Summary
Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.
Abstract
Sincronismo de replicação do DNA é uma característica importante do celular, exibindo relacionamentos significativos com taxas de mutação do DNA, transcrição e estrutura da cromatina. Alterações no calendário de replicação ocorrerem durante o desenvolvimento e no câncer, mas o tempo de replicação do papel que desempenha no desenvolvimento e doença não é conhecida. Zebrafish estabeleceram-se, recentemente, como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação. Aqui está detalhado os protocolos para usando o zebrafish para determinar o tempo de replicação do DNA. Depois da classificação de células de embriões e adultos do zebrafish, padrões de tempo de replicação de DNA de alta resolução todo o genoma podem ser construídos, determinando alterações no número de cópia de DNA através da análise de dados de sequenciamento na próxima geração. O sistema de modelo zebrafish permite avaliar as mudanças de tempo de replicação que ocorrem in vivo durante todo o desenvolvimento e também pode ser usado para avaliar as mudanças nos tipos de células individuais, modelos de doença ou linhas mutantes. Esses métodos permitirá estudos investigando os mecanismos e os determinantes de estabelecimento de calendário de replicação e manutenção durante o desenvolvimento, o tempo de replicação papel joga em mutações e tumorigênese e os efeitos de distorçer tempo de replicação sobre desenvolvimento e doença.
Introduction
Para as células dividir com sucesso, eles devem primeiro com precisão e fielmente replicar seu genoma inteira. Duplicação do genoma ocorre em um padrão reproduzível, conhecido como o DNA replicação sincronismo programa1. Sincronismo de replicação de DNA está correlacionado com a organização da cromatina, marcas epigenéticas e expressão de gene2,3. Alterações no calendário de replicação ocorrerem durante todo o desenvolvimento e estão significativamente relacionados com transcriptional programas e alterações de marcas da cromatina e organização4,5. Além disso, sincronismo de replicação está correlacionado com frequências mutacional e alterações no calendário são observadas em vários tipos de câncer,6,7,8. Apesar destas observações, os mecanismos e os determinantes de estabelecimento de calendário de replicação e Regulamento ainda são em grande parte desconhecidos e o papel que desempenha no desenvolvimento e doença é indeterminada. Além disso, até recentemente a replicação do genoma-largo cronometrar as mudanças que ocorrem durante todo o desenvolvimento de vertebrados tinha apenas sido examinada em modelos de cultura de células.
Peixe-zebra, Danio rerio, são adequados para estudar replicação sincronismo na vivo durante o desenvolvimento, como um único par de acasalamento pode render centenas de embriões que se desenvolvem rapidamente com muitas semelhanças com o desenvolvimento dos mamíferos9, 10. Além disso, durante todo o desenvolvimento do zebrafish, existem alterações ao ciclo celular, organização da cromatina e programas transcriptional que compartilham relações com DNA replicação sincronismo11. Zebrafish também são um excelente modelo genético, como eles são particularmente passíveis de manipulação por transgênese, mutagênese e alvo de mutações, e telas genéticas identificaram diversos genes necessários para o desenvolvimento de vertebrados12. Portanto, o zebrafish pode ser usado para identificar genes envolvidos na manutenção e criação de temporização de replicação e para observar os efeitos da desregulamentação timing de replicação em desenvolvimento de vertebrados. Linhas transgénicas também podem ser usadas para avaliar o tempo de replicação da célula individual tipos isolados em diferentes momentos do desenvolvimento ou em condições de doença. Importante, existem vários modelos de zebrafish de doenças humanas que podem ser usados para investigar o papel do sincronismo de replicação em doença formação e progressão9,13,14.
Recentemente, os perfis de tempo de replicação primeiros foram gerados de zebrafish, estabelecendo isso como um sistema modelo para estudar a replicação sincronismo na vivo15. Para fazer isso, as células foram coletadas de zebrafish embriões em vários estágios de desenvolvimento e em um tipo de células isoladas de zebrafish adulto. As células foram então classificadas por FACS (classificação de fluorescência-ativado da pilha) com base no conteúdo de DNA para isolar populações de fase G1 e S. Usando o exemplo do G1 como um controle de número de cópia, copie o números variações na fase S populações foram determinadas e usadas para inferir a replicação relativo tempo16. Alterações no calendário de replicação em seguida podem ser directamente comparadas entre diferentes amostras de desenvolvimento e tipos de células, e isso foi usado para determinar mudanças no calendário de replicação que ocorrem na vivo durante todo o desenvolvimento de vertebrados. Este método oferece diversas vantagens sobre outros métodos de genômicas, principalmente que não exige rotulagem com análogos da timidina ou imunoprecipitação de DNA4,6.
Aqui está detalhado os protocolos para sincronismo de replicação de DNA de todo o genoma de perfil de alta resolução no zebrafish. Estes protocolos têm sido utilizados para determinar as relações com recursos de genômicas e epigenéticas no genoma de zebrafish, bem como alterações nesses relacionamentos que ocorrem durante todo o desenvolvimento de criação de perfil. Estes protocolos são também facilmente adaptados para estudar alterações no calendário de replicação em cepas mutantes de zebrafish e nos modelos de doença. Além disso, esses métodos fornecem uma base que pode ser expandida em cima para estudar tempo de replicação em tipos de células específicas, classificando primeiro os tipos de célula individual do zebrafish. O zebrafish pode servir como um excelente na vivo sistema modelo para estudar o tempo de replicação e, finalmente, revelar as funções biológicas dessa importante característica epigenética.
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Protocol
Todos os animais foram tratados em estrita conformidade com protocolos aprovados pelo Comitê de uso e Oklahoma Medical Research Foundation institucional Animal Care.
1. criação de zebrafish adulto para reprodução
- Use uma grande coorte de adultos do zebrafish masculino e feminino de uma cepa única para reprodução. Existem pequenas diferenças na composição genética de zebrafish de sequer uma única tensão, use uma grande coorte para garantir resultados representativos da variabilidade genética da população e não restrito a um pequeno subconjunto da população.
- Na noite antes de embriões serão coletados, lugar dezenas de adultos reprodutores em tanques de reprodução, use aproximadamente igual número de machos e fêmeas. Dependendo do experimento, use uma das seguintes estratégias de reprodução.
- Criação de estratégia 1: Coloque alguns zebrafish masculino e feminino em tanques de criação individual, separar os machos das fêmeas com um divisor. Se esta perspectiva é usada, configurar muitos tanques de reprodução diferentes e juntar os embriões de cada um para assegurar que a variabilidade biológica é representativa da população.
- Criação de estratégia 2: combinar dezenas de zebrafish masculino e feminino em um aquário grande. Use esta estratégia, enquanto há um número suficientemente grande de embriões, é razoável supor que eles vieram de uma variedade de fundadores e são, portanto, geneticamente representativa da população.
2. timed acasalamentos - coleta, classificação e embriões de zebrafish para experiências de habitação
- Realize acasalamentos cronometrados, começando assim a luz ciclos sendo pela manhã. Descarte qualquer embriões gerados durante a noite.
- Permitir que peixes procriem em águas rasas (3-5 cm) por um período de 10 min, com um fundo falso para embriões escapar.
- Depois de 10 min, colete embriões derramando através de um filtro e enxaguar em uma placa de 10 cm com uma garrafa de lavagem. Piscina, todos os embriões coletados no mesmo ponto do tempo, marcá-los com o tempo de coleta e o lugar imediatamente em uma incubadora a 28,5 ° C.
- Centenas de embriões podem ser esperadas de um único par de acasalamento em um dia. Permitir que adultos procriarem min 10 ciclos até que o número de embriões obtidos tem menos de vinte anos.
- Aproximadamente 1-1,5 h após a coleta, tipo de embriões para remover embriões mortos e não fertilizados. Para classificar os embriões, retirar da incubadora e observar ao microscópio dissecação.
- Embriões de contagem e o lugar em uma densidade de 100 embriões por placa de 10 cm.
- Adicionar o meio fresco de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4) e retorno de embriões para a incubadora de 28,5 ° C.
3. Dechorionate, deyolk e fixar os embriões de zebrafish
Nota: Esta seção do protocolo destina-se aos embriões antes da fertilização post de 48 h (hpf). Não há nenhuma necessidade de remover os chorions de embriões em fases posteriores do desenvolvimento (após 48 hpf), como muitas vezes naturalmente caem. Não há nenhuma necessidade de deyolk ou remover os chorions de peixe mais velho os 5 dias pós fertilização (dpf).
- Quando embriões atingem a idade do desenvolvimento desejada, verifique se a fase do desenvolvimento morfologicamente sob um microscópio de luz de acordo com "Estágios de embrionário desenvolvimento de Zebrafish"17.
- Transferência de até 1500 embriões encenados para um tubo cônico de 15 mL e lave várias vezes com a E3.
- Adicionar 1 mL de E3 e 20 µ l de solução Pronase (30 mg/mL) para cada 100 embriões e agite suavemente. Até 1500 embriões podem ser dechorionated em um único tubo com 15 mL de E3.
- Colocar o tubo de lado e organizar os embriões em uma camada uniforme para garantir a máxima superfície à relação do volume. Suavemente agite o tubo a cada 2-3 min até todos os chorions caíram fora os embriões. O tempo total de dechorionation irá variar dependendo da atividade Pronase.
- Remover o sobrenadante e lavar delicadamente embriões 3 vezes com 10ml de E3. Coloque os embriões no gelo para o restante desta seção do protocolo.
- Retire E3 e lave os embriões com buffer deyolking gelada preparada na hora (0,5 x solução de Ringer peixe de Ginzburg, sem cálcio: 55 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO3).
- Adicione 1 mL de tampão de deyolking gelada para até 500 embriões.
- Usando um P1000, delicadamente Pipetar embriões acima e para baixo 5 - 10 vezes para interromper o saco vitelino.
- Transferi 1 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugar a 4 ° C e 500 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante e lavar o sedimento com 1 mL de PBS gelado 1x (solução salina tamponada fosfato, pH 7.0) para remover a solução de Ringer. Centrifugar a 4 ° C e 500 x g durante 5 min.
- Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de 1X PBS. Colocar o tubo no gelo.
- Adicione 3 mL de etanol gelado (EtOH) para um tubo cônico de 15 mL. Tubo de vórtice de EtOH suavemente na regulação baixa.
- Usando um P1000, lentamente (1 gota por segundo) gotejamento zebrafish embrião suspensão de células em EtOH enquanto num Vortex suavemente.
- Adicionar um total de 1 mL de suspensão de células do embrião, para uma solução de fixação final de 75% EtOH.
- Depois de 1 mL de célula suspensão foi adicionado, suavemente redemoinho tubo para misturar e colocar a-20 ° C durante pelo menos 1 h. Recomenda-se colocar os tubos no lado para garantir a máxima superfície à relação do volume e reduzir o número de embriões e células que ficam juntos. Armazenar as células do embrião a-20 ° C durante 2-3 semanas.
4. coloração de DNA e FACS triagem de embriões
Nota: Esta seção do protocolo destina-se aos embriões em 1 dpf.
- Remova células de embrião de EtOH-fixo de-20 ° C e centrifugar a 4 ° C 1500 x g por 5 min.
- Colocar o tubo no gelo e cuidadosamente remover sobrenadante. Usando um P1000, delicadamente Ressuspender as células em 1 mL de acabadas frio PBS-BSA (1X PBS, 1% de albumina de soro bovino).
- Centrifugar as células a 4 ° C e 1500 x g durante 5 min e colocar no gelo.
- Remover sobrenadante e ressuspender as células em iodeto de propidium (PI) solução (50 µ g/mL PI, 100 µ g/mL RNase A, PBS, pH 7,0), de coloração usando 200 µ l para cada 1000 embriões.
- Permitir que as células incubar em solução de PI por 30 min no gelo, misturando suavemente a cada 5 min.
- Coloque um filtro de célula de nylon de 40 µm em um tubo cónico de 50 mL no gelo. Delicadamente, pipete células para misturar e filtrar através da malha.
Nota: Se vários tubos de embriões de commit a mesmas foram coletados na secção 3 do protocolo, combine estes embriões neste momento para que eles são todos classificados juntos. - Usando o plano dentro do final de um êmbolo da seringa, delicadamente perturbar qualquer restantes aglomerados de células na malha.
- Enxague as células através do filtro com 500 µ l de PBS-BSA frio para cada 1000 embriões.
- Coloque uma malha 40 µm sobre um tubo cônico de 15 mL no gelo e filtrar a suspensão de células do tubo cónico de 50 mL uma segunda vez para o tubo de 15 mL.
- Usando um celular adequado instrumento de classificação, defina a excitação do laser para detecção de 561-nm e emissão a 610/20 para detectar iodeto de propidium.
- Tubo de mistura 15 mL de células coradas brevemente pela utilização do Vortex e lugar no instrumento a 4 ° C.
- Taxa de execução de células em um fluxo lento, idealmente de 1,0 mL/min, a fim de obter um perfil limpo ciclo celular e evite misturar G1 ou G2/M células com o S população de fase.
- Primeiro, portão para FSC-A x SSC-A (área de dispersão para a frente pela área de dispersão lateral) para remover os resíduos (figura 1A).
Nota: Células de embriões podem ser diferentes tamanhos dependendo do tipo de palco e celular. O filtro de densidade neutra (ND) talvez precise ser alternado entre 1,0 e 1,5 dependendo do tamanho das células presentes. Portão de uma grande área para recolher a maioria das células e remover os resíduos. - Segundo, portal para SSC-área (SSC-A) pela área de PI (PI-A), para remover detritos e célula parelhas (figura 1B).
- Em terceiro lugar, portão para SSC-A por SSC-W (largura) para remover qualquer restantes parelhas de célula (Figura 1).
- Exibir as populações fechadas em um histograma com o número do celular (contagem) na área de iodeto do eixo y e propidium (PI-A) sobre o eixo x. Para 24 embriões hpf, isso deve dar um perfil estereotipado de ciclo celular, como na Figura 1.
- Para classificar a população de fase S, defina o portão do lado direito do pico do G1 para o lado esquerdo do pico do G2, incluindo apenas uma quantidade mínima de população G1 e G2. Para 24 embriões hpf, isso normalmente será constituído por cerca de 10-15% da população fechada (ver Figura 1).
- Para classificar a população de G1, defina o portão no lado esquerdo do pico do G1, para não passar o topo do pico. Ajustar a largura do portal G1 tão estreita quanto possível (ver Figura 1).
- Volte portal G1 e populações de fase S para garantir a adequada inicial associada (Figura 1E).
- Classificar as G1 e S populações de fase para tubos cônico de 15 mL com 3 mL de PBS-BSA. O objetivo deve ser obter entre 500.000 e 1 milhão ou mais células classificadas por fração (fase G1 e S).
- Após a classificação for concluído, tubos de centrífuga em 1500 x g e 4 ° C por 10 min.
Nota: O pequeno centrifugado será difícil ver e é importante para não perturbá-lo, portanto, use de preferência um rotor de balde balançando sobre um rotor de ângulo fixo. - Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de 1X PBS. Transferência de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugar a 6.000 x g e 4 ° C por 5 min.
- Cuidadosamente retire todo o líquido do tubo e congelar o pellet seco a-20 ° C. Armazene a pelota a-20 ° C durante 2-3 semanas.
5. DNA isolamento, tratamento de RNase e purificação de DNA
- Remova centrifugado de-20 ° C e lugar no gelo.
- Adicione 400 µ l de tampão SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM de EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) de pelotas e ressuspender.
- Adicione proteinase K para uma concentração final de 0,2 mg/mL e misture vortexing brevemente.
- Incube as amostras no 56 ° C durante 2 h, vórtice cada 15 min.
- Após 2 h, execute extração fenol-clorofórmio, adicionando a 400 µ l de fenol-clorofórmio (álcool isoamílico: fenol: clorofórmio 25:24:1, saturado com 10mm Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
- Vórtice para 20 amostra s e centrifugar a 16.000 x g por 5 min separar as fases.
- Remova cuidadosamente a fase aquosa superior (400 µ l) e transferir para um tubo de 1,5 mL.
- Execute EtOH precipitação pela adição de 40 µ l de acetato de sódio 3M (pH 5.2), 2 µ l de glicogênio e 1 mL de EtOH.
- Vórtice para misturar bem e colocar a-20 ° C durante a noite para precipitar o DNA. Amostra também pode ser precipitada a-80 ° C ou em gelo seco por 1h.
- Amostra de centrifugação a 4 ° C e 16.000 x g, durante 30 min para o DNA da pelota.
- Descarte a pelota sobrenadante e lavar com 1 mL 70% EtOH. Centrifugar a 4 ° C e 16.000 x g durante 5 min.
- Descarte da pelota de sobrenadante e ar seco à temperatura ambiente por 2-3 min.
- Dissolva a pelota em 96 µ l de água esterilizada e adicione 4 µ l de RNase A (2 mg/mL).
- Misture bem por num Vortex e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
- Execute extração fenol-clorofórmio, adicionando-se 100 µ l de fenol-clorofórmio e o procedimento a seguir em passos 5.2.1 - 5.2.2.
- Adicionar 10 µ l de acetato de sódio 3M, 1 µ l glicogénio e 250 µ l de EtOH e seguindo o procedimento em etapas 5.3.1 - 5.3.5 execute EtOH precipitação.
- Resuspenda o pellet em 60 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM de EDTA (pH 8.0)) e determinar a concentração de DNA utilizando um método quantitativo baseado em fluorescência. Loja DNA a-20 ° C.
Nota: É importante para quantificação de DNA utilizando corantes de ligação de DNA baseado em fluorescência, ou outros meios mais confiáveis do que os métodos baseados em espectrômetro UV.
6. preparação de bibliotecas de DNA e a próxima geração de sequenciamento
Nota: Uma G1 cópia número referência amostra para cada fonte biológica é necessária para cada execução de sequenciamento (ou seja, WT, linha mutante, transgénicos, celular, etc). Compare todas as amostras de fase S da mesma fonte biológica no sequenciamento mesmo executar a mesma referência de G1. Corra pelo menos duas réplicas biológicas de cada amostra para garantir a consistência entre as amostras.
- Dilua 1 µ g de DNA até um volume final de 50 µ l e transferir para um tubo especializado para sonication.
- DNA genômico para um destino de 250-300 bp em um ultrasonicator de foco, de acordo com as especificações do fabricante e protocolo de cisalhamento.
- Verificar a qualidade e o tamanho do DNA genômico cortado usando uma máquina automatizada de electroforese, de acordo com as especificações do fabricante e protocolo. Assegurar que há um grande pico de 250 ~ 300-bp para o DNA genômico cortado.
- Prepare-se bibliotecas de sequenciamento, usando um kit de preparação de biblioteca de DNA com oligos multiplex para sequenciamento na plataforma Illumina, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Verificar qualidade de preparação de biblioteca usando a máquina de electroforese automatizado, de acordo com o protocolo do fabricante. Assegurar que há um grande pico de ~ 400-450 bp, e existem picos mínimos para dímero da primeira demão (bp 80-85) e adaptador dímeros (~ 120 bp).
- Quantificar as bibliotecas usando um kit de quantificação de biblioteca de DNA para sequenciamento de DNA de última geração, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Diluir a 15 µ l de biblioteca para uma concentração de 5 nM e combinar multiplexado bibliotecas como necessário para alcançar o desejado exclusivamente mapeamento ler contagens por amostra.
Nota: O número de exclusivamente de mapeamento leituras por exemplo irá determinar a resolução. Uso apenas 5 milhões mapeado lê para avaliar o tempo de replicação para o genoma de zebrafish. Recomenda-se começar com 10 milhões de leituras. - Realize o sequenciamento de DNA de genoma inteiro emparelhado-final 100 bp de amostras em uma plataforma de sequenciamento de geração seguinte, de acordo com as instruções do fabricante.
7. análise de dados de sequenciamento
Nota: As instruções nesta seção destinam-se como uma diretriz para análise. Use métodos adicionais para o alinhamento de sequenciamento, filtragem, processamento, etc. Esta seção do protocolo vai lidar com o método preferido de análise neste trabalho. Se forem usados métodos adicionais, ajuste os parâmetros e funções para atender a essas finalidades. Os comandos abaixo são inseridos no Ubutnu ou Mac terminal, com os pacotes apropriados instalados.
- Obter as versões mais recentes do genoma zebrafish (danRer10, a partir de quando este protocolo foi escrito) do navegador UCSC genome usando os seguintes comandos:
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Descompacte o arquivo fa.gz com o seguinte comando:
gunzip danRer10.fa.gz - Alinhe dados de sequenciamento de genoma usando BWA-mem usando os seguintes comandos:
BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Descompacte o arquivo fa.gz com o seguinte comando:
- Converta arquivo Sam para arquivo .bam usando o samtools com o seguinte comando:
samtools Ver os input.sam -bS > output.bam- Classificar os arquivos de sequenciamento alinhadas usando samtools com o seguinte comando:
samtools tipo output.bam > output_sorted.bam - Indexe o arquivo .bam usando o samtools com o seguinte comando:
samtools índice output.bam
- Classificar os arquivos de sequenciamento alinhadas usando samtools com o seguinte comando:
- Mark PCR duplicatas com Picard usando os seguintes comandos:
Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
Input=Input.bam
Output=output.bam
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Gere arquivos de texto (. txt) de leituras para cada cromossomo usando o seguinte comando:
por eu em 1,25 {}; fazer CHROM = "chr" $i; Eco $CHROM; samtools Ver os input.bam $CHROM | corte -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i}. txt; feito
Nota: As colunas no arquivo. txt resultante são bandeira, localização, mapQ, emparelhar chr, par localização e tamanho do fragmento, respectivamente. - Ler arquivos. txt em Matlab (ou qualquer outro software similar) usando a função de textos.
- Filtre o mapeamento de baixa qualidade leituras, definindo um limite de mapQ de 30.
- Remova leituras com sinalizadores para alinhamento não primário, duplicatas PCR ou mapeamento de par para um cromossomo diferente.
- Filtre qualquer leituras com seu par, além de um limite de distância de 2000 bp.
- Avalie as estatísticas de leituras resultantes para determinar o número de estatísticas de leitura, cobertura, inserção de tamanho e qualidade (Figura 2).
- Determine Leia cobertura em 100 windows bp fixada para cada amostra, contando o número de leituras em 100 intervalos de bp em todo o comprimento de cada cromossomo.
- Calcule que a mediana ler contagem para todas as janelas.
- Filtre as regiões de alta cobertura, removendo windows maiores que 5 desvios-padrão da mediana.
- Defina regiões para análise as amostras de referência G1 encontrando segmentos ao longo de cada cromossomo com 200 leituras usando janelas de correr.
- Determine a profundidade de leitura em cada amostra de fase S contando o número de leituras de fase S no windows 200-leitura contagem definido para a referência de G1 que acompanha.
- Alise os dados brutos, usando a função csaps no software, com um fator de interpolação (p) de 10-16.
- Normalize os dados suavizados para pontuação z com uma média de 0 e desvio padrão de 1.
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Representative Results
Usando dados de tempo de replicação publicado, perfis de temporização de replicação representativa e medidas de controle de qualidade são fornecidas15. Os passos iniciais da transformação envolvem alinhar os dados de sequenciamento do genoma, calcular comprimento Leia e estatísticas de cobertura do genoma e filtragem de baixa qualidade, não pareada, e leituras duplicadas de PCR. Estatísticas de leitura para uma amostra de sequenciamento de zebrafish típicos são mostradas na Figura 2. Após a filtragem, leitura contagens são determinadas em janelas de tamanho variável e os dados são suavizados e normalizada. Perfis de sincronismo típico alisado/normalizado de replicação de um cromossomo representativo zebrafish para réplicas biológicas são mostrados na Figura 3A. Os perfis para réplicas biológicas e experimentais devem ser visualmente muito semelhante (veja a Figura 3A) e também exibir alta correlação ao longo do comprimento do cromossomo (Figura 3B). Eles também devem exibir alta correlação entre os valores de tempo todo o genoma (Figura 3). Autocorrelação, um método para avaliar a continuidade do padrão, deve ser usada para avaliar o grau de estrutura no conjunto de dados (Figura 3D). A autocorrelação para programas estruturados sincronismo maduro deve ser elevada em distâncias curtas e diminuir gradualmente à medida que aumenta a distância. Replica de amostras que mostram grande reprodutibilidade entre biológico e experimental e um sinal forte de autocorrelação deve ser considerado como amostras de alta qualidade e pode ser combinado para obter um exemplo de cobertura superior.
Figura 1: classificação de embriões de peixe-zebra para análise de tempo de replicação. (A) condomínio fechado a população de todas as células seleccionadas para a área de dispersão para a frente (FSC-A) pela área de dispersão lateral (SSC-A). As cores representam a densidade dos escaninhos na trama do ponto com densidade de alto a baixo, representada por cores que variam do vermelho ao verde-para-azul. (B) Gated população das células FSC x SSC condomínio fechado classificada para SSC-A pela área de iodeto de propidium (PI-A). (C) Gated população do CCD x células PI condomínio fechado classificada para SSC-A pela largura de dispersão lateral (SSC-W). (D) o histograma de todas as populações gated, exibindo um perfil estereotipado ciclo celular. Portões de classificação para as células na fase G1 e S são exibidas pelo cinza sombreado in a box com linhas pretas. (E) Backgated G1 e S populações de fase mostram que o gating inicial capturado a maioria das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: sequenciamento ler estatísticas para obter um exemplo típico de zebrafish. (A) Reap mapeamento a qualidade das estatísticas de mapQ valores. (B) histograma da distribuição de tamanhos de inserção para todas as leituras de sequenciamento. (C) estatísticas de leitura para total mapeada lê, lê contendo a bandeira de baixa qualidade, lê com pares de mapeamento para um cromossomo diferente (diff par chr), lê-se com par além do limite de distância (par distante) e PCR duplicatas. (D) números representativos do total mapeado, leituras não mapeadas e não emparelhadas, cobertura e lido a resolução para uma execução típica de sequenciamento de uma amostra de zebrafish. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: resultados de temporização de replicação representante zebrafish e medidas de controle de qualidade. (A) replicação sincronismo ao longo do comprimento de um representante do cromossoma para duas repetições biológicas de 28 embriões hpf (Siefert, 2017). (B) correlação entre os valores de sincronismo de replicação em 2 Mb windows ao longo do comprimento de um cromossomo representativo para o biológico Replica de 28 embriões hpf, mostrados na Figura 3A. Todo o genoma (C) correlação entre os valores de tempo de replicação para biológico (rep1 e rep2) e experimental (rep3) repetições de 28 embriões hpf. O mapa de cor representa o coeficiente de correlação de Pearson. Autocorrelação (D) para um programa estruturado de sincronismo maduro exibe alta autocorrelação em distâncias próximas que diminui gradualmente cada vez mais longas distâncias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Zebrafish fornecem um sistema de modelo novo e exclusivo na vivo para estudar tempo de replicação do DNA. Quando cronometrados acasalamentos são realizados como detalhado no presente protocolo experimental, milhares de embriões podem ser coletados em um único dia para experimentos. Esses embriões se desenvolvem sincronicamente por precisamente cronometrados e distintamente caracterizados estágios de desenvolvimento. Zebrafish pode ser facilmente e com precisão encenado por morfologia usando um estereomicroscópio, como embriões de zebrafish desenvolvem externamente e são opticamente claros. Este protocolo detalha o uso de embriões de peixe-zebra para estudar tempo de replicação durante todo o desenvolvimento de vertebrados.
Áreas do protocolo que podem apresentar problemas incluem garantir desenvolvimento síncrono de embriões de peixe-zebra, perda de células durante a preparação, FACS classificação e preparação de biblioteca. O tempo do desenvolvimento do zebrafish é temperatura dependente, portanto uso zebrafish adaptado aos ciclos de luz/escuro e alojados em 28,5 ° C, para experiências. Para garantir o desenvolvimento síncrono, realizar precisamente cronometrados acasalamentos e coletar embriões em muito tempo pequeno-windows (10 min ou menos). É fundamental para manter os embriões em 28,5 ° C e certifique-se de que eles passam o tempo mínimo à temperatura ambiente. O tempo de desenvolvimento de zebrafish também é altamente dependente da densidade de embriões em uma determinada área. É fundamental para não embriões de casa em uma densidade maior do que 100 embriões por placa de 10 cm, ou eles não desenvolverão adequadamente. O tempo ideal para remover os embriões mortos e não fertilizados é quando eles progrediram para o estágio de célula 4-16 e podem ser facilmente identificados como fertilizado (use "Estágios de embrionário desenvolvimento de Zebrafish"17 como um guia). Os embriões mortos normalmente aparecem como bolas pretas e embriões não-fertilizados aparecem como 1-célula. Trabalhe o mais rapidamente possível para reduzir o tempo à temperatura ambiente.
Quando dechorionating embriões, é importante assegurar que todos os chorions são retirados os embriões. Manter os embriões em pronase solução até que a maioria dos chorions tem saído. Descartar qualquer restantes embriões com chorions intactas ou remover seus chorions com fórceps. Embriões de pipeta com um movimento lento e suave. Não pipete rapidamente como que sujeitará as células ao estresse e resultar em perda de células. Também é importante para não usar um P200, pois isso pode causar maior tensão de cisalhamento que resulta na ruptura das células. Por outro lado, uma pipeta de transferência plástico pode não ter um pequeno o suficiente do furo ou fornecer suficiente tensão de cisalhamento para perturbar o saco vitelino e desagregar as células adequadamente. Pipetas de alternativa poderiam ser usadas desde que o furo e cisalhamento seria equivalente ao P1000 ideal.
Quando FACS classificação 28 hpf, se uma célula estereotipada ciclo de perfil não é obtido, ajustar a tensão do laser de PI para que o pico de G1 é centrado em torno de 50k. Os ganhos para o FSC e SSC também podem precisar de ser ajustado de tal forma que as populações de canais e célula aparecem semelhantes a Figura 1. Se ainda houver dificuldade, o filtro ND deve ser alternado, e as tensões FSC e SSC ajustadas para garantir a maioria das células estão dentro do portão. Deve ser óbvio que se houver PI coloração, como haverá uma escala que se aproxima de duplas do PI-a. O histograma deve mostrar dois picos de claros, um grande pico em 2N DNA para as células G1 e um pico menor em dobro a intensidade para o DNA de 4N conteúdo de células G2/M. Se isto ainda não é obtido também pode haver números baixos de células intactas, problemas com a coloração de PI ou problemas com a fixação e o protocolo precisa ser otimizado em conformidade.
Células de embriões adiantados (antes 10 hpf) não dará perfis típicos de ciclo celular, como uma percentagem elevada dessas células na fase S. Estas amostras podem ser tratadas como amostras de fase S e em comparação com uma referência de G1 de 24 embriões hpf. Embriões entre 10 hpf e 24 hpf pode dar perfis intermédios de ciclo celular e podem ser classificadas, se desejado. A população de fase S também pode ser identificada e classificada, incorporando os análogos da timidina como EDU (5-Ethynyl-2'-desoxiuridina) ou BrdU (Bromodeoxyuridine) em breves pulsos antes da fixação, no entanto, isso não é necessário para determinação precisa da sincronismo de replicação.
Idealmente, a preparação de biblioteca deve ser iniciada com 1 µ g de DNA. Teoricamente ~ 300.000 células classificadas renderia cerca de 1 µ g de DNA (estimando ~3.3 pg/núcleo), no entanto, há sempre perda em todo o protocolo. 500.000 a 1 milhão de células classificadas devem dar mais de 1 µ g de DNA. Um embrião de hpf 24 típico terá cerca de 18.000 células, 10-15% dos quais serão na fase S. Embriões em estágios iniciais de desenvolvimento terão consideravelmente menos células, mas terão o maior percentual de células em fase S.
Realizar a purificação precisa e seleção de tamanho usando grânulos magnéticos é fundamental para eliminar elementos indesejados a partir da preparação da biblioteca. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante e otimização adicional pode ser necessária. Uma pequena quantidade de dímeros PCR não é tipicamente um grande problema, mas dímeros adaptador serão sequência muito eficientemente para eles devem ser minimizados. Isto pode ser conseguido ajustando o adaptador inicial a proporção de DNA, e realizando a seleção de tamanho exato durante a preparação da biblioteca.
Sequenciamento de single-final também pode ser apropriado para diferentes necessidades experimentais. Single-end é mais barato e fornece a maioria das informações necessárias, desde que essa abordagem baseia-se em contagem de leituras; emparelhado-final fornece uma maior capacidade de remover PCR e duplicatas ópticas e resolver áreas de sequências repetitivas e outras variações estruturais (que são comuns no zebrafish genoma). A parte de análise abaixo vai lidar apenas com leituras de sequenciamento emparelhado-final. Leituras de sequenciamento mais curtas também podem ser apropriadas. Isto irá fornecer um número maior de leituras, a um custo menor, mas o lê pode ser mais difícil para mapear. A parte de análise abaixo é otimizada para 100 leituras de bp, e ajustes podem ser necessárias se o menor comprimento de leitura é usado.
Este protocolo também facilmente pode ser adaptado para usos adicionais do modelo zebrafish. Já tem sido utilizado para análise de fibroblastos de barbatana de peixe-zebra (ZTF células), uma célula primária cultura linha isolada do zebrafish Adulto barbatana. Para estudar os tipos de células isoladas de zebrafish, marcadores de transgênicos podem ser usados para identificar e isolar os tipos de células individuais antes de coloração e classificação de conteúdo de DNA. Uma estratégia potencial seria usar uma linha transgênica expressando um marcador fluorescente conduzido por um promotor de tecido-específico e a primeiro isolou pilhas por FACS classificação, seguido de fixação e classificação de conteúdo de DNA. Além disso, o uso de corantes de DNA celular permeáveis pode permitir de isolamento simultâneo de tipos de células individuais, bem como as populações de fase G1 e S. Essas adaptações ao presente protocolo também poderiam permitir estudos de temporização de replicação em outros modelos na vivo .
Uma possibilidade interessante para o uso futuro do presente protocolo é estudar o papel do sincronismo de replicação na doença. Existem vários modelos de câncer em zebrafish, alguns espontâneo e outros inducible, que podem ser usados para determinar quando ocorrem alterações no calendário de replicação durante mixomas. Isso permitirá que a avaliação de tempo de replicação o papel desempenha na tumorigênese e doença de progressão. Além disso, o zebrafish são um excelente modelo de despistagem de drogas e pode ser usado para identificar drogas que afetam o Regulamento de temporização de replicação, que têm o potencial para uso no tratamento do câncer.
O peixe-zebra é um promissor novo modelo para estudar o tempo de replicação. Este protocolo irá permitir muitos outros a oportunidade de utilizar este modelo em estudar o papel do sincronismo de replicação no desenvolvimento e na doença. Este protocolo pode ser adaptado para uso com outros na vivo do desenvolvimento sistemas modelo, tais como Drosophila melanogaster Xenopus laevise olhar para a frente a futuras descobertas destes e de outros organismos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências do National Institutes of Health, através de concede 5P20GM103636-02 (incluindo suporte de núcleo de citometria de fluxo) e 1R01GM121703, bem como prêmios do centro de Oklahoma para células-tronco adultas Pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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