Neuroscience

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Published: March 11, 2018 doi: 10.3791/57156

Hamdollah Panahpour¹, Mehdi Farhoudi², Yadollah Omidi³, Javad Mahmoudi²

¹Department of Physiology, Medical School, Ardabil University of Medical Sciences, ²Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, ³Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Faculty of Pharmacy, Tabriz University of Medical Sciences

Summary

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לספק טכניקה מאוד לשחזור להערכת ויוו של ערעור מחסום הדם - מוח במודלים עכברוש של שבץ איסכמי.

Abstract

שבץ איסכמי מוביל בצקת במוח vasogenic פגיעה במוח העיקרי עוקבות, אשר מתווך דרך הרס מחסום הדם - מוח (BBB). חולדות עם שבץ איסכמי המושרה הוקמה ומשמשת כמודלים ויוו לחקור את שלמות פונקציונלית של BBB. Spectrophotometric זיהוי של אוונס כחול (EB) הדגימות המוח עם איסכמי יכול לספק הצדקה אמינה עבור מחקר ופיתוח של שיטות טיפוליות הרומן. שיטה זו יוצרת תוצאות לשחזור, ישימה במעבדה כלשהי ללא צורך בציוד מיוחד. כאן, אנו מציגים קו מנחה מטמיעים וטכני על זיהוי extravasation של EB בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי בחולדות.

Introduction

Vasogenic בצקת במוח עקב הפרעה מחסום הדם - מוח (BBB) נותר סיבוך חשוב של שבץ איסכמי של דטרמיננטה העיקריים של שיעור ההישרדות שבץ בחולים¹^,². מחסום הדם - מוח (BBB), אשר נוצר על ידי תאי אנדותל נימי המוח (BCECs), המורכבת מרכיבים נוירו-וסקולריים נפרדות (למשל, צמתי צר בין BCECs, pericytes, astroglial ותאים עצביים³), מספק מתמחה ודינאמיים ממשק בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לבין מחזור הדם ההיקפיים⁴^,⁵. עלבונות כמו פציעות איסכמיה-פגיעה reperfusion יכול לשבש את שלמות פונקציונלית של BBB, להוביל חדירה עוקבות של מחזורי לויקוציטים אל parenchyma המוח המפעילות בסופו של דבר דלקת מוחית ופגיעות מוח ראשוניים ⁶ ^, ⁷. מודלים בעלי חיים יש צורך זיהוי מדויק תפקוד לקוי של BBB בעקבות התרחשות של אירוע מוחי. כאלה הן חשיבות רבה ללימוד שבבסיס מנגנונים הקשורים pathophysiological ולהציג neuroprotective אסטרטגיות חדשות. במבחנה תא תרבות מבוססי מודלים של BBB יש כבר מאוד שפותחו ונמצאות בשימוש במחקר מולקולרי של ה BBB physiopathology⁸^,⁹^,¹⁰. ובכל זאת, ויוו חייתיים, אשר מייצרים נזק איסכמי של BBB הדומה תנאים קליניים האנושי, הם גם משתלם מאוד בהקשר הזה. זיהוי כמותית extravasation של אוונס כחול (EB) היא טכניקה מקובלת היטב ורגיש שבו נעשה שימוש עבור הערכה של BBB תקינות ותפקוד מחלות ניווניות, לרבות שבץ איסכמי¹¹^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. שיטה זו היא חסכונית, ריאלי, הדירים החלים לחלוטין במעבדה כל ניסיוני. יישומה אינו דורש ציוד מתקדם, כגון קליעים נותבים רדיואקטיביים¹⁵ או תהודה מגנטית (MRI)¹⁶, כי הם התנאים המוקדמים עבור שיטות אחרות. במאמר זה נדגים באופן מקיף תהליכים טכניים בסיסיים של BBB הערכה באמצעות EB extravasation במודלים עכברוש של שבץ איסכמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות באוניברסיטת ארדביל מועצת המחקר הרפואי-מדעי עבור מחקרים בבעלי חיים (מספר הקוד האתי: IR. ARUMS. REC.1394.08)-במחקר זה דמיינו, השתמשנו למבוגרים זכר ספראג-Dawley חולדות (300-350 גר') המתקבל המכון מספוא (טהראן, איראן).

1. Flowmetry והרדמה

לגרום הרדמה באמצעות 4% איזופלוריין ולתחזק אותו עם איזופלוריין (1-1.5%) בתערובת של תחמוצת החנקן (70% v/v) וחמצן (30% v/v) משך זמן הניתוח.
במקום חיה anaesthetized בתנוחת שכיבה על שמיכת חימום מבוקר להזנה חוזרת ולשמור על טמפרטורת הגוף על 37±0.5 ° C באמצעות בדיקה רקטלית מחובר זו יחידת הסקה.
למרוח כמות קטנה של משחה אופטלמולוגיות בשתי העיניים למניעת יובש.
לגלח את האזור הכירורגי על הצד השמאלי של הגולגולת עם קוצץ חשמלי. השתמש betadine פתרון עם כרית גזה כדי לחטא את העור. לשטוף את האזור בפד סטרילי המכיל 70% אתנול, חזור על שני שלבים בשלושה מחזורים¹⁷.
על שיכוך כאבים, להזריק 0.2 מ של 0.5% נמשך subcutaneously לתוך אזור הניתוח¹⁷.
עושים חתך עור ארוך 1 ס מ על הגולגולת (המשתרעת canthus הלטראלי של העין השמאלית לבסיס של אוזן שמאל) ומנתחים את השריר temporalis השמאלי כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, ליצור בר קטן חור 5 מ מ לרוחב כדי 1 מ"מ אחורי לכביש bregma¹⁸ כדי להקל על השמה של הקצה של המכשיר עיפרון דופלר זרימה.
להפוך העכברוש מ נוטה לעמדה פרקדן ולאחר מכן שים החללית עיפרון לייזר לתוך הגולגולת בעבר קדח העיוור-החור כדי לנטר את זרימת הדם האזורית מוחי (rCBF).
להקליט rCBF הבסיסית של כל בעל חיים, תחשיב את זה כ- 100%. ראוי לציין, עורק המוח התיכון סגר (MCAO) הוא התחיל כל אימת לירידה rCBF של יותר מ- 80% שזוהו¹⁹^,²⁰.

2. אינדוקציה של איסכמיה מוקד Cerebra

לגלח את אזור הצוואר, לחטא את העור עם betadine פתרון ו- 70% אתנול. להזריק 0.2 מ של 0.5% נמשך subcutaneously באתר הניתוח שיכוך כאבים¹⁷.
עושים חתך כירורגי זמן 2 ס מ על גבי המשטח הגחון של הצוואר כדי לגשת את השמאלי עורק תרדמני (LCCA). לבודד את LCCA של השכן fascia והעצב התועה כדי לגשת נגע הסתעפות של עורק התרדמה החיצוני (ECA), העורק (ICA).
מאתרים ומפסיקים לצמיתות ' LCCA ' או ' ECA העסקת 5-0 בתפר משי ומנתחים ICA חינם לרמה של העורק pterygopalatine.
באופן רופף במקום עניבה של 5-0 בתפר משי סביב LCCA, וחברי ואז באופן זמני ICA עם מיקרו-סרטון כלי הדם.
עושים חתך קטן-LCCA לפני הקודם שמוקם העניבה רופף, להוסיף 4-0 בתפר ניילון מצופה סיליקון לתוך המרחב luminal של יק א ואז להדק את התפר סביב LCCA כדי לאבטח את התפר ניילון ולמנוע דולף הדם.
הסר את כלי הדם של המיקרו-קליפ יק א. לאחר מכן, מראש הלהט intraluminal מצופה סיליקון עד התבוננות התדרדרות ב rCBF זה מצביע על חסימה של המקור MCA. בסוף תקופת איסכמי (90 דקות), להתחיל פגיעה reperfusion פורש את התפר intraluminal²¹.

3. ומוחלף תעלות אוונס הכחול הזרקה (EB)

עושים חתך אורכי 1 ס מ בצוואר בצד שמאל של האמצע ומנתחים אז בלשון בוטה fascia שטחית משם כדי לגשת הסניף חיצוני של ווריד הצוואר השמאלי (LGV). לאחר מכן, לצמיתות מאתרים ומפסיקים את סוף הגולגולת LGV בתפר משי 5-0. באופן רופף במקום שני קשרים סביב הווריד, ואז באופן זמני תהדק את הלב סוף LGV של מיקרו-מלקחיים לכלי הדם.
עושים חתך קטן על LGV בין שני תפרים, ואז להוסיף סרום heparinized מלא קטטר לתוך מרחב luminal של LGV ואת שנייה, כ 10 מ מ. לאחר מכן, להדק את ליגטורות סביב הווריד מאובטחים הצנתר ולמנוע דימומים. להזריק כמויות קטנות של סרום כדי למנוע כיווץ את הווריד.
בתחילת תקופת פגיעה reperfusion, לאט תזריקי צבע EB (1 מ"ל/ק"ג של 2% פתרון EB בתוך תמיסת מלח) במשך 5 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הצינורית על ידי זריקה של 0.5 מ ל תמיסת מלח, למשוך את הצינורית בהזרקה לווריד¹²^,²².
לבסוף, תפר את החתכים צוואר וראש ולהזריק 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין intraperitoneally (IP) לחזור על הזריקה כל 6-8 h בתקופה פגיעה reperfusion נגד כאבים לאחר הניתוח¹⁷.
להזריק 5 מ של saline(IP) ומחוממת מראש כדי לספק לחות בתוך כלוב ההתאוששות¹⁷.
המקום החיה בכלוב שחזור מיוחד המצויד טמפרטורה, בקרת מיזוג אוויר ונטר את ההתאוששות של החיה מן ההרדמה.

4. הערכה של החדירות מחסום דם המוח

לאחר 24 שעות של פגיעה reperfusion, עמוק עזים ומתנגד החיה עם הנתרן התיופנטל. לאחר מכן, פתח את חלל בית החזה על ידי ביצוע חור קטן מתחת לעצם החזה.
עושים חור קטן באטריום ימין ולהזריק 250 מ ל תמיסת 0.9% מראש ומחוממת (37 הלעפה תרוטרפמט), בלחץ של 110 מ מ כספית דרך החדר השמאלי למשך 15 דקות לשטוף EB הרחק זרימת הדם עד היציאות מלוחים נורמלי מהאטריום הופך שקוף²³.
מיד להסיר את המוח לגולגולת ומקם אותה המטריצה המוח. לנתח את הריח הנורה, המח ולאחר מכן באמצעות סכין גילוח נקי, להפריד בין האונה הימנית של המוח משמאל (Lesioned) לאורך הקו האמצעי.
שוקל האונה כל homogenize אותם בנפרד ב- 2.5 מ ל תמיסת פוספט buffered ו מערבבים את זה עם 2.5 מ של חומצת חומץ טריכלור (60%) למשך 2 דקות בעזרת מכונה מערבולת.
צנטריפוגה דגימות המוח במשך 30 דקות ב 1,322 x g ולאפשר את הדוגמאות להתקרר במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
להשתמש את supernatants כדי לאמוד את ספיגת EB על ידי ספקטרופוטומטרים 610 nm²³.
לחשב ריכוזים EB מפני עיקול רגיל ותוצאות אקספרס כמו µg/g של רקמת המוח.

5. ייצור של העקומה סטנדרטי EB

הכינו 10 פתרונות לדוגמה EB עם ריכוזים של 1-10 µg של EB ב 5 מ ל תמיסת פוספט באגירה מלאה.
למדוד את ספיגת הערכים של כל דגימה-610 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים.
להפוך תרשים פיזור בעזרת גיליון אלקטרוני, נוכח ריכוז EB בציר ה-X ואת הערכים ספיגת בציר Y (איור 1).
הגדרת קו מגמה ליניארי של העקומה עם המשוואה שלו. לאחר מכן, להשתמש בו כדי להשיג את הריכוז EB של דגימות.
לדווח את התוצאות הסופיות של EB extravasation כמו µg/g ממשקל רקמת המוח.

6. מבצע המזויפים

בצע את אותו תהליך כירורגי עם חולדות בקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים (כולל ביצוע חתך באזור הצוואר, הזרקת EB) אבל לא לכלול את MCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היה הבדל משמעותי ברמות EB בהאונה הימנית לעומת האונה השמאלית של החולדות המופעלים דמה (1.06 ± 0.1 µg/g ו- 1.1 ± 0.09 µg/g, בהתאמה). כפי שמוצג דמויות 2A-2B, אינדוקציה של איסכמיה ארעי (איסכמיה 90 דקות / פגיעה reperfusion 24 שעות ביממה) גרם הבדל משמעותי ברמות EB (10.41 ± 0.84 µg/g, p < 0.001) באונה השמאלית של חולדות איסכמי, לעומת בהתאמה המיספירה # חצי הכדור בחולדות המופעלים באמצעות העמדת פנים. באופן קולקטיבי, ממצאים אלו מצביעים על כך בתנאים רגילים, EB לא יכול בקלות לעבור BBB לתוך parenchyma מוחי מוחי איסכמי עלבונות לגרום extravasation של EB דרך חדירות משופרת של BBB (דמויות 2A ו- 2B).

איור 1 : עקומת הסטנדרטי משמשת כדי לקבוע ריכוז EB מתוך הערכים ספיגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : הערכה של BBB שיבוש מאת EB extravasation 24 שעות לאחר שבץ איסכמי. הצילום של המוחות בכל החיות המזויפים ונבחרות איסכמי (A). האינטנסיביות של extravasation EB ברקמת המוח (צבע כחול) נובע מידת השיבוש BBB בחצי הכדור lesioned. EB ריכוז בדגימות מוכן משמאל (lesioned) ואז בדיוק האונות במוח את החיות המזויפים ונבחרות איסכמי (B) (n = 6, *p< 0.001 לעומת האונה השמאלית בקבוצה המזויפים, p< 0.001 בהשוואה חולשת חצי הכדור של אותה קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עד כה, בשיטות שונות כגון autoradiography וזיהוי של קליעים נותבים רדיואקטיביים²⁴^,²⁵, immunofluorescence מיקרוסקופ²⁶^,²⁷, EB extravasation טכניקה²⁰^, ²³ השתמשו כדי להעריך את הנזק מחסום הדם - מוח. EB לצבוע בחום מסוגל לקשור אלבומין והוא משמש מכשיר מעקב עבור איתור דליפה כלי הדם של לכימות²⁸^,²⁹¹¹^,התמוטטות BBB. שיטה מקובלת מאוד ואמינה, הטכניקה extravasation EB מספקת הערכה ישירה על השלמות של BBB המושפע על-ידי פציעות מוח שונים, כולל שבץ איסכמי.

In vivo הערכה של BBB מאפשר לחוקרים לחקור מנגנונים הקשורים pathophysiological אפשריים של איסכמיה המושרה vasogenic במוח בצקת וכדי למצוא התערבויות טיפוליות חדשות. מודל זה אינו דורש מתקנים מיוחדים והוא יכול לייצר תוצאות מהימנות עם אחוזי הצלחה גבוהים ניסויים (יותר מ 80 אחוז)¹³^,²⁰. עם גישה ישירה לרקמת המוח, מודל זה מאפשר הערכות ומדויקים של שלמות BBB אבל מוגבל לשימוש מחקרים ארוכי טווח.

השינויים הפתולוגיים ב BBB הנגרמת על ידי שבץ איסכמי לפתח ב-3 שלבים: חריפה (בתוך שעות), תת חריפה (שעות עד ימים), כרונית (ימים חודשים)³⁰^,³¹. ברור, התערבויות טיפוליות המוקדם לייצר אפקטים מגן יקר בשלב פתולוגיים חריפה. EB המינון נקודת הזמן של הזרקת שני פרמטרים חיוניים להשגת תוצאות אמינות באופן הדינמי של BBB בעקבות עלבונות איסכמי בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. לפיכך, הזרקה של לצבוע EB באיטיות דרך בצינורית הווריד באמצעות את המינון המתאים (1 מ"ג/ק"ג של 2% פתרון EB בתוך תמיסת מלח) לאחר תחילת תקופת פגיעה reperfusion הוא גורם חשוב ומאפשר המחקר של שינויים הקשורים pathophysiological בשלבים המוקדמים של שבץ .

מספר שיטות ניסיוניים שהוצגו ללמוד שבץ איסכמי. במודל זה ניסיוני, השתמשנו MCAO עם השיטה נימה intraluminal שיוצר תנאים דומה האדם קו²¹^,³². טכניקה זו היא פשוטה ואמינה; עם זאת, הוצאתו לפועל צריך לקחת בחשבון כמה נקודות טכני כדי לשפר את הביצועים של הטכניקה ולהבטיח רמת הדיוק שלה עוד יותר. יש לשמור טמפרטורת גוף בטווח פיזיולוגיים במהלך הניתוח, כאשר לחץ הדם וגזים הדם חייב להיות בפיקוח³³^,³⁴^,³⁵. קבוע הקלטה של rCBF עם זרימה דופלר לייזר ושימוש מתאים מוכן פילמנט מצופה סיליקון יכול להגדיל את שיעור ההצלחה MCAO אלא גם להפחית את שיעור התמותה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים בסגן הקנצלר לחקר ארדביל האוניברסיטה למדעי הרפואה (ארדביל, איראן) לקבלת סיוע כספי (גרנט לא: 9607).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below 25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals \|	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G