Summary
Det övergripande målet med detta förfarande är att ge en mycket reproducerbara teknik för i vivo bedömning av blod - hjärnbarriären störningar i råtta modeller av ischemisk stroke.
Abstract
Ischemisk stroke leder till vasogenic cerebralt ödem och efterföljande primära hjärnskada, som medieras genom förstörelsen av den blood - brain barriären (BBB). Råttor med inducerade ischemisk stroke fastställdes och används som i vivo modeller för att undersöka funktionella integriteten hos BBB. Spektrofotometrisk detektion av Evans blå (EB) i hjärnan proverna med ischemisk skada kunde tillhandahålla tillförlitlig motivering för forskning och utveckling av nya terapeutiska metoder. Denna metod ger reproducerbara resultat, och är tillämplig på alla laboratorier utan behov av specialutrustning. Här presenterar vi en visualiseras och teknisk riktlinje om upptäckt av extravaseringen av EB efter induktion av ischemisk stroke hos råttor.
Introduction
Vasogenic hjärnan ödem på grund av blod - hjärnbarriären (BBB) störningar förblir en viktig komplikation av ischemisk stroke och avgörande betydelse för överlevnaden i stroke patienter1,2. På blod - hjärnbarriären (BBB), som bildas av hjärnans kapillära endotelceller (BCECs) och sammansatt av distinkta neurovaskulära komponenter (t.ex. åtsittande föreningspunkter bland BCECs, pericyter, astroglial och neuronala celler3), ger en specialiserade och dynamiska gränssnittet mellan det centrala nervsystemet (CNS) och perifera blodcirkulationen-4,5. Förolämpningar såsom ischemi-reperfusion skador kan störa funktionella integriteten hos BBB och leda till efterföljande penetration av cirkulerande leukocyter i hjärnparenkymet som slutligen utlösa cerebral inflammation och primära hjärnskador 6 , 7. djurmodeller behövs för exakt detektion av dysfunktion av BBB efter förekomst av en stroke. Sådana modeller är av stor betydelse för att studera bakomliggande patofysiologiska mekanismer och införa nya neuroprotektiva strategier. In vitro kultur-baserade cellmodeller av BBB har utvecklats mycket och används för molekylär studie av BBB fysiopatologi8,9,10. Dock är i vivo djurmodeller, som producerar ischemisk skada av BBB liknar mänskliga kliniska tillstånd, också mycket värdefullt i detta avseende. Kvantitativa detektion av extravaseringen av Evans blå (EB) är en väl accepterade och känslig teknik som har använts för bedömning av BBB integritet och funktion vid neurodegenerativa sjukdomar, inklusive ischemisk stroke11, 12 , 13 , 14. denna metod är kostnadseffektiva, genomförbart, reproducerbar och helt tillämplig på alla experimentella laboratorier. Dess genomförande kräver avancerad utrustning, till exempel radioaktiva spårämnen15 eller magnetisk resonanstomografi (MRT)16, som är förutsättningar för andra metoder. I den här artikeln visar vi utförligt grundläggande tekniska processer av BBB bedömning använda EB extravasering i råtta modeller av ischemisk stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna i Ardabil University of Medical Sciences Research Council för att bedriva studier på djur (etiska ID-nummer: IR. ARUMS. Rec.1394.08). I detta visualiseras studie använde vi vuxna manliga Sprague-Dawley-råttor (300-350 g) erhålls från betesmark Institute (Teheran).
1. anestesi och Flowmetry
- Inducera anestesi med 4% isofluran och underhålla det med isofluran (1-1,5%) i en blandning av lustgas (70% v/v) och syre (30% v/v) under hela operationen.
- Placera ett bedövat djur i benägna hållning på en feed-back kontrollerad uppvärmning filt och upprätthålla kroppstemperaturen vid 37±0.5 ° C med hjälp av en rektal sond denna värme apparat.
- Applicera en liten mängd av oftalmologiska salva på båda ögonen att förhindra torrhet.
- Raka kirurgiska regionen på den vänstra sidan av skallen med elektriska hårklippningsmaskiner. Använda betadine lösning med en kompress för att desinficera huden. Skölj denna region med en steril pad som innehåller 70% etanol och upprepa båda stegen för tre cykler17.
- För analgesi, injicera 0,2 mL bupivakain 0,5% subkutant i kirurgi regionen17.
- Gör en 1 cm lång huden snitt på skallen (som sträcker sig från den laterala Cantus av vänster öga till basen på vänster öra) och dissekera vänster temporalis muskeln för att exponera skallen. Skapa sedan en liten burr hål 5 mm i sidled och 1 mm posteriort bregma18 för enkel placering av Doppler flödesmätare penna sondens spets.
- Sätter på råtta från den benägna att ryggläge, och sedan sätter lasern penna sonden i tidigare borrade skalle blind-hålet för att övervaka de regionalt cerebralt blodflödet (rCBF).
- Spela in varje djurets baslinjen rCBF och betrakta detta som 100%. Särskilt, startas mellersta cerebral artärocklusion (MCAO) när en minskning av rCBF av mer än 80% är upptäckta19,20.
2. induktion av den fokala Cerebra ischemi
- Raka hals regionen och desinfektera huden med betadine lösning och 70% etanol. Injicera 0,2 mL 0,5% bupivakain subkutant i operationsstället för analgesi17.
- Gör en 2 cm lång kirurgiska snitt i ventrala ytan av halsen för att komma åt den vänstra gemensamma halspulsådern (LCCA). Isolera LCCA från den närliggande fascian och vagusnerven för att komma åt bifurkation av den yttre halspulsådern (ECA) och den inre halspulsådern (ICA).
- Ligera permanent antingen LCCA eller ECA anställa en 5-0 silk sutur och dissekera ICA gratis till nivån för pterygopalatine artär.
- Löst placera en slips av 5-0 silk suturen runt LCCA, och sedan tillfälligt ICA klämma med en vaskulär mikro-klipp.
- Gör ett litet snitt på LCCA före den tidigare placerade lös slipsen, och sedan infoga en 4-0 kisel-belagd nylon sutur i luminala loppet av ICA och dra åt suturen runt LCCA att säkra nylon sutur och förhindra blod läcker.
- Ta bort det vaskulära mikro-klippet från ICA. Sedan avancera en silicon belagda intraluminal glödtråd tills observerar en markant nedgång i rCBF som visar ocklusion av MCA ursprung. I slutet av ischemisk period (90 min), starta reperfusion genom att återkalla de intraluminal sutur21.
3. halsvenen kanylering och Evans Blue (EB) injektion
- Gör en 1 cm längsgående snitt i halsen på vänster sida om mittlinjen och sedan rakt på sak dissekera bort ytliga fascia för att komma åt den yttre grenen av den vänstra halsvenen (LGV). Sedan permanent ligera kraniala slutet av LGV med 5-0 silk sutur. Löst placera två band runt en ven, och sedan tillfälligt klämma hjärt slutet av LGV med en vaskulär mikro-klämma.
- Göra ett litet snitt på LGV mellan två suturer, och sedan infoga hepariniserad serum fylld katetern i det luminala utrymmet av LGV och avancera det ungefär 10 mm. efteråt, dra åt ligaturer runt en ven att säkra katetern och förhindra blödning. Injicera små mängder av serum att undvika kollapsade venen.
- I början av perioden reperfusion, injicera långsamt EB färgämne (1 mL/kg i 2% EB lösning i saltlösning) under 5 min. Därefter tvätta kanylen genom injektion av 0,5 mL fysiologisk koksaltlösning och återkalla injektion kanylen från ven12,22.
- Slutligen, sutur i nacke och huvud snitt och injicera 0,05 mg/kg buprenorfin intraperitonealt (IP) och Upprepa injektionen varje 6-8 h under reperfusion för postoperativ analgesi17.
- Injicera 5 mL före värmde saline(IP) att ge återfuktning i återhämtning bur17.
- Plats djuret i en särskild återvinning bur utrustade med temperatur och luftkonditionering kontroll och övervaka återvinning av djuret från anestesi.
4. bedömning av Blood Brain Barrier permeabilitet
- Efter 24 h reperfusion, djupt söva djuret med tiopentalnatrium. Öppna sedan brösthålan genom att göra ett litet hål under bröstbenet.
- Gör en liten öppning i höger förmak och injicera 250 mL före värmde 0,9% koksaltlösning (37 ° c) vid ett tryck på 110 mmHg genom vänster kammare för 15 min att tvätta EB från cirkulationen tills normal koksaltlösning utgångarna från atriet blir färglös23.
- Omedelbart ta bort hjärnan från skallen och placera den i matrisen hjärnan. Dissekera den luktbulben och lillhjärnan, och sedan använda en ren rakblad, avgränsa den högra hjärnhalvan av hjärnan från vänster (Lesioned) längs mittlinjen.
- Väga varje halvklotet och homogenisera dem separat i 2,5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning och blanda detta med 2,5 mL triklorättiksyrelösning (60%) för 2 min använder en vortex maskin.
- Centrifugera hjärnan prover för 30 min på 1 322 x g och tillåta proverna svalna i kylskåp 4 ° C i 10 min.
- Använd supernatanterna för att uppskatta EB absorbansen av en spektrofotometer 610 nm23.
- Beräkna EB koncentrationer mot en standardkurva och snabb resultat som µg/g av hjärnvävnaden.
5. produktion av EB standardkurvan
- Förbereda 10 provlösning EB med koncentrationer av 1-10 µg av EB i 5 mL fosfatbuffrad saltlösning.
- Mäta absorptionsvärdena för varje prov på 610 nm med en spektrofotometer.
- Gör ett scatter diagram med hjälp av ett kalkylblad och nuvarande EB koncentrationer på X-axeln och absorbansvärdena på Y-axeln (figur 1).
- Definiera en linjär trend-line för kurvan med dess ekvation. Använd den sedan för att få EB koncentrationen av prover.
- Rapportera de slutliga resultaten av EB extravasering som µg/g av hjärnans vävnad vikten.
6. sham drift
- Utföra samma kirurgiska processen med råttor i simulerade manövrerade grupp (inklusive att göra ett snitt i halsen regionen och EB injektion) men utesluta MCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var ingen signifikant skillnad i EB nivåer i den högra hjärnhalvan kontra vänster hjärnhalva sham manövrerade rats (1,06 ± 0,1 µg/g och 1,1 ± 0,09 µg/g, respektive). Som visas i siffror 2A-2B, induktion av övergående ischemi (90 min ischemi / 24 h reperfusion) orsakade en signifikant skillnad i EB nivåer (10.41 ± 0,84 µg/g, p < 0,001) i den vänstra hjärnhalvan ischemisk råttor, jämfört med respektive halvklotet i simulerade manövrerade råttor. Sammantaget visar dessa fynd att under normala förhållanden, EB inte kan lätt passera BBB till cerebral parenkymet och cerebral ischemisk förolämpningar inducera extravaseringen av EB genom en ökad permeabilitet av BBB (diagram 2A och 2B).
Figur 1 : Standardkurvan används för att bestämma EB koncentration från absorptionsvärdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bedömning av BBB störningar av EB extravasering 24 timmar efter ischemisk stroke. Ett fotografi av hjärnor i de simulerade manövrerade och ischemisk djur (A). Intensiteten i EB extravasering i hjärnvävnad (blå färg) uppstår från omfattningen av BBB störningar på bort halvklotet. EB-koncentration i prover beredd från vänster (bort) och höger halvklot av hjärnan i den simulerade manövrerade och ischemisk djuren (B) (n = 6, *p< 0,001 jämfört med vänster hjärnhalva i sham grupp, p< 0,001 jämfört ipsilaterala halvklotet av samma grupp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hittills har olika metoder såsom autoradiografi och upptäckt av den radioaktiva spårämnen24,25, immunofluorescens mikroskopi26,27och EB extravasering teknik20, 23 har använts för att utvärdera skadan som blod - hjärnbarriären. EB färgämne är starkt kan binda till serumalbumin och används som spårämne för att upptäcka vaskulär läckage och kvantifiera de BBB uppdelning11,28,29. Som en mycket accepterade och tillförlitlig metod ger EB extravasering tekniken en direkt uppskattning på integriteten av BBB som påverkas av olika cerebrala skador inklusive ischemisk stroke.
In vivo bedömning av BBB tillåter forskare att studera möjliga patofysiologiska mekanismer av ischemi inducerad vasogenic hjärnan ödem och hitta nya terapeutiska interventioner. Denna modell kräver inte särskilda faciliteter och kan producera trovärdiga resultat med en hög framgång i experiment (mer än 80%)13,20. Med direkt tillgång till hjärnvävnaden, denna modell möjliggör noggranna bedömningar av BBB integritet men är begränsad till långtidsstudier.
Patologiska förändringar i BBB orsakade av ischemisk stroke utvecklas i tre faser: akut (inom timmar), subakut (timmar till dagar), och kronisk (dagar till månader)30,31. Uppenbarligen, de tidigaste terapeutiska interventionerna producera värdefull skyddande effekter i den akuta patologiska fasen. EB dosering och tiden för injektion är två avgörande parametrar för att få tillförlitliga resultat på grund av den dynamiska karaktären av BBB efter ischemisk förolämpningar. Därför injektion av EB färgen långsamt via en ven kanyl med lämplig dos (1 mg/kg 2% EB lösning i saltlösning) efter början av perioden reperfusion är en viktig faktor och tillåter studier av patofysiologiska förändringar i de tidiga stadierna av stroke .
Flera experimentella metoder har införts för att studera ischemisk stroke. I denna experimentella modell använde vi MCAO med metoden intraluminal glödtråden som skapar villkor liknar mänskliga stroke21,32. Denna teknik är enkel och tillförlitlig. dess utförande behöver emellertid beakta vissa tekniska punkter att ytterligare förbättra utförandet av tekniken och garantera dess riktighet. Kroppstemperatur bör hållas inom intervallet fysiologiska under operationen, medan Blodtryck och blodgaser måste vara övervakade33,34,35. Konstant inspelning av rCBF med en laser Doppler flödesmätare och använda en lämplig beredd silikon-belagd glödtråden kan inte bara öka MCAO framgång, men också minska dödligheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till rektor för forskning i Ardabil University of Medical Sciences (Ardabil Iran) för ekonomiskt stöd (bevilja nr: 9607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal | AWN 34041100 | 20 - 25 °C |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Molekula | 31216368 | 4 years |
| Sprague–Dawley rats | Pasture Institute (Tehran, Iran) | 300-350g | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | 2 years |
| Bupivacaine HCl (0.5%) | Delpharm Tours | below 25 °C | |
| Bupernorphine | Exir (Iran) | ||
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | 497-19-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate | EMD Millipore | 231-448-7 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| silicone(Xantopren) | Heraeus | EN ISO 4823 | |
| Activator universal plus | Heraeus | 66037445 | |
| Micro-Dissecting forceps | Stoelting | 52100-41 | |
| Spring Scisors | Stoelting | 52130-00 | |
| Operating Scissors | Roboz | 52140-70 | |
| Brain matrix | Stoelting | 51390 | |
| Anesthesia Machine for Small Animals | | Kent Scientific | SS-01 | |
| Power Lab system | AD Instruments | ML880 | |
| Laser Doppler flowmeter | AD Instruments | ML191 | |
| Heating feed back system | Harvard Appratus | 72-7560 | |
| Vascular micro clamp | FineScience Tools | 18055-03 | |
| Silk 5-0 suture thread | Ethicon | 682G | |
| Ethilon 4-0 suture thread | Ethicon | EH6740G |
References
- Jin, G., et al. Protecting against cerebrovascular injury: contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia. Stroke. 39 (9), 2538-2543 (2008).
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 399-415 (2003).
- Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 33, 379-408 (2010).
- Zhang, C., et al. The potential use of H102 peptide-loaded dual-functional nanoparticles in the treatment of Alzheimer's disease. J Control Release. , (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Fang, W., et al. Attenuated Blood-Brain Barrier Dysfunction by XQ-1H Following Ischemic Stroke in Hyperlipidemic Rats. Mol Neurobiol. 52 (1), 162-175 (2015).
- Huang, J., et al. CXCR4 antagonist AMD3100 protects blood-brain barrier integrity and reduces inflammatory response after focal ischemia in mice. Stroke. 44 (1), 190-197 (2013).
- Omidi, Y., Barar, J. Impacts of blood-brain barrier in drug delivery and targeting of brain tumors. Bioimpacts. 2 (1), 5-22 (2012).
- Cho, H., et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 5, (2015).
- Barar, J., Rafi, M. A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Blood-brain barrier transport machineries and targeted therapy of brain diseases. Bioimpacts. 6 (4), 225-248 (2016).
- Kaya, M., et al. Magnesium sulfate attenuates increased blood-brain barrier permeability during insulin-induced hypoglycemia in rats. Can J Physiol Pharmacol. 79 (9), 793-798 (2001).
- Pasban, E., Panahpour, H., Vahdati, A. Early oxygen therapy does not protect the brain from vasogenic edema following acute ischemic stroke in adult male rats. Sci Rep. 7 (1), 3221 (2017).
- Haghnejad Azar, A., Oryan, S., Bohlooli, S., Panahpour, H. Alpha-Tocopherol Reduces Brain Edema and Protects Blood-Brain Barrier Integrity following Focal Cerebral Ischemia in Rats. Med Princ Pract. 26 (1), 17-22 (2017).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-antibody autoradiography and peptide fragments of albumin in cerebral edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
- Jiang, Q., et al. Quantitative evaluation of BBB permeability after embolic stroke in rat using MRI. J Cereb Blood FlowMetab. 25 (5), 583-592 (2005).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hungerhuber, E., Zausinger, S., Westermaier, T., Plesnila, N., Schmid-Elsaesser, R. Simultaneous bilateral laser Doppler fluxmetry and electrophysiological recording during middle cerebral artery occlusion in rats. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 109-115 (2006).
- Panahpour, H., Nouri, M. Post-Ischemic Treatment with candesartan protect from cerebral ischemic/reperfusioninjury in normotensive rats. Int J Pharm Pharm Sci. 4 (4), 286-289 (2012).
- Panahpour, H., Dehghani, G. A., Bohlooli, S. Enalapril attenuates ischaemic brain oedema and protects the blood-brain barrier in rats via an anti-oxidant action. Clin Exp Pharmacol Physiol. 41 (3), 220-226 (2014).
- Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Blockade of Central Angiotensin II AT1 Receptor Protects the Brain from Ischemia/Reperfusion Injury in Normotensive Rats. Iran J Med Sci. 39 (6), 536-542 (2014).
- Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Candesartan attenuates ischemic brain edema and protects the blood-brain barrier integrity from ischemia/reperfusion injury in rats. Iran Biomed J. 18 (4), 232-238 (2014).
- Kaya, M., et al. The effects of magnesium sulfate on blood-brain barrier disruption caused by intracarotid injection of hyperosmolar mannitol in rats. Life sci. 76 (2), 201-212 (2004).
- Schöller, K., et al. Characterization of microvascular basal lamina damage and blood-brain barrier dysfunction following subarachnoid hemorrhage in rats. Brain Res. 1142, 237-246 (2007).
- Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-Antibody Autoradiography and Peptide Fragments of Albumin in Cerebral Edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Kucuk, M., et al. Effects of losartan on the blood-brain barrier permeability in long-term nitric oxide blockade-induced hypertensive rats. Life Sci. 71 (8), 937-946 (2002).
- Uyama, O., et al. Quantitative evaluation of vascular permeability in the gerbil brain after transient ischemia using Evans blue fluorescence. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (2), 282-284 (1988).
- Kleinig, T. J., Vink, R. Suppression of inflammation in ischemic and hemorrhagic stroke: therapeutic options. Curr Opin Neurol. 22 (3), 294-301 (2009).
- Del Zoppo, G. J., Mabuchi, T. Cerebral microvessel responses to focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (8), 879-894 (2003).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Bottiger, B. W., et al. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65 (2), 135-142 (1999).
