Neuroscience

تقييم في فيفو لتعطيل حاجز الدم في الدماغ في نموذج الفئران من السكتة الدماغية

Published: March 11, 2018 doi: 10.3791/57156

Hamdollah Panahpour¹, Mehdi Farhoudi², Yadollah Omidi³, Javad Mahmoudi²

¹Department of Physiology, Medical School, Ardabil University of Medical Sciences, ²Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, ³Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Faculty of Pharmacy, Tabriz University of Medical Sciences

Summary

والهدف العام من هذا الإجراء توفير تقنية عالية استنساخه في فيفو التقييم لتعطيل حاجز الدم في الدماغ في نماذج الفئران من السكتة الدماغية.

Abstract

السكتة الدماغية يؤدي إلى فاسوجينيك وذمة دماغية وإصابة في الدماغ الأولية اللاحقة، الذي تم بوساطة من خلال تدمير حاجز الدم في الدماغ (BBB). أنشئت الفئران المستحث السكتة الدماغية واستخدامها كنماذج في فيفو للتحقيق في سلامة BBB الوظيفية. يمكن كشف spectrophotometric إيفانز الأزرق (المجلس التنفيذي) في عينات المخ مع الإصابات الدماغية تبريرا موثوقة لبحوث وتطوير طرائق علاجية مبتكرة. هذا الأسلوب ينشئ نتائج استنساخه، وقابلاً للتطبيق في أي مختبر دون حاجة إلى معدات خاصة. هنا، نحن نقدم توجيهي تصور والتقنية في الكشف عن التسرب من المجلس التنفيذي عقب تنظيم دورات تعريفية للسكتة الدماغية في الفئران.

Introduction

فاسوجينيك وذمة الدماغ بسبب تعطل حاجز الدم في الدماغ (BBB) يظل مضاعفات هامة من السكتة الدماغية، وعاملا محدداً رئيسيا لمعدل البقاء على قيد الحياة في¹^،²مرضى السكتة الدماغية. حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي)، وهو يتكون من خلايا الدماغ بطانية الشعرية (بسيكس) وتتألف من مكونات متميزة نيوروفاسكولار (مثلاً، تقاطعات ضيق بين بسيكس، بيريسيتيس، أستروجليال، والخلايا العصبية³)، ينص واجهة المتخصصة ودينامية بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والدورة الدموية الطرفية⁴^،⁵. يمكن تعطيل تكامل وظيفي BBB الشتائم مثل إصابات الاسكيمية-ضخه وتؤدي إلى اختراق لاحقة تعميم الكريات البيضاء إلى حمة الدماغ التي تؤدي في نهاية المطاف إلى الالتهاب الدماغي وإصابات الدماغ الأولية ⁶ ^, ⁷-هناك حاجة إلى نماذج حيوانية للكشف الدقيق عن اختلال وظيفي BBB عقب حدوث جلطة. هذه النماذج ذات أهمية كبيرة لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة والأخذ باستراتيجيات جديدة محصن. في المختبر الخلية المستندة إلى الثقافة نماذج BBB قد تم العالية المتقدمة والمستخدمة للدراسة الجزيئية BBB الفيزيولوجيا المرضية⁸^،^،من⁹¹⁰. ومع ذلك، في فيفو نماذج حيوانية، التي تنتج الأضرار الدماغية BBB مشابهة للظروف السريرية البشرية، أيضا المفيد جداً في هذا الصدد. الكشف عن كمية التسرب إيفانز الأزرق (EB) هو تقنية مقبولة تماما والحساسة التي استخدمت لتقييم سلامة BBB والدالة في أمراض الأعصاب، بما في ذلك السكتة الدماغية¹¹^، ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. هذا الأسلوب فعالة من حيث التكلفة ومجدية واستنساخه، وينطبق تماما في أي مختبر تجريبي. لا يتطلب تنفيذه المعدات المتقدمة، مثل تتبع المشعة¹⁵ أو التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)¹⁶، التي شروط مسبقة لأساليب أخرى. في هذه المقالة، نظهر صورة شاملة العمليات التقنية الأساسية لتقييم BBB لاستخدام EB التسرب في نماذج الفئران من السكتة الدماغية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة أردبيل من "مجلس بحوث العلوم الطبية" لإجراء الدراسات الحيوانية (رقم "معرف الأخلاقية": الأشعة تحت الحمراء. أرومس. REC.1394.08). في هذه الدراسة تصور، استخدمنا الفئران سبراغ داولي الذكور البالغين (300-350 غ)، التي تم الحصول عليها من معهد المراعي (طهران).

1-التخدير وفلووميتري

حمل isoflurane 4% باستخدام التخدير والمحافظة عليه مع إيسوفلوراني (1-1.5%) في خليط من أكسيد النيتروز (70% v/v) والأكسجين (30% v/v) طوال مدة الجراحة.
ضع حيوان أنايسثيتيزيد في الموقف الذي عرضه على بطانية تدفئة التغذية المرتدة التي تسيطر عليها، والحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37±0.5 درجة مئوية عن طريق تحقيق المستقيم متصل بهذا وحدة التدفئة.
تنطبق على كمية صغيرة من مرهم العيون في كلتا العينين لمنع جفاف.
حلق المنطقة الجراحية على الجانب الأيسر من الجمجمة مع لوس أنجليس كليبرز الكهربائية. استخدم الحل تدين بوسادة شاش لتطهير الجلد. شطف هذه المنطقة مع لوحة عقيمة التي تحتوي على الإيثانول 70% وكرر كل الخطوات لثلاث دورات¹⁷.
للتسكين، حقن 0.2 مل بوبيفاكيني 0.5% تحت الجلد في منطقة الجراحة¹⁷.
جعل شق جلد طويلة 1 سم في الجمجمة (تمتد من كانتوس الوحشي للعين اليسرى لقاعدة للإذن اليسرى) وتشريح العضلات تيمبوراليس اليسرى لفضح الجمجمة. ثم، إنشاء لدغ صغيرة الثقب الجانبي 5 مم إلى 1 مم الخلفي إلى بريجما¹⁸ لسهولة وضع غيض من مقياس التدفق دوبلر قلم التحقيق.
إيقاف الفئران من عرضه لموقف ضعيف، ومن ثم وضع المسبار قلم الليزر في الجمجمة المحفورة سابقا الأعمى-حفرة لمراقبة تدفق الدم الدماغي الإقليمية (rCBF).
تسجيل الأساس ركبف كل الحيوانات واعتبار هذا 100%. جدير بالذكر أن بدء انسداد الشريان الدماغي الأوسط (ماكاو) كلما تم اكتشاف¹⁹^،²⁰انخفاضا في ركبف لأكثر من 80%.

2-تحريض الاسكيمية المخي المحورية

حلاقة منطقة الرقبة وتطهير الجلد مع الإيثانول تدين الحل و 70%. حقن 0.2 مل بوبيفاكيني 0.5% تحت الجلد في موقع الجراحة لتسكين¹⁷.
إجراء شق جراحي طويل 2 سم في السطح البطني للرقبة الوصول إلى الشريان السباتي المشترك الأيسر (لككا). عزل لككا من اللفافة المجاورة والعصب المبهم الوصول إلى التشعب الشريان السباتي الخارجي (اللجنة الاقتصادية لأفريقيا) والشريان السباتي الداخلي (ICA).
اضطر بشكل دائم لككا أو توظف خياطة حرير 5-0 في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وتشريح ICA مجاناً على مستوى الشريان بتيريجوبالاتيني.
ضع فضفاضة تعادل من 5-0 خياطة الحرير حول لككا، وثم مؤقتاً المشبك الحلف مع مقطع الدقيقة والأوعية الدموية.
إجراء شق صغير في لككا قبل التعادل فضفاضة الموضوعة سابقا، ثم إدراج خياطة نايلون المغلفة بالسيليكون 4-0 في الفضاء لومينال للتحالف التعاوني الدولي وتشديد الخياطة حول لككا لتأمين خياطة النايلون ومنع تسرب الدم.
إزالة الأوعية الدموية الصغرى-المقطع من منطقة السيطرة الإسرائيلية. ثم المضي قدما خيوط intraluminal المغلفة سيليكون حتى مراقبة انخفاض ملحوظ في ركبف الذي يشير إلى انسداد منشأ MCA. في نهاية الفترة الدماغية (90 دقيقة)، بدء ضخه بسحب خياطة إينترالومينال²¹.

3-كانوليشن حبل الوريد وايفانز الزرقاء الحقن (المجلس التنفيذي)

جعل شق طولية 1 سم في الرقبة إلى الجانب الأيسر من خط الوسط وثم صراحة تشريح اللفافة السطحية بعيداً الوصول إلى فرع خارجي من حبل الوريد الأيسر (LGV). ثم، بشكل دائم اضطر الجمجمة نهاية LGV مع خياطة الحرير 5-0. فضفاضة الروابط اثنين حول هذا السياق، وثم مؤقتاً المشبك نهاية LGV مع مايكرو-المشبك الأوعية الدموية القلبية.
إجراء شق صغير في LGV بين خيوط اثنين، وثم إدراج قسطرة هيبارينيزيد المصل شغلها في الفضاء لومينال LGV ومسبقا أنه حوالي 10 ملم. بعد ذلك، تشديد الأربطة حول الوريد لتأمين القسطرة ومنع النزيف. ضخ كميات صغيرة من المصل لتجنب الانهيار في الوريد.
في بداية فترة ضخه، ببطء حقن صبغة EB (1 مل/كجم حل المجلس التنفيذي 2% في المحلول الملحي) على مدى فترة 5 دقائق. وفي وقت لاحق، يغسل القنية بحقن المحلول الملحي العادي 0.5 مل وتنسحب قنية الحقن الوريد¹²^،²².
وأخيراً، خياطة شقوق الرقبة والرأس وحقن البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ إينترابيريتونيلي (IP) وتكرار الحقن كل ح 6-8 خلال الفترة ضخه للتسكين بعد العمليات الجراحية¹⁷.
ضخ 5 مل saline(IP) المعالجون مسبقاً لتوفير الماء في قفص الانتعاش¹⁷.
مكان هذا الحيوان في قفص استرداد خاصة مجهزة بدرجة الحرارة والتحكم في تكييف الهواء ورصد استرداد الحيوان من التخدير.

4-تقييم نفاذية حاجز دم الدماغ

بعد 24 ساعة ضخه، عميق تخدير الحيوان مع بنتوثال الصوديوم. بعد ذلك، فتح تجويف الصدر بإجراء ثقب صغير تحت القص.
جعل فتحه صغيرة في الاذين الأيمن وضخ 250 مل من قبل حرارة المالحة 0.9% (37 ˚C) عند ضغط 110 مم زئبق من خلال البطين الأيسر لمدة 15 دقيقة لغسل EB بعيداً عن التداول حتى مخارج المالحة العادية من الأتريوم يصبح عديم اللون²³.
على الفور إزالة الدماغ من الجمجمة ووضعها في مصفوفة الدماغ. تشريح لمبة شمي والمخيخ، ومن ثم استخدام شفرة حلاقة نظيفة، فصل في نصف الكرة الأيسر من الدماغ من اليسار (ليسيونيد) على طول خط الوسط.
تزن كل نصف الكرة الأرضية وتجانسه لهم في 2.5 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة بشكل منفصل، ومزيج هذا مع 2.5 مل حمض التريكلوروسيتيك (60%) ل 2 دقيقة باستخدام آلة دوامة.
الطرد المركزي عينات المخ لمدة 30 دقيقة في 1,322 س ز وتسمح العينات لتبرد في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
استخدام سوبيرناتانتس في تقدير امتصاص EB بجهاز المطياف الضوئي في شمال البحر الأبيض المتوسط 610²³.
حساب تركيزات EB ضد منحنى قياسي والتعبير عن النتائج ميكروغرام/غرام أنسجة المخ.

5-إنتاج المنحنى القياسي EB

إعداد 10 عينة حلول للمجلس التنفيذي بتركيزات من 1-10 ميكروغرام للمجلس التنفيذي في 5 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة مؤقتاً.
قياس قيم امتصاص كل عينة في 610 نيوتن متر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
جعل مخطط مبعثر باستخدام جدول بيانات وتركيزات المجلس التنفيذي الحالي على المحور س، وقيم امتصاص على محور Y (الشكل 1).
تحديد خط اتجاه خطي للمنحنى مع المعادلة لها. ثم استخدم للحصول على تركيز المجلس التنفيذي من العينات.
تقرير النتائج النهائية للتسرب EB ميكروغرام/غرام وزن أنسجة الدماغ.

6-شام العملية

إجراء العملية الجراحية نفسها مع الفئران في المجموعة تعمل بالشام (بما في ذلك إجراء شق في منطقة الرقبة وحقن EB) لكنها تستبعد في ماكاو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان هناك لا اختلاف كبير في مستويات EB في نصف الكرة الغربي الحق مقابل نصف الكرة الأيسر من الفئران تعمل بالشام (1.06 ± 0.1 ميكروغرام/غرام و 1.1 ± 0.09 ميكروغرام/لتر، على التوالي). كما هو موضح في الأرقام 2 ألف-2، تحريض الاسكيمية العابرة (الاسكيمية 90 دقيقة/ضخه ح 24) بسبب اختلاف كبير في مستويات EB (10.41 ± 0.84 ميكروغرام/لتر، ف < 0.001) في نصف الكرة الأيسر من الفئران الدماغية، مقارنة كل منها نصف الكرة الغربي في الفئران تعمل بالشام. جماعياً، تشير هذه النتائج إلى أن تحت الظروف العادية، EB لا سهولة عبور BBB حمة الدماغي والشتائم والسكتات الدماغية الحث على التسرب من المجلس التنفيذي من خلال زيادة نفاذية BBB (الأرقام 2 ألف و 2 باء).

الشكل 1 : يستخدم المنحنى المعياري لتحديد تركيز المجلس التنفيذي من قيم امتصاص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : تقييم اضطراب BBB من قبل المجلس التنفيذي التسرب 24 ساعة بعد السكتة الدماغية. صورة للمخ في الحيوانات تعمل بالشام والدماغية (A). كثافة EB التسرب في أنسجة المخ (اللون الأزرق) ينشأ عن مدى اضطراب BBB في نصف الكرة الغربي lesioned. تركيز المجلس التنفيذي في عينات أعد من اليسار (ليسيونيد) والحق في نصفي الكرة الدماغ في الحيوانات تعمل بالشام والدماغية (ب) (n = 6، *ف< 0.001 مقارنة بنصف الكرة الأيسر في مجموعة الشام، ف< 0.001 بالمقارنة مع عن نصف الكرة الأرضية لنفس المجموعة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وحتى الآن، أساليب مختلفة مثل أوتوراديوجرافي والكشف عن تتبع المشعة²⁴^،²⁵، الفلورة مجهرية²⁶^،²⁷، ونقحت التسرب تقنية²⁰^، ²³ قد استخدمت لتقييم الضرر حاجز الدم في الدماغ. صبغ المجلس التنفيذي بقوة قادرة على ربط ألبومين المصل ويستخدم الراسم للكشف عن التسرب والأوعية الدموية والتحديد الكمي لل BBB انهيار¹¹^،^،من²⁸²⁹. كطريقة مقبولة للغاية ويمكن الاعتماد عليها، توفر تقنية التسرب EB تقدير مباشر على السلامة BBB الذي يتأثر بمختلف الإصابات الدماغية بما في ذلك السكتة الدماغية.

في فيفو تقييم BBB يسمح للباحثين لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية ممكنة من الاسكيمية التي يسببها فاسوجينيك وذمة الدماغ وإيجاد التدخلات العلاجية الجديدة. هذا النموذج لا تتطلب مرافق خاصة، ويمكن أن تنتج نتائج موثوق بها مع نسبة نجاح عالية في تجارب (أكثر من 80 في المائة)¹³^،²⁰. مع الوصول المباشر إلى أنسجة المخ، هذا النموذج يمكن تقييمات دقيقة للغاية لسلامة BBB ولكنه مقيد بالدراسات الطويلة الأجل.

وضع التغييرات المرضية في BBB الناجم عن السكتة الدماغية في ثلاث مراحل: الحادة (خلال ساعة)، شبه حادة (ساعات إلى أيام)، والمزمن (أيام إلى أشهر)³⁰^،³¹. ومن الواضح أن أقرب التدخلات العلاجية آثاراً قيمة وقائية في المرحلة المرضية الحادة. الجرعة EB والنقطة الزمنية لحقن على معلمتين بالغ الأهمية للحصول على نتائج موثوقة نظراً للطابع الدينامي ل BBB عقب الشتائم الدماغية. ومن ثم، حقن الصبغة EB ببطء عبر قنية الوريد باستخدام الجرعة المناسبة (1 مغ/كغ حل المجلس التنفيذي 2% في المحلول الملحي) بعد بداية فترة ضخه عاملاً هاما ويتيح دراسة التغيرات الفيزيولوجية المرضية في المراحل المبكرة من السكتة الدماغية .

وقد أدخلت عدة طرق تجريبية لدراسة السكتة الدماغية. وفي هذا النموذج التجريبي، استخدمنا ماكاو مع الأسلوب الشعيرة إينترالومينال الذي يخلق ظروفا مماثلة للمخ البشري²¹^،³². هذا الأسلوب بسيط ويمكن الاعتماد عليها؛ ومع ذلك، يحتاج تنفيذه تأخذ في الاعتبار بعض النقاط التقنية لزيادة تعزيز أداء هذه التقنية وضمان دقتها. يجب أن تبقى درجة حرارة الجسم ضمن النطاق الفسيولوجية أثناء الجراحة، بينما يجب أن تكون ضغط الدم وغازات الدم رصد³³^،^،من³⁴³⁵. ثابت تسجيل rCBF مع مقياس التدفق دوبلر ليزر واستخدام المناسبة إعداد خيوط المغلفة بالسيليكون يمكن زيادة معدل نجاح ماكاو، بل أيضا خفض معدل الوفيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب ممتنون لنائب رئيس الجامعة للبحث أردبيل جامعة للعلوم الطبية (أردبيل، إيران) للدعم المالي (منحة أي: 9607).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below 25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals \|	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G