Formação de ligações covalente DNA adutos por agentes cancerígenos ativados enzimaticamente drogas In Vitro e sua determinação por 32P-postlabeling

Resumo

Avaliar a potência dos produtos químicos ambientais e drogas, a ser enzimaticamente adutos bioactivated gerando covalent DNA e intermediários, é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Métodos são descritos para ativação composta para formar que adutos de DNA, bem como técnicas para a sua detecção e quantificação.

Resumo

Adutos de DNA covalente formado por produtos químicos ou drogas com potência cancerígena são julgadas como um dos fatores mais importantes na fase de iniciação de processos cancerígenos. Essa ligação covalente, que é considerada a causa da tumorigênese, agora é avaliada como um dogma central da carcinogénese química. Aqui, são descritos métodos empregando as reações catalisadas pelo citocromo P450 e enzimas de biotransformação adicional para investigar a potência de produtos químicos ou drogas para sua ativação para metabólitos formando esses DNA adutos. Os procedimentos são apresentados descrevendo o isolamento de frações celulares possuindo enzimas de biotransformação (amostras microssomais e citosólica com citocromo P450 ou outras enzimas de biotransformação, ou seja, peroxidases, NADPH: citocromo P450 oxidorredutase, oxidorredutase de H:quinone NAD (P) ou xantina oxidase). Além disso, são descritos os métodos que podem ser usados para a ativação metabólica de substâncias químicas analisadas por estas enzimas, bem como aqueles para isolamento do DNA. Além disso, os métodos apropriados capazes de detectar e quantificar o DNA químico/drogas-derivado adutos, ou seja, diferentes modificações da técnica P-postlabeling ³²e emprego de radioativo marcado analisados produtos químicos, são mostrado no detalhe.

Introdução

O metabolismo de xenobióticos (substâncias químicas ambientais ou drogas) ocorre em duas fases¹. As fases I e II pretendem processar os compostos hidrofóbicos originalmente (não solúveis em água) mais hidrofílico (hidrossolúvel), tornando-os facilmente excretable via urina, fezes ou suor. Fase I (functionalization) reações incluem oxidação, redução, e hidroxilação catalisada por enzimas como a citocromo P450s (P450s, CYPs), peroxidases (i. e., ciclooxigenase, COX), aldo-keto redutases (AKRs) e microssomais Flavin, contendo monooxigenases (FMO). Fase I inclui também as reações de redução, mediadas por uma variedade de redutases ou s....

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os regulamentos para o cuidado e o uso de animais de laboratório (311/1997, Ministério da agricultura, República Checa), que está em conformidade com a declaração de Helsinque.

1. isolamento de fracções microssomais e citosol hepáticos

1. Prepare o fígado fracções subcelulares (microssomas ricas em enzimas P450 ou citosol rica em redutases ou solúveis peroxidases) de ratos por centrifugação diferencial simples (105.000 x g).
   Nota: A pelota e sobrenadante são tidos como microssomas e citosol, respectivamente.
   1. As amostras de fígado (1-10 g) duas l....

Resultados

Usando os protocolos descritos aqui para a utilização de ativação catalisada por enzima (ou seja, P450, peroxidase, redutase) para investigar a potência dos produtos químicos (agentes cancerígenos/drogas) para ser metabolizada e intermediários resultando em suas ligações covalentes ligação ao DNA (geração de DNA adutos), fomos capazes de resolver (i) um romance mecanismo da ação farmacológica do ellipticine agente anticâncer (para uma revisão, ver,^29,.......

Discussão

Neste trabalho, está demonstrado uma metodologia amplamente acessível para estudar a potência dos produtos químicos para ser bioactivated e intermediários metabólicos, resultando na geração de DNA covalente adutos. Esta é uma questão crucial, porque a avaliação da potência de produtos químicos ambientais ou drogas de sua ativação enzimática de metabolitos gerando covalent DNA adutos é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Agora, a modificação do DNA por agentes cancerígenos, considerada a cau.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tris	Sigma-Aldrich	252859
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9541
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889
Fenol	Roth	0032.8
Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamilico	Roth	A156.1
Etanol	Penta	70390-11000
DNA do timo da panturrilha	Sigma-Aldrich	D4522
NADH	Sigma-Aldrich	N7004
NADP+	Sigma-Aldrich	N5755
NADPH	Sigma-Aldrich	N7505
D-glicose 6-fosfato	Sigma-Aldrich	7647001
D-glicose 6-fosfato desidrogenase	Sigma-Aldrich	G6378
Supersomes	Corning Gentest	456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Microssomas hepáticos humanos	Corning Gentest	452172
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Hipoxantina	Sigma-Aldrich	77662
2-Hidroxipirimidina	Sigma-Aldrich	H56800
Acetato de etila	Sigma-Aldrich	437549
Éter dietílico	Sigma-Aldrich	179272
Nuclease microcócica de Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	N3755
Baço fosfodiesterase do baço de bezerro,	Calbiochem	524711
Nuclease P1 de Penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630
Bicine	Sigma-Aldrich	163791
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Espermidina	Sigma-Aldrich	S2626
Cloreto de tetrabutilamônio	Sigma-Aldrich	86870
n-Butanol	Sigma-Aldrich	437603
T4-polinucleotídeo quinase	USB Corp	70031Y
[γ-32P]ATP	Hartman Analytic GmbH	FP-201
Placas TLC de celulose impregnada com PEI	Macherey-Nagel	801053
Packard Instant Imager A202400	Packard	G120337
Ellipticine	Sigma-Aldrich	285730
3-Nitrobenzantrona	preparada (sintetizada) como mostrado na ref. 40

Tipo II