Neuroscience

一种体内评价大鼠缺血性中风模型中血脑屏障的破坏

Published: March 11, 2018 doi: 10.3791/57156

Hamdollah Panahpour¹, Mehdi Farhoudi², Yadollah Omidi³, Javad Mahmoudi²

¹Department of Physiology, Medical School, Ardabil University of Medical Sciences, ²Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, ³Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Faculty of Pharmacy, Tabriz University of Medical Sciences

Summary

本程序的总体目标是为在体内评估缺血性中风模型大鼠血脑屏障中断提供一种高度可重复的技术。

Abstract

缺血性中风导致血管源性脑水肿和随后的原发性脑损伤, 这是通过破坏血脑屏障 (BBB) 介导的。建立了诱导缺血性中风大鼠, 并作为体内模型对脑屏障功能完整性进行了研究。分光光度法检测脑标本中的埃文斯蓝 (EB), 可以为新的治疗方式的研究和开发提供可靠的依据。这种方法产生可重现的结果, 并适用于任何实验室, 不需要特殊设备。在此, 我们提出了一个可视化的技术指南, 以检测的 EB 渗出后, 诱导的缺血性中风的大鼠。

Introduction

血管源性脑水肿由于血脑屏障 (BBB) 中断仍然是缺血性中风的重要并发症, 也是中风患者存活率的主要决定^因素1, 2.血脑屏障 (BBB) 由脑毛细血管内皮细胞 (BCECs) 形成, 由不同的神经血管成分组成 (例如, BCECs、毛细血管、星形胶质和神经细胞之间的紧密^连接3), 提供了一种中枢神经系统 (CNS) 与外周血循环之间的专门和动态接口⁴^,⁵。诸如缺血再灌注损伤等侮辱可能扰乱脑屏障功能完整性, 导致循环白细胞随后渗入大脑实质, 最终引发脑部炎症和原发性脑损伤。⁶^,⁷. 需要动物模型来精确检测中风发生后的脑屏障功能障碍。这些模型对于研究潜在的病理生理学机制和引入新的神经保护策略具有重要意义。体外基于细胞培养的脑屏障模型已得到高度发展, 并用于生理病理的分子^研究(bbb) 8, 9, 10.然而, 在这方面,在体内动物模型, 它产生的脑屏障的缺血性损伤类似于人类的临床条件, 也是非常值得的。定量检测埃文斯蓝 (EB) 的渗出是一种公认和敏感的技术, 已用于评估脑屏障完整性和功能的神经退行性疾病, 包括缺血性中风¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. 该方法成本效益高, 可行, 重现性好, 完全适用于任何实验实验室。它的实现不需要先进的设备, 如放射性示踪剂¹⁵或磁共振成像 (MRI)¹⁶, 这是其他方法的先决条件。本文对缺血性脑卒中大鼠模型中 EB 渗出进行了脑屏障的基本技术过程的综合演示。

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Protocol

所有的程序都按照阿尔达比勒大学医学研究委员会的指导方针进行动物研究 (道德 ID 号: IR。ARUMS。1394.08). 在这一可视化研究中, 我们使用了由牧场研究所 (伊朗德黑兰) 获得的成年雄性大大鼠 (300-350g)。

1. 麻醉和血流仪

麻醉使用4% 异氟醚, 并保持它与异氟醚 (1-1. 5%) 在一氧化氮 (70% 伏/五) 和氧 (30% v/v) 的混合物在手术期间。
放置一个麻醉动物在一个反馈控制的加热毯的俯卧姿, 并保持体温在37±0.5 °c 通过一个直肠探头连接到这个加热单元。
在两只眼睛上涂抹少量的眼膏, 以防止干燥。
用电动快剪剃去头骨左侧的手术区。使用 betadine 溶液与纱布垫消毒皮肤。用含有70% 乙醇的无菌垫冲洗这个区域, 并重复这两个步骤三循环¹⁷。
为镇痛, 注射0.2 毫升0.5% 布比卡因皮下入手术区域¹⁷。
在头骨上做一个1厘米长的皮肤切口 (从左眼的侧眼角延伸到左耳的底部), 解剖左颞的肌肉以暴露头骨。然后, 创建一个小毛刺孔5毫米侧向和1毫米后向 bregma¹⁸ , 以缓解多普勒流量计铅笔探针的尖端位置。
将大鼠从俯卧位置转到仰卧位, 然后将激光笔探头插入先前钻孔的颅骨盲孔, 监测区域脑血流 (局部脑血)。
记录每个动物的基线局部脑血, 并将其视为100%。值得注意的是, 每当检测到80% 局部脑血的减少时, 大脑中动脉闭塞 (MCAO) 就开始^了19, 20.

2. 诱导灶性脑缺血

用 betadine 溶液和70% 乙醇对颈部进行剃须, 并对皮肤进行消毒。在手术部位注射0.2 毫升0.5% 布比卡因镇痛¹⁷。
在颈部的腹面上做一个2厘米长的手术切口, 以进入左颈总动脉 (LCCA)。从相邻筋膜和迷走神经中分离 LCCA, 以获得颈外动脉 (ECA) 和颈内动脉的分岔。
结扎永久 LCCA 或非洲经委会使用5-0 丝缝合和解剖 ICA 自由的水平的翼腭动脉。
松散地放置在 LCCA 周围的5-0 丝缝合领带, 然后临时 ICA 钳与血管微夹。
在先前放置松散的领带之前, 在 LCCA 上做一个小切口, 然后在 ICA 的腔内插入4-0 的硅涂层尼龙缝线, 并收紧 LCCA 周围的缝合, 以确保尼龙缝合, 防止血液泄漏。
从 ICA 中取出血管微夹。然后, 提前一个硅涂层腔内灯丝, 直到观察到明显下降的局部脑血, 表明闭塞的 MCA 起源。在缺血性期结束时 (90 分钟), 通过取出腔内缝合²¹开始再灌注。

3. 颈静脉插管和埃文斯蓝 (EB) 注射液

在颈部向中线的左侧做一个1厘米的纵切口, 然后直截了当地解剖掉浅筋膜, 以进入左颈静脉的外侧分支 (轻型货车)。然后, 用5-0 丝缝线永久结扎轻型货车的颅骨末端。在静脉周围松散地放置两条领带, 然后用血管微钳暂时夹住轻型货车的心脏末端。
在两条缝线之间, 在轻型货车上做一个小切口, 然后将血气血清填充导管插入轻型货车的腔内, 并将其推进约10毫米. 随后, 拧紧静脉周围的连字, 以确保导管的安全并防止出血。注射少量的血清以避免血管塌陷。
在再灌注期开始时, 在5分钟内缓慢注射 eb 染料 (1 毫升/千克 2% eb 溶液生理盐水)。随后, 通过注射0.5 毫升生理盐水冲洗套管, 从静脉¹²^,²²取出注射套管。
最后, 缝合颈部和头部切口, 注射0.05 毫克/千克丁丙诺啡腹腔 (IP) 和重复注射每6-8 小时在术后镇痛¹⁷。
注入5毫升预热生理盐水 (IP), 以提供恢复笼¹⁷中的水合。
将动物放在装有温度和空调控制的特殊恢复笼中, 并监测动物从麻醉中恢复的情况。

4. 血脑屏障通透性评估

再灌注24小时后, 用硫喷妥钠深麻醉动物。然后, 通过在胸骨下做一个小洞来打开胸腔。
在右心房开一个小开口, 在 110 mmHg 的压力下, 通过左心室注射250毫升预热的0.9% 生理盐水 (37 ˚C), 将 EB 从循环中冲洗出去, 直到从心房的正常生理盐水出口变为无色的¹⁵。
立即将大脑从头骨中取出, 并将其置于脑基质中。解剖嗅球和小脑, 然后使用干净的剃刀刀片, 从左 (损伤) 沿中线分开大脑的右半球。
在2.5 毫升磷酸盐缓冲盐水中分别称量每个半球并融汇它们, 并将其与2.5 毫升的乙酸酸 (60%) 混合, 使用涡旋机进行2分钟。
离心机的大脑样本为30分钟, 在 1322 x g, 并允许样品冷却在4°c 冰箱10分钟。
使用上清液估计在 610^nm23 的分光光度计的 EB 吸光度。
根据标准曲线计算 EB 浓度, 并将结果表达为脑组织的µg/g。

5. 电子束标准曲线的制作

在5毫升磷酸盐缓冲盐水中制备10个 eb 的样品溶液, 其浓度为 eb 的1-10 µg。
使用分光光度计测量每样样品的吸光度值 610 nm。
使用电子表格制作散点图, 并在 X 轴上显示 EB 浓度和 Y 轴上的吸光度值 (图 1)。
用方程定义曲线的线性趋势线。然后, 用它来获得样品的 EB 浓度。
报告最终结果的 EB 渗出作为µg/g 的脑组织重量。

6. 假操作

对假手术组的大鼠进行相同的手术处理 (包括在颈部和 EB 注射液中进行切口), 但排除 MCAO。

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Representative Results

右半球 EB 水平与假手术大鼠左半球无显著性差异 (分别为 1.06 0.1 µg/克和 1.1 @ 0.09 µg/克)。如图 2 a-2 b所示, 在缺血性大鼠的左半球, 诱导短暂缺血 (90 分钟缺血/24 小时再灌注) 导致 EB 水平显著差异 (10.41 @ 0.84 µg/g, p < 0.001), 与各自半球在假操作的老鼠。总的来说, 这些发现表明, 在正常情况下, eb 不能轻易地越过脑屏障进入大脑实质和脑缺血性侮辱诱发 EB 渗出通过增强通透性的屏障 (图2A 和 2B)。

图 1: 标准曲线用于从吸光度值中确定 EB 浓度.请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 在缺血性中风后24小时内 EB 对脑屏障中断的评估.假手术和缺血性动物大脑的照片 (A)。在脑组织 (蓝色) 中 EB 渗出的强度来自损伤半球的血屏障紊乱程度。在假手术和缺血性动物 (B) (n=6, *p< 0.001 与假组左半球比较, p< 0.001 相比, 从左 (损伤) 和右脑半球制备的 EB 浓度比较同组的同侧半球)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

迄今为止, 各种方法, 如显影和检测放射性示踪剂²⁴^,²⁵, 免疫荧光显微镜²⁶^,²⁷, EB 渗出技术²⁰^, ²³已被用来评估血脑屏障损伤。EB 染料强烈能够绑定到血清白蛋白, 并作为追踪器, 以检测血管渗漏和量化的 BBB 击穿¹¹^,²⁸^,²⁹。EB 渗出技术作为一种高度接受和可靠的方法, 直接评估了脑屏障的完整性, 其影响因素包括缺血性中风。

在体内评估脑屏障允许研究人员研究可能的病理生理机制的缺血诱发血管源性水肿和寻找新的治疗干预。此模型不需要特殊的设备, 并且可以产生可靠的结果, 在实验中成功率高 (超过 80%)¹³^,²⁰。通过对脑组织的直接接触, 这个模型能够高度准确地评估血屏障完整性, 但限于长期研究。

缺血性脑卒中引起的脑屏障病理改变有三阶段: 急性 (小时内), 亚急性 (小时至天), 慢性 (天至月)³⁰^,³¹。显然, 早期的治疗干预在急性病理阶段产生有价值的保护作用。EB 剂量和注射时间点是获得可靠结果的两个关键参数, 由于脑屏障在缺血性侮辱后的动态性质。因此, 使用适当剂量 (生理盐水中的1毫克/千克 2% eb 溶液) 在再灌注期开始后, 通过静脉套管缓慢注射 EB 染料是一个重要因素, 允许研究脑卒中早期病理生理学的变化。.

本文介绍了几种实验方法对缺血性中风的研究。在这个实验模型中, 我们使用 MCAO 与腔内灯丝方法, 创建类似人类中风的条件²¹^,³²。该技术简单可靠;然而, 它的执行需要考虑到一些技术要点, 以进一步提高技术的性能, 确保其准确性。在手术期间, 体温应保持在生理范围内, 而血压和血气必须监测³³^,³⁴^,³⁵。用激光多普勒流量计对局部脑血进行恒定记录, 使用合适的硅胶包覆灯丝, 不仅能提高 MCAO 成功率, 而且能降低死亡率。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢阿尔达比勒医学大学 (阿尔达比勒, 伊朗) 研究的副校长为财政支持 (授予 No: 9607)。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below 25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals \|	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G