Summary
L’objectif global de cette procédure est de fournir une technique hautement reproductible pour évaluer in vivo la rupture de la barrière hémato - encéphalique dans les modèles de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique.
Abstract
Accident vasculaire cérébral ischémique entraîne un œdème cérébral vasogénique et crânien primaire subséquent, qui est véhiculé par la destruction de la barrière sang - encéphalique (BHE). Rats atteints d’accident vasculaire cérébral ischémique induit ont été mis en place et utilisés comme in vivo modèles pour enquêter sur l’intégrité fonctionnelle de la BHE. Détection par spectrophotométrie de bleu Evans (EB) dans les échantillons de cerveau avec une lésion ischémique pourrait fournir une justification fiable pour la recherche et le développement de nouvelles modalités thérapeutiques. Cette méthode génère des résultats reproductibles et s’applique à n’importe quel laboratoire sans un besoin d’équipement spécial. Nous présentons ici une orientation technique et visualisée sur la détection de l’extravasation de EB après induction d’AVC ischémique chez le rat.
Introduction
Œdème cérébral vasogénique en raison de la rupture de la barrière hémato - encéphalique (BHE) reste une complication importante de l’accident vasculaire cérébral ischémique et un déterminant majeur de la survie dans les accidents vasculaires cérébraux patients1,2. La sang barrière - encéphalique (BHE), qui est formée par les cellules endothéliales capillaires du cerveau (BCECs) et composée d’éléments distincts neurovasculaire (p. ex., des jonctions serrées entre BCECs, péricytes, astroglials et les cellules neuronales3), fournit un spécialisés et dynamique de l’interface entre le système nerveux central (SNC) et la circulation sanguine périphérique4,5. Insultes tels que les lésions d’ischémie-reperfusion pourraient perturber l’intégrité fonctionnelle de la BHE et conduire à la pénétration ultérieure des leucocytes circulants dans le parenchyme du cerveau qui finalement déclencher l’inflammation cérébrale et lésions cérébrales primaires 6 , 7. modèles animaux sont nécessaires pour la détection exacte du dysfonctionnement du BBB suite à la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Ces modèles sont d’une grande importance pour l’étude qui sous-tendent les mécanismes physiopathologiques et en introduisant de nouvelles stratégies neuroprotectrices. In vitro sur culture modèles cellulaires de la BHE hautement développées et utilisées pour l’étude moléculaire de la BBB physiopathologie8,9,10. Cependant, in vivo des modèles animaux, qui produisent des dommages ischémiques de la BHE similaire à des conditions cliniques humaines, sont également très utiles à cet égard. Détection quantitative de l’extravasation de bleu Evans (EB) est une technique bien acceptée et sensible qui a été utilisée pour évaluer l’intégrité BBB et fonction dans les maladies neurodégénératives, y compris les accidents vasculaires cérébraux ischémiques11, 12 , 13 , 14. cette méthode est rentable, réalisable, reproductible et totalement applicable dans n’importe quel laboratoire expérimental. Sa mise en œuvre ne nécessite pas d’équipements de pointe, tels que des traceurs radioactifs15 ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM)16, qui sont indispensables pour d’autres méthodes. Dans cet article, nous démontrons exhaustive base procédés techniques d’évaluation de BBB à l’aide d’extravasation de EB dans les modèles de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives d’Ardabil University of Medical Sciences Research Council pour mener des études sur l’animal (numéro d’identification éthiques : IR ARUMS. Rec.1394.08). dans la présente étude visualisée, nous avons utilisé Sprague-Dawley rats adultes (300-350 g) de pâturage Institut (Téhéran, Iran).
1. anesthésie et débitmétrie
- Induire l’anesthésie à l’isoflurane 4 % et l’entretenir à l’isoflurane (1 à 1,5 %) dans un mélange de protoxyde d’azote (70 % v/v) et oxygène (30 % v/v) pour la durée de l’intervention.
- Placer un animal anesthésié dans la posture sujette sur une couverture de retour chauffage et maintenir la température du corps à 37±0.5 ° C au moyen d’une sonde rectale connectée à cet appareil de chauffage.
- Appliquer une petite quantité de pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement.
- Raser la région chirurgicale sur le côté gauche du crâne avec une tondeuse électrique. Utilisez betadine solution avec un tampon de gaze pour désinfecter la peau. Rincer un tampon stérile contenant de l’éthanol à 70 % de cette région et répétez les deux étapes pour trois cycles de17.
- Pour l’analgésie, injecter 0,2 mL de bupivacaïne 0,5 % par voie sous-cutanée dans la région de chirurgie17.
- Faire une incision de la peau long de 1 cm sur le crâne (s’étendant du canthus latéral de le œil gauche à la base de l’oreille gauche) et disséquer le muscle temporal gauche pour exposer le crâne. Ensuite, créez une Ronce petit trou 5 mm latéral à et 1 mm postérieure au bregma18 au placement de la facilité de la pointe de la sonde de crayon débitmètre Doppler.
- Tourner le rat de l’enclin à position allongée et ensuite mettre la sonde de crayon laser dans le crâne déjà percés aveugles-trou pour surveiller le débit sanguin cérébral régional (DSCR).
- Enregistrer la DSCR de base de chaque animal et considèrent cela comme 100 %. Notamment, l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (OACM) est démarrée chaque fois qu’une diminution des DSCR de plus de 80 % est détecté19,20.
2. l’induction de l’ischémie focale Cerebra
- Raser la région du cou et désinfecter la peau avec betadine solution et 70 % d’éthanol. Injecter 0,2 mL de bupivacaïne 0,5 % par voie sous-cutanée dans le site de la chirurgie pour l’analgésie17.
- Faites une incision chirurgicale longue de 2 cm à la surface ventrale du cou pour accéder à l’artère carotide commune gauche (LCCA). Isoler le LCCA de fascia voisin et le nerf vague pour accéder à la bifurcation de l’artère carotide externe (CEA) et l’artère carotide interne (ICA).
- Ligaturer en permanence le LCCA ou CEA employant une suture de soie de 5-0 et disséquer ICA gratuit jusqu’au niveau de l’artère de pterygopalatine.
- Placer librement une cravate de suture de soie de 5-0 autour LCCA, et ensuite temporairement ICA pince avec une pince micro vasculaire.
- Faire une petite incision sur le LCCA avant la cravate lâche précédemment mis, puis insérez une suture de nylon enduit silicone 4-0 dans l’espace luminale de ICA et serrer la suture autour le LCCA pour fixer le fil de nylon et éviter toute fuite de sang.
- Retirez la pince micro vasculaire de l’ICA. Puis, avance un filament intraluminal revêtus de silicium jusqu'à observer une baisse marquée dans DSCR qui indique une occlusion de l’origine de la MCA. À la fin de la période ischémique (90 min), démarrer une reperfusion en retirant l’intraluminal suture21.
3. veine jugulaire canulation et Evans Blue Injection (EB)
- Faire une incision longitudinale de 1 cm dans le cou vers le côté gauche de la ligne médiane et puis carrément disséquer loin fascia superficiel pour accéder à la branche externe de la veine jugulaire gauche (LGV). Puis, en permanence ligaturer l’extrémité crânienne de la LGV avec suture de soie de 5-0. Vaguement placer deux liens autour de la veine et la puis temporairement bloquer l’extrémité cardiaque de la LGV avec une pince de micro vasculaire.
- Faire une petite incision sur la LGV entre deux points de suture et puis insérez sérum hépariné rempli cathéter dans l’espace luminale de la LGV et avancer pour environ 10 mm. par la suite, serrer les ligatures autour de la veine pour fixer le cathéter et prévenir les saignements. Injecter de petites quantités de sérum pour éviter l’effondrement de la veine.
- Au début de la période de reperfusion, injecter lentement colorant EB (1 mL/kg de solution EB 2 % dans une solution saline) sur une période de 5 min. Par la suite, lavez la canule par une injection de 0,5 mL de solution saline normale et retirer la canule d’injection de la veine12,22.
- Enfin, les incisions du cou et la tête de suture et injecter la buprénorphine 0,05 mg/kg par voie intrapéritonéale (IP) et renouveler l’injection toutes les 6-8 h au cours de la période de reperfusion pour analgésie post-opératoire17.
- Injecter 5 mL de saline(IP) préchauffé d’hydratation dans la cage de récupération17.
- Place l’animal dans une cage de récupération spécial équipé de température et le contrôle de la climatisation et surveiller la récupération de l’animal de l’anesthésie.
4. Evaluation de la perméabilité de la barrière sang cerveau
- Après 24 h de reperfusion, profondément anesthésier l’animal avec le thiopental sodique. Ensuite, ouvrir la cavité thoracique en faisant un petit trou sous le sternum.
- Faire une petite ouverture dans l’oreillette droite et injecter 250 mL de sérum physiologique 0,9 % préchauffé (37 ° c) sous une pression de 110 mmHg dans le ventricule gauche pendant 15 min à laver EB loin de la circulation jusqu'à la sortie saline normale de l’oreillette devient incolore23.
- Immédiatement retirer le cerveau du crâne et le placer dans la matrice de cerveau. Disséquer le bulbe olfactif et le cervelet, et ensuite à l’aide d’une lame de rasoir propre, séparer l’hémisphère droit du cerveau gauche (Lesioned) le long de la ligne médiane.
- Peser chaque hémisphère et homogénéiser les séparément dans 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate et mélanger pendant 2 min à l’aide d’une machine de vortex avec 2,5 mL d’acide trichloracétique (60 %).
- Centrifuger les échantillons de cerveau pendant 30 min à 1 322 x g et laisser les échantillons refroidir au réfrigérateur 4 ° C pendant 10 min.
- Les surnageants permet d’estimer l’absorption EB par un spectrophotomètre à 610 nm23.
- Calculer les concentrations d’EB contre une courbe standard et express résultats µg/g de tissu cérébral.
5. production de la courbe Standard EB
- Préparer 10 exemples de solutions de EB avec des concentrations de 1 à 10 µg de EB dans 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate.
- Mesurer les valeurs de l’absorbance de chaque échantillon à 610 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Faire un graphique en nuages de points à l’aide d’un tableur et des concentrations de EB présentes sur l’axe des X et les valeurs d’absorbance sur l’axe des Y (Figure 1).
- Définir une courbe de tendance linéaire de la courbe avec son équation. Puis, utilisez-le pour obtenir la concentration EB des échantillons.
- Signaler les résultats définitifs de l’extravasation de EB µg/g de la masse de tissu de cerveau.
6. une opération fictive
- Effectuer le même processus chirurgicaux sur des rats opérés de groupe (y compris faisant une incision dans la région du cou et l’injection de EB), mais excluent l’OACM.
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Representative Results
Il n’y avait aucune différence significative au niveau de RB dans l’hémisphère droit par rapport à l’hémisphère gauche des rats opérés (1,06 ± 0,1 µg/g et 1,1 ± 0,09 µg/g, respectivement). Comme indiqué dans les Figures 2 a-2 b, induction d’ischémie transitoire (90 min d’ischémie / reperfusion 24h) due à une différence significative au niveau de RB (10,41 ± 0,84 µg/g, p < 0,001) dans l’hémisphère gauche ischémique chez le rat, par rapport aux différents hémisphère chez les rats opérés. Collectivement, ces résultats indiquent que, dans des conditions normales, EB ne peut facilement traverser la BHE dans le parenchyme cérébral et insultes ischémiques cérébrales induisent l’extravasation du EB à travers une la perméabilité de la BHE (Figures 2 a et 2 b).
Figure 1 : La courbe d’étalonnage est utilisée pour déterminer la concentration de EB par les valeurs d’absorbance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation de la rupture de BBB par extravasation de EB 24 heures après l’accident vasculaire cérébral ischémique. La photographie du cerveau chez les animaux opérés et ischémiques (A). L’intensité de l’extravasation de EB dans le tissu cérébral (couleur bleue) provient de l’étendue de la rupture de BBB dans l’hémisphère lésé. Concentration de EB dans les échantillons préparés à partir de la gauche (lésée) et droite hémisphères du cerveau chez les animaux opérés et ischémiques (B) (n = 6, *p< 0,001 par rapport à l’hémisphère gauche dans groupe fictif, p< 0,001 par rapport à hémisphère ipsilatéral du même groupe). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Jusqu’ici, diverses méthodes telles que l’autoradiographie et la détection des traceurs radioactifs24,25, immunofluorescence microscopie26,27et EB extravasation technique20, 23 ont été utilisés pour évaluer les dégâts de la barrière hémato - encéphalique. EB colorant fortement peut se lier à l’albumine sérique et est utilisé comme traceur pour détecter une fuite vasculaire et de quantifier les BBB ventilation11,28,29. Comme une méthode hautement reconnue et fiable, la technique de l’extravasation de EB fournit une estimation directe à l’intégrité de la BHE touché par différentes blessures cérébrales, y compris accident vasculaire cérébral ischémique.
In vivo l’évaluation de la BHE permet aux chercheurs d’étudier les possibles mécanismes pathophysiologiques de l’ischémie induite vasogénique oedème du cerveau et de trouver de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce modèle ne nécessite pas d’installations spéciales et peut produire des résultats crédibles avec un taux de réussite élevé (plus de 80 %) des expériences13,20. Avec un accès direct à du tissu cérébral, ce modèle permet une évaluation très précise de l’intégrité BBB, mais se limite aux études à long terme.
Développent des changements pathologiques de la BHE causée par accident vasculaire cérébral ischémique en trois phases : aiguë (en heures), subaigus (heures et jours) et chroniques (quelques jours ou mois)30,31. Évidemment, les premières interventions thérapeutiques produisent des effets protecteurs précieux pathologiques aigus. Posologie EB et le point dans le temps d’injection sont deux paramètres cruciaux pour l’obtention de résultats fiables en raison de la nature dynamique de la BHE après insultes ischémiques. Par conséquent, injection du colorant EB lentement via une canule veineuse à l’aide de la dose appropriée (1 mg/kg de solution EB 2 % dans une solution saline) après le début de la période de reperfusion est un facteur important et permet l’étude des changements pathophysiologiques dans les premiers stades de l’AVC .
Plusieurs méthodes expérimentales ont été introduites pour étudier l’accident vasculaire cérébral ischémique. Dans ce modèle expérimental, nous avons utilisé OACM avec la méthode de filament intraluminaux qui crée des conditions similaires à l’accident vasculaire cérébral humain21,32. Cette technique est simple et fiable ; Cependant, son exécution doit prendre en considération certains points techniques pour améliorer les performances de la technique et s’assurer de l’exactitude des informations. Température corporelle doit être maintenue dans les limites physiologiques au cours de la chirurgie, alors que la pression artérielle et des gaz du sang doivent être surveillé33,34,35. Constante d’enregistrement de la DSCR avec un débitmètre Doppler laser et en utilisant un prêt adapté à incandescence revêtement silicone peut non seulement augmenter le taux de réussite d’OACM, mais également réduire le taux de mortalité.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à la Vice-chancellier de recherche de l’Ardabil University of Medical Sciences (Ardabil, Iran) pour le soutien financier (subvention No : 9607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal | AWN 34041100 | 20 - 25 °C |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Molekula | 31216368 | 4 years |
| Sprague–Dawley rats | Pasture Institute (Tehran, Iran) | 300-350g | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | 2 years |
| Bupivacaine HCl (0.5%) | Delpharm Tours | below 25 °C | |
| Bupernorphine | Exir (Iran) | ||
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | 497-19-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate | EMD Millipore | 231-448-7 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| silicone(Xantopren) | Heraeus | EN ISO 4823 | |
| Activator universal plus | Heraeus | 66037445 | |
| Micro-Dissecting forceps | Stoelting | 52100-41 | |
| Spring Scisors | Stoelting | 52130-00 | |
| Operating Scissors | Roboz | 52140-70 | |
| Brain matrix | Stoelting | 51390 | |
| Anesthesia Machine for Small Animals | | Kent Scientific | SS-01 | |
| Power Lab system | AD Instruments | ML880 | |
| Laser Doppler flowmeter | AD Instruments | ML191 | |
| Heating feed back system | Harvard Appratus | 72-7560 | |
| Vascular micro clamp | FineScience Tools | 18055-03 | |
| Silk 5-0 suture thread | Ethicon | 682G | |
| Ethilon 4-0 suture thread | Ethicon | EH6740G |
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