zebrafish 마약 검사에 대 한 우수한 모델 이며 암 치료에 사용 하기 위해 잠재력 있는 복제 타이밍 조절에 영향을 주는 약물을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Zebrafish는 복제 타이밍 공부를 유망한 새로운 모델입니다. 이 프로토콜 많은 다른 사람에 게 복제 타이밍 개발 및 질병에서의 역할을 공부 하 고이 모델을 활용 하는 기회를 줄 것 이다. 이 프로토콜은 다른 vivo에서 개발 모델 시스템 초파리 melanogaster 그리고 Xenopus laevis, 그리고 이들과 다른 유기 체에서 보이는 미래에 앞으로 연구 결과 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 일반 의료 과학을 통해 국립 보건원의 5P20GM103636-02 (포함 Flow Cytometry 코어 지원) 및 1R01GM121703, 부여로 오클라호마 센터에서 성인 줄기 세포에 대 한 수상 연구입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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