Neuroscience

Bedømme i Vivo blod - hjerne barrieren avbrudd i en rotte modell av iskemiske hjerneslag

Published: March 11, 2018 doi: 10.3791/57156

Hamdollah Panahpour¹, Mehdi Farhoudi², Yadollah Omidi³, Javad Mahmoudi²

¹Department of Physiology, Medical School, Ardabil University of Medical Sciences, ²Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, ³Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Faculty of Pharmacy, Tabriz University of Medical Sciences

Summary

Det overordnede målet med denne prosedyren er å gi en svært reproduserbar teknikk i vivo vurdering av blod - hjerne barrieren avbrudd i rotte modeller av iskemiske hjerneslag.

Abstract

Iskemiske hjerneslag fører til vasogenic hjerne edema og påfølgende primære hjerneskade, som er formidlet gjennom ødeleggelsen av blod - hjerne barrieren (BBB). Rotter med indusert iskemiske hjerneslag ble etablert og brukt som modeller i vivo undersøke funksjonelle integriteten til BBB. Spektrofotometri påvisning av Evans blå (EB) i hjernen prøvene med iskemiske skader kan gi pålitelig begrunnelse for forskning og utvikling av romanen terapeutiske modaliteter. Denne metoden genererer reproduserbar resultater, og gjelder i alle laboratorium uten behov for spesialutstyr. Her presenterer vi en visualisert og teknisk veiledning på deteksjon av bloduttredelse av EB etter induksjon av iskemiske hjerneslag i rotter.

Introduction

Vasogenic hjernen ødem på grunn av blod - hjerne barrieren (BBB) avbrudd fortsatt en viktig komplikasjon av iskemiske hjerneslag og en viktig determinant av overlevelse i slag pasienter¹^,². Den blod - hjerne barrieren (BBB), som er dannet av hjernen kapillær endotelceller (BCECs) og består av forskjellige nevrovaskulære komponenter (f.eks stramt veikryss blant BCECs, pericytes, astroglial og neuronal celler³), gir en spesialisert og dynamisk grensesnitt mellom sentralnervesystemet (CNS) og perifere blodsirkulasjonen⁴^,⁵. Fornærmelser som ischemia-reperfusion skader kan forstyrre funksjonelle integriteten til BBB og føre til etterfølgende penetrasjon av sirkulerende leukocytter i hjernen parenchyma som til slutt utløse cerebral betennelse og primære hjerneskader ⁶ ^, ⁷. dyremodeller kreves for nøyaktig påvisning av dysfunksjon av BBB etter forekomst av hjerneslag. Slike modeller er av stor betydning for å studere underliggende patofysiologiske mekanismer og introdusere nye neuroprotective strategier. In vitro celle kultur-baserte modeller av BBB er svært utviklet og brukt for molekylære studier av BBB physiopathology⁸^,⁹^,¹⁰. Likevel er i vivo dyr modeller, som produserer iskemiske skader av BBB ligner menneskelige kliniske forhold, også veldig verdt i denne forbindelse. Kvantitativ påvisning av bloduttredelse Evans blå (EB) er en godt akseptert og følsom teknikk som har blitt brukt for vurdering av BBB integritet og funksjon i nevrodegenerative sykdommer, inkludert iskemiske hjerneslag¹¹^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. denne metoden er kostnadseffektiv, gjennomførbare, reproduserbare og helt aktuelt i noen eksperimentelle laboratorium. Gjennomføringen krever ikke avansert utstyr, som radioaktivt tracers¹⁵ eller magnetisk resonans imaging (MRI)¹⁶, som er forutsetninger for andre metoder. I denne artikkelen viser vi omfattende grunnleggende tekniske prosesser av BBB vurdering ved hjelp av EB bloduttredelse i rotte modeller av iskemiske hjerneslag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene i Ardabil University of Medical Sciences Research Council for å gjennomføre dyrestudier (etiske IDen: IR. ARUMS. REC.1394.08). I denne visualisert studien vi brukte voksen Sprague-Dawley hannrotter (300-350 g) fra beite Institute (Sveits).

1. anestesi og Flowmetry

Indusere anestesi med 4% isoflurane og opprettholde det med isoflurane (1-1,5%) i en blanding av lystgass (70% v/v) og oksygen (30% v/v) for varigheten av operasjonen.
Plasser en anaesthetized dyr i liggende stilling på en tilbakemelding kontrollert oppvarming teppe og opprettholde kroppstemperatur på 37±0.5 ° C ved hjelp av en endetarms sonde koblet til denne oppvarming enhet.
Bruk en liten mengde ophthalmica salve på begge øynene å hindre tørrhet.
Barbere det kirurgiske området på venstre side av skallen med elektrisk avklipt. Bruk betadine løsning med en gauze pute for å desinfisere huden. Skyll denne regionen med en bakteriefri pute med 70% etanol og gjenta både for tre sykluser¹⁷.
For analgesi, injisere 0,2 mL 0,5% bupivacaine subcutaneously i kirurgi regionen¹⁷.
Gjøre en 1 cm lang huden snitt på skallen (utvide fra den laterale canthus av venstre øye til bunnen av venstre øre) og dissekere venstre temporalis muskelen å avsløre skallen. Deretter Opprett en liten burr hull 5 mm lateral å og 1 mm bakenfor bregma¹⁸ letthet plasseringen til spissen av Doppler flowmeter blyant sonden.
Slå rotta fra utsatt for supine posisjon, og deretter sette laser blyant sonden i tidligere boret skallen blind-hullet overvåke regionale cerebral blodstrøm (rCBF).
Registrere hvert dyr planlagte rCBF og vurdere dette som 100%. Spesielt startes arteria cerebri okklusjon (MCAO) når en nedgang i rCBF på mer enn 80% er oppdaget¹⁹^,²⁰.

2. induksjon av fokal Cerebra Ischemia

Barbere nakken regionen og rense huden med betadine løsning og 70% etanol. Injisere 0,2 mL 0,5% bupivacaine subcutaneously i operasjon område for analgesi¹⁷.
Gjøre en 2 cm lange kirurgisk snitt i ventrale overflaten av halsen til det venstre arteria carotis communis (LCCA). Isolere LCCA fra nærliggende konseptkjedene og nervus vagus til bifurkasjonen av den eksterne arteria carotis (ECA) og den interne arteria carotis (ICA).
Ligate permanent enten LCCA eller ECA ansette en 5-0 silke Sutur og dissekere ICA gratis til nivået av pterygopalatine arterien.
Løst plassere et slips av 5-0 silke Sutur rundt LCCA, og deretter midlertidig ICA klemme en vaskulær mikro-klipp.
Lag et lite innsnitt på LCCA før tidligere plassert løs slips, og deretter inn en 4-0 silisium-belagt nylon Sutur luminal løpet av ICA og stramme suture rundt LCCA å sikre det nylon suture og hindre blod lekker.
Fjerne den vaskulære mikro-klipsen fra ICA. Deretter forhånd en silikon belegg intraluminal filament til observere en markant nedgang i rCBF som angir okklusjon av MCA opprinnelse. På slutten av iskemiske perioden (90 minutter), start reperfusion ved uttak intraluminal Sutur²¹.

3. vena jugularis Cannulation og Evans blå (EB) injeksjon

Lag en 1 cm langsgående snitt i nakken på venstre side av midtlinjen og deretter rett ut dissekere bort fascia superficialis til den eksterne delen av venstre vena jugularis (LGV). Deretter permanent ligate cranial slutten av LGV med 5-0 silke Sutur. Løst plasser to bånd rundt venen, og deretter klemme midlertidig cardiac slutten av LGV med en vaskulær mikro-klemme.
Lag et lite innsnitt på LGV mellom to bildet, og deretter inn heparinized serum fylt kateter luminal løpet av LGV og frem ca 10 mm. etterpå, stramme ligaturer rundt venen å sikre kateter og hindre blødning. Injisere små mengder av serum å unngå skjule venen.
I begynnelsen av reperfusion perioden, Injiser sakte EB fargestoff (1 mL/kg 2% EB løsning i saltvann) løpet 5 min. Deretter vaske kanyle ved injeksjon av 0,5 mL normal saline og trekke injeksjon kanyle blodåre¹²^,²².
Endelig Sutur de hals og hode incisions og injisere 0,05 mg/kg buprenorfin intraperitoneally (IP) og gjenta injeksjon hver 6-8 h i reperfusion perioden for postoperativ analgesi¹⁷.
Injisere 5 mL forvarmes saline(IP) å gi fuktighet i utvinning bur¹⁷.
Stedet dyr i en spesiell utvinning bur utstyrt med temperaturen og air condition kontroll og overvåke utvinning av dyret bedøvelsen.

4. vurdering av blod hjernen barriere permeabilitet

Etter 24 timer av reperfusion, dypt bedøve dyret med natrium thiopental. Deretter åpne bryst hulrom ved å lage et lite hull under sternum.
Gjør en liten åpning i høyre atriet og injisere 250 mL forvarmes 0,9% saltoppløsning (37 grader) ved et trykk på 110 mmHg gjennom venstre ventrikkel i 15 min å vaske EB fra sirkulasjonen til normal saline utgangene fra atrium blir fargeløs²³.
Umiddelbart fjerne hjernen fra skallen, og plasser den i hjernen matrisen. Dissekere olfactory pære og lillehjernen, og deretter bruke en ren barberblad, skille høyre halvkule av hjernen fra venstre (Lesioned) langs midtlinjen.
Veie hver halvkule og homogenize dem separat i 2,5 mL fosfat bufret saltoppløsning, og miks dette med 2,5 mL Trekloredikksyre (60%) i 2 minutter med en vortex maskin.
Sentrifuge hjernen prøver for 30 min 1,322 x g og la prøvene å kjøle seg ned i 4 ° C kjøleskap i 10 min.
Bruk supernatants for å beregne EB absorbansen ved et spektrofotometer 610 nm²³.
Beregne EB konsentrasjoner mot en standard kurve og uttrykke resultater som µg/g av hjernevevet.

5. produksjonen av EB standardkurve

Forberede 10 utvalg løsninger av EB med konsentrasjoner av 1-10 µg av EB i 5 mL fosfat bufret saltoppløsning.
Måle absorbansen verdiene for hvert utvalg på 610 nm bruker et spektrofotometer.
Lage et punktdiagram med et regneark og nåværende EB konsentrasjoner på X-aksen og absorbansen verdier på Y-aksen (figur 1).
Definere en lineær trendlinje for kurven med ligningen. Deretter Bruk det for å få EB konsentrasjonen av eksempler.
Rapporter de endelige resultatene av EB bloduttredelse som µg/g av hjernen vev vekten.

6. humbug operasjon

Utføre samme kirurgisk prosessen med rotter i humbug-opererte gruppen (inkludert gjør et snitt i nakken regionen og EB injeksjon), men utelater MCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det var ingen signifikant forskjell i EB nivåer i høyre halvkule mot venstre halvkule av humbug-opererte rotter (1.06 ± 0,1 µg/g og 1.1 ± 0.09 µg/g, henholdsvis). Som vist i tall 2A-2Binduksjon av forbigående iskemi (90 min iskemi / 24t reperfusion) forårsaket en betydelig forskjell i EB nivåer (10.41 ± 0.84 µg/g, p < 0,001) i venstre halvkule av iskemiske rotter, sammenlignet med de respektive halvkule i humbug-opererte rotter. Samlet viser disse funnene at under normale forhold, EB ikke lett krysse BBB inn cerebral parenchyma og cerebral iskemiske fornærmelser indusere bloduttredelse av EB gjennom en forbedret permeabilitet av BBB (tall 2A og 2B).

Figur 1 : Standardkurven brukes til å bestemme EB konsentrasjonen av absorbansen verdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Vurdering av BBB avbrudd av EB bloduttredelse 24 timer etter iskemiske hjerneslag. Fotografiet av hjernen i humbug-opererte og iskemiske dyr (A). Intensiteten av EB bloduttredelse i hjernevevet (blått) oppstår fra omfanget av BBB avbrudd i den lesioned halvkulen. EB konsentrasjon i prøver forberedt fra venstre (lesioned) og høyre halvkuler av hjernen humbug-opererte og iskemiske dyrene (B) (n = 6, *p< 0,001 sammenlignet med venstre halvkule i humbug gruppen p< 0,001 sammenlignet ipsilateral halvkule samme gruppe). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hittil har ulike metoder som autoradiography og oppdagelsen av radioaktivt tracers²⁴^,²⁵, immunofluorescence mikroskopi²⁶^,²⁷og EB bloduttredelse teknikk²⁰^, ²³ har blitt brukt til å vurdere skaden blod - hjerne barrieren. EB fargestoff kan sterkt binde til serum albumin og brukes som et sporingsstoff for å oppdage vaskulær lekkasje og kvantifisere BBB oversikt¹¹^,²⁸^,²⁹. Som en svært akseptert og pålitelig metode gir EB bloduttredelse teknikken en direkte estimering på integriteten av BBB som påvirkes av ulike hjerne skader inkludert iskemiske hjerneslag.

I vivo vurdering av BBB kan forskere studere mulige patofysiologiske mekanismer for iskemi indusert vasogenic brain ødem og finne nye terapeutisk intervensjon. Denne modellen krever ikke spesielle fasiliteter og kan gi troverdig resultater med høy suksessrate i eksperimenter (mer enn 80%)¹³^,²⁰. Med direkte tilgang til hjernevev, denne modellen gjør svært nøyaktig vurderinger av BBB integritet, men er begrenset til langsiktige studier.

Patologiske forandringer i BBB forårsaket av iskemiske hjerneslag utvikle i tre faser: akutt (i timer), sub akutt (timer til dager), og kroniske (dager til måneder)³⁰^,³¹. Selvfølgelig, de tidligste terapeutisk intervensjonene produserer verdifulle beskyttende effekter i akutt patologisk fase. EB dosering og tidspunkt av injeksjon er to viktige parametere for å få pålitelige resultater på grunn av dynamikken av BBB etter iskemiske fornærmelser. Derfor injeksjon av fargestoff EB sakte via en blodåre kanyle bruker den passende dosen (1 mg/kg av 2% EB løsning i saltvann) etter reperfusion perioden er en viktig faktor og gir studere patofysiologiske endringer i de tidlige stadiene av slag .

Flere eksperimentelle metoder har blitt introdusert for å studere iskemiske hjerneslag. I denne eksperimentelle modellen brukte vi MCAO med intraluminal filament metoden som skaper forutsetninger ligner menneskelige slag²¹^,³². Denne teknikken er enkelt og pålitelig. men må gjennomføringen ta hensyn til noen tekniske punkter å forbedre ytelsen til teknikken og sikre nøyaktigheten. Kroppstemperatur bør holdes innenfor fysiologiske området under operasjonen, mens blodtrykk og blod gasser må overvåkes³³^,³⁴^,³⁵. Konstant opptak av rCBF med en laser Doppler flowmeter og bruker en passende forberedt silikon-belagt filament kan ikke bare øke suksessraten MCAO, men også redusere dødelighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlig til visekansler for forskning av Ardabil University i medisinske fag (Ardabil, Iran) for økonomisk støtte (gi No: 9607).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below 25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals \|	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G