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Biochemistry

Bildung von kovalenten DNA Addukte durch enzymatisch aktivierten Karzinogene und Drogen In Vitro und ihre Entschlossenheit von 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Bewertung der Wirksamkeit des Umweltchemikalien und Drogen, enzymatisch, zu sein Bioactivated, Zwischenprodukte, die Generierung von kovalenten DNA Addukte, ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Für zusammengesetzte Aktivierung zu bilden werden Methoden beschrieben, die DNA-, die sowie Techniken für die Erkennung und Quantifizierung Addukten.

Abstract

Kovalenten DNA Addukte gebildet durch Chemikalien oder Drogen mit krebserzeugenden Potenz sind als einer der wichtigsten Faktoren in der Initiierungsphase krebserzeugende Prozesse beurteilt. Diese kovalente Bindung, die die Ursache der Tumorgenese angesehen wird, wird nun als ein zentrales Dogma der chemischen Karzinogenese ausgewertet. Hier werden Methoden beschrieben, mit den Reaktionen, die durch Cytochrom P450 katalysiert und zusätzliche Biotransformation Enzyme zu untersuchen, die Potenz von Chemikalien oder Medikamente für ihre Aktivierung Metaboliten bilden diese DNA Addukte. Verfahren werden vorgestellt, beschreibt die Isolation der zellulären Fraktionen besitzen Biotransformation Enzyme (mikrosomale und cytosolischen Proben mit Zellfarbstoffe P450 oder anderen Biotransformation Enzymen, d. h., Peroxidasen, NADPH: Cytochrom P450 Oxidoreductase, NAD (P) H:quinone Oxidoreductase oder Xanthin-Oxidase). Darüber hinaus werden Methoden beschrieben, kann für die Stoffwechselaktivierung analysierten Chemikalien durch diese Enzyme sowie zur Isolierung von DNA verwendet werden. Darüber hinaus die entsprechenden Methoden zur Erkennung und Quantifizierung von Chemie-/Drogen-abgeleitete DNA Addukte d.h.verschiedene Modifikationen der 32P-postlabeling-Technik und Einsatz von radioaktiv-markierten analysiert, Chemikalien, sind detailliert dargestellt.

Introduction

Der Stoffwechsel von Xenobiotika (Umweltchemikalien oder Drogen) erfolgt in zwei Phasen1. Phasen I und II sollen die ursprünglich hydrophoben (nicht wasserlöslichen) Verbindungen mehr hydrophile Rendern (wasserlöslich), wodurch sie leicht excretable über Urin, Kot oder Schweiß. Phase-I-Reaktionen (Funktionalisierung) gehören Oxidation, Reduktion, und Hydroxylierung katalysiert durch Enzyme wie Cytochrom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (i.e., Cyclooxygenase COX), Aldo-Keto Reduktasen (AKRs) und mikrosomale Flavin-haltigen Monooxygenases (RGV). Phase I beinhaltet auch Reduktionsreaktionen, vermittelt durch eine Vielzahl von Reduktasen z.B. mikrosomale NADPH: Cytochrom P450-Reduktase (POR) und cytosolischen NAD (P) H:quinone Oxidoreductase (NQO1), Xanthin-Oxidase (XO) und Aldehyd Oxidase (AO)1 . In der zweiten Phase (Konjugation), der funktionellen Gruppen, die in Phase angefügt wurden früher habe ich sind kleine polare Moleküle weiter zu steigern, die Polarität zu konjugieren. Beispiele für Enzyme, die als zur Teilnahme an der Reaktion der Phase II gehören Sulfotransferasen (Ergebnisse), N, O– Acetyltransferases (NATs), Methyltransferasen wie Brenzcatechins –O– Methyltransferase (COMT), Glutathion- S– Transferasen (GSTs) und Uridin-diphosphat Glucuronosyltransferases (UGTs)1. Die Klassifizierung von Enzymen in Phase I oder II ist, jedoch, nicht starr, und einige Enzyme können wohl in beiden Kategorien gruppiert werden.

P450 Enzyme (EG 1.14.14.1) sind die Häm, enthält Proteine, die in verschiedenen Organismen, die Teilnahme an der Biotransformation von vielen Chemikalien katalysieren ihre Umwandlung3,4. Die P450 Enzyme katalysieren Hydroxylierung viele Substrate mit einer Reaktion, wo ein Atom des Dioxygen in das Molekül von Xenobiotika, vorgestellt wird, während der zweite Atom Sauerstoff zu Wasser durch die Reaktion reduziert wird, die zwei Elektronen [der Gleichung (1 erfordert [)]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH +H2O+ NADP+ (1)

P450-Enzymen lokalisiert in der Membran des endoplasmatischen Retikulum von Säugerzellen (mikrosomale P450 Systeme) sind Mitglieder des Systems der multienzyme Monooxygenase, enthält weitere NADPH: Cytochrom P450-Reduktase (POR) und Cytochrom b5 , das Substrat des Enzyms als NADH: Cytochrom b5 Reduktase bezeichnet. Eine allgemein akzeptierte Theorie stellt die Hypothese auf, dass die Spender der zwei Elektronen benötigt für P450 das NADPH/POR System. Dennoch könnte Cytochrom b5 auch fungieren als Spender von Elektronen für P450, nämlich als Spender des Elektrons reduziert P450 bei zweiten Reduktion von seiner Reaktionszyklus wo wirkt es zusammen mit NADH: Cytochrom b5 Reduktase2,3,4.

Säugetiere nutzen verschiedene P450 Enzyme (z. B. die Enzyme der Familien 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 und 27) für die Synthese von wertvollen endogenen Verbindungen, wie Steroide, und verwenden Sie sie für Katabolismus von Naturprodukten2,3 . Die anderen CYP Säugetier-Enzymen, wie menschliche CYP1A2, 2 9, 2 19, 2-6 und 3A4, verstoffwechseln exogene Chemikalien, die als Arzneimittel verwendet werden. 5 , 6 die wichtigsten Enzyme katalysieren Metabolismus von Medikamenten sind CYPs der Unterfamilie 3A, vor allem CYP3A4. Die Konvertierungen von Xenobiotika wie Pro-Karzinogene und Pro-Giftstoffe werden durch menschliches CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 und 3A42,5vermittelt. Die meisten dieser CYPs sind vorhanden in der Leber (mit Ausnahme von CYP1A1 und 1B1). Dennoch sind die CYPs auch in mehrere extrahepatische Organe zum Ausdruck. Diese P450s möglicherweise von großer Bedeutung, vor allem wenn sie beteiligen, reaktive Zwischenprodukte in diesen Organen7Bioaktivierung Stoffwechsel von Chemikalien (Drogen). Verschiedenen P450s werden durch mehrere Verbindungen, die deren Substrate sind, induziert, obwohl dies nicht unbedingt der Fall ist.

Viele P450 Enzyme spielen eine Rolle in chemischen (Medikament) Toxizität. Die Xenobiotika nicht nur in ihrer Entgiftung Stoffwechselprodukte umwandeln können, sondern auch zu reaktiven Spezies, die endogene Makromoleküle zu, die zusätzlich unterschiedliche biologische Eigenschaften ändern zeigen, verursacht in der Regel ihre Toxizität zu aktivieren. DNA, Lipide und Proteine könnten die Ziele für ihre Änderung durch reaktive Electrophiles und radikale aus aktivierten Chemikalien erzeugt werden. Im Falle von DNA mehrere wichtige gen Reaktionen und ihre Mechanismen zu lösen sind bereits bekannt,2,3,4,5.

Die Veränderungen in der DNA führt zu einer Abnahme der Zelle Wachstumskontrolle, und dieses Phänomen wird als der vorherrschende Faktor der Entwicklung von Karzinogenen Prozessen. Die Generation der kovalenten DNA Addukte mit Chemikalien mit krebserzeugenden Potenz wird beurteilt, wie einer der wichtigsten Schritte in der Anfangsphase des krebserregenden8,9,10,11verarbeitet. Es konnte gezeigt werden, dass die Beziehungen zwischen der Bildung von DNA-Addukten und Tumorgenese auftreten, während eine Abnahme der Menge an DNA Addukte verantwortet Chemoprävention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. die Bildung von Karzinogen/Drogen-abgeleitete DNA Addukte hängt von einzelnen Basen der DNA und wird beeinflusst durch die diese Basen in der DNA-Sequenzen. Die Reparatur von DNA-Addukten sind abhängig von ihrer Lage (auf der transkribierten oder nicht transkribiert DNA-Strang) und Arten von modifizierten Nukleotid-Sequenzen8,11,12,15, 16.

In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren unter Verwendung der Enzym-katalysierte Umwandlung von Chemikalien (Drogen) zu untersuchen, ihre Potenz in Metaboliten aktiviert werden die DNA verändert (Erzeugung von DNA-Addukten). Für die kovalente Bindung der DNA, die Testverbindung sollte in der Regel entweder durch oxidativ oder reduktiv Reaktionen, je nach individuellen Drogen aktiviert. Oxidativ oder reduktiv Aktivierung des getesteten Chemikalien wird durch eine enzymatische System vorhanden in der subzellulären mikrosomale Fraktion P450-abhängigen vermittelt oder durch Reduktion mit Reduktasen präsentieren sowohl in Microsomen (POR, NADH: Cytochrom b5 Reduktase, P450 Enzyme) und zelluläre cytosolischen subzellularen Brüche (NQO1, XO, AO, Peroxidase). Reaktive Metaboliten danach an DNA binden bilden DNA Addukte. Da oxidative und reduktive Reaktionen wichtig, mehrere Medikamente um diese reaktive Spezies zu aktivieren sind, werden die experimentellen Verfahren beschäftigt die enzymatische Oxidation/Reduktion-System beschrieben. Darüber hinaus die entsprechenden Methoden zur Erkennung und Quantifizierung dieser DNA Addukte werden detailliert beschrieben.

Zwei unabhängige Verfahren um festzustellen, ob die Testchemikalie durch enzymatische Systeme aktiviert ist an DNA gebunden werden empfohlen: 32P-postlabeling Technik und Verwendung radioaktiv markierten Substanz (z. B.., 3H oder 14 C). Zum ersten ist Pilot, screening- 32-P-postlabeling-Test empfohlen. Die Bestimmung der DNA-Gehalt in Lösungen, genau ausgewertet, muss beide Methoden vorausgehen.

Die 32P-postlabeling-Technik nutzt die enzymatische Hydrolyse von DNA durch nicht-radioaktiven Chemikalien (karzinogen/Medikament), 3´-Phosphodeoxynucleosides, weitere Phosphorylierung mit radioaktivem Phosphor (32P) an der 5´ – modifiziert OH Addukte Position und die Trennung von chemischen Deoxynucleotide von normalen (unveränderten) Deoxynucleotides durch Chromatographie17 (Abbildung 1). DNA, die durch die chemische Verbindung geändert wird durch eine Mischung von Endonuklease, micrococcal Nuklease und Exonuclease, bekannt als Milz Phosphodiesterase hydrolysiert. Die Mischung aus hydrolysierten DNA enthält beide Normal (unverändert) und Deoxyribonucleoside, die 3´-Monophosphates mit [γ –32P] ATP in Gegenwart von Träger (nicht radioaktiv) ATP und T4-Polynukleotid-Kinase bei pH 9,5 für Form 5´- reagiert wird geändert 32P-Label 3´, 5´-Bisphosphates (“standard” Verfahren in Abbildung 1). Die verwendeten alkalische pH-Wert ist in der Lage die Enzymaktivität der T4-Polynukleotid-Kinase, Deoxyribonucleoside 3´-Monophosphates in Position 3´ dephosphorylate zu minimieren. Trennung und Auflösung von 32P-Label von Addukten beschrifteten Deoxynucleotides, die nicht durch Chemikalien verändert werden erfolgt durch multidirektionale Anion-Austausch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Polyethyleneimine (PEI) Cellulose (Abbildung 2 ). In der ersten und zweiten Elution Schritte (D1 und D2) sind beschriftete normal (unveränderten) Deoxynucleotides sowie [32P] Phosphat von Anfang an die TLC-PEI-Zellulose-Platte mit Wasserlösungen von Elektrolyten auf ein kurzes Stück eluiert. chromatographische Papier auf der Oberseite der TLC Platte angewendet, während die Deoxynucleotides mit gebundenen chemischen ausstellenden hydrophobe Eigenschaften (karzinogen/Drogen-Addukte) zu Beginn des PEI-Zellulose-Platte zusätzlich gelöst werden gepflegt werden mit mehreren verschiedenen Lösungsmittel Systemen in D3 und D4 Richtungen (Abbildung 2). Lokalisierung von Addukten erfolgt mittels Autoradiographie Bildschirm erweitert; die getrennten Addukte als erkennbare Pigmentflecken auf Röntgenfilme erkannt werden. Die Flecken sind von der Platte herausgeschnitten und verwendet, um Radioaktivität quantifizieren von liquid funkeln oder Cerenkov zählen. Eine Lagerung Phosphor bildgebendes Verfahren, das wurde angepasst zu ordnen und zu quantifizieren DNA Addukte auf Chromatogramme erkannt durch die 32P postlabeling Assay wird nun auch genutzt. 18 the Instant Imager Maschine wird häufig genutzt, für solche Erkennung und Quantifizierung von DNA-Addukten. Diese Methode bietet mehr als 10 – Mal höheren Empfindlichkeit zur Erkennung von 32P, als die Technik der Bildschirm Autoradiographie19erweitert.

Mengen von DNA-Addukten werden als Werte der relativen Kennzeichnung (RAL) Addukt, berechnet unter Verwendung der Gleichung (2) wie folgt ermittelt:

CPM. im Addukt deoxynucleotides
RAL =—(2)
spezifische Aktivität von 32P-ATP (in cpm. / Pmol) X pmol Deoxynucleotides

Die Werte der RAL sind das Verhältnis der Zählraten von adduziert Deoxynucleotides über Zählraten von insgesamt [adduziert und normal (unveränderten) Deoxynucleotides] Deoxynucleotides20,21. Allerdings ist diese Berechnung basiert auf gleich Kennzeichnung Wirkungsgrade von Addukten und normalen Deoxynucleotides22. Das klassische (“standard”) Verfahren der 32P-postlabeling-Technik eignet sich für verschiedene DNA-Addukten (sperrige und/oder nicht sperrige Addukte), seine Empfindlichkeit ist jedoch nicht zufriedenstellend zu erkennen Addukte gefundene in geringe Mengen in der DNA. Bei diesem Verfahren ist die Menge an ein Addukt in 107 unverändert Deoxynucleotides in DNA (0,3 Fmol Addukt/µg DNA) nachweisbar.

Eine Vielzahl von Modifikationen von dieser klassischen 32P postlabeling Verfahren wurden genutzt, um erhöhen die Empfindlichkeit der Technik. Bis zu 10 bis 100 Mal höhere Empfindlichkeit der Bestimmung der Addukte von 32P-Kennzeichnung wurde erreicht mit begrenzenden Ebenen von [γ –32P] ATP (Intensivierung-Verfahren). 23 , 24 ein weiteres Verfahren, vorausgesetzt, dass eine Erhöhung der Empfindlichkeit der 32P-postlabeling-Methode nutzt eine Inkubation von verdaute DNA-haltigen Addukte mit Nuklease P1 (aus Penicillium Citrinum)21 (Abbildung 1). Dieses Enzym lieber unveränderten Deoxyribonucleoside 3´-Monophosphates, dephosphorylate, während die Deoxynucleotides mit gebundenen Chemikalien (adduziert Nukleotide) im Wesentlichen nicht die Substrate dieses Enzyms sind. Daher Rezeptorsignals Deoxyribonucleoside 3´-Monophosphates (d.h., Deoxyribonucleosides) sind nicht phosphoryliert durch T4-Polynukleotid-Kinase durch [32P] Phosphat von γ –32P] ATP. Jedoch einige der Nukleotide wo Chemikalien sind gebunden (adduziert Deoxynucleotides), wie z. B. Arylamine Addukte an C8 Deoxyguanosine, kann Bedephosphorylated durch dieses Enzym ersetzt. Im Gegensatz dazu, die meisten anderen Addukte (z. B.Addukten ersetzt N2 der Deoxyguanosine) sind nicht durch Nuklease P1 Rezeptorsignals. Diese Änderung von 32P-postlabeling macht diese Methode wesentlich empfindlicher, die Empfindlichkeit zu erhöhen, um mehr als drei Größenordnungen. Darüber hinaus diese Version von 32P-postlabeling bietet eine Methode, wo höhere Mengen von DNA (5-10 µg) und ein Übermaß an trägerfreien [γ – 32P] ATP genutzt werden.

Eine andere Methode zur Bereicherung der Addukte, von Gupta25beschrieben, nutzt die physikalisch-chemischen Eigenschaften von sperrigen Deoxynucleotide Addukte, die in nextrahiert werden können-Butanol in Anwesenheit einer Phase Transfer Agent Tetrabutylammonium Chlorid (TBA) (Abbildung 1) vor [32P] Phosphat Kennzeichnung, während unveränderte Deoxynucleotides schlecht durch diese organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Allerdings weniger hydrophob Addukte, bestehend aus Beispiel Deoxynucleotides mit nicht-aromatischen sperrige Moieties oder kleine Alkyl Rückstände, geändert werden nicht effektiv extrahiert mit n-Butanol. Daher sind sie im Wesentlichen nicht nachweisbar, wenn durch diese Änderung der 32P-postlabeling Methode analysiert werden.

Den zuvor genannten Versionen von 32P postlabeling Steigerung der Empfindlichkeit und Quantifizierung von DNA-Addukten enorm (bis zu drei Größenordnungen), pro 109,10 normale Addukt man erkennen Nukleotide (0,3 – 3 Amol/µg DNA). Diese beiden Methoden sind zu empfehlen für die Prüfung der Chemikalien für ihre Effizienz, kovalent an DNA zu binden, und daher werden sie in diesem Werk ausführlich beschrieben.

Protocol

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren (311/1997, Ministerium für Landwirtschaft, Tschechien), die in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki ist. 1. Isolierung der hepatischen mikrosomale und cytosolischen Brüche Bereiten Sie Leber subzellularen Brüchen (Microsomen reich an P450 Enzyme oder Cytosols reich an Reduktasen oder lösliche Peroxidasen) von Ratten durch einfache differentie…

Representative Results

Verwenden die Protokolle für den Einsatz von Enzym-katalysierten Aktivierung (d. h. P450, Peroxidase und Reduktase) beschriebenen um zu Potenz von Chemikalien (Karzinogene/Drogen) zu untersuchen, um zu Zwischenprodukten, die wiederum ihre kovalente verstoffwechselt werden Bindung an DNA (Erzeugung von DNA-Addukten), konnten wir zu beheben (i) einen neuartigen Wirkmechanismus die pharmakologische Wirkung des Anti-Krebs-Agent-Ellipticine (für einen Beitrag sehen,<sup class="xref"…

Discussion

In diesem Papier wird demonstriert, dass eine allgemein zugängliche Methodik die Potenz von Chemikalien, Bioactivated, metabolische Zwischenprodukte, was Generation von kovalenten DNA sein Studium Addukte. Dies ist eine entscheidende Frage, denn Bewertung der Potenz von Umweltchemikalien oder Drogen deren enzymatische Aktivierung Metaboliten, die Generierung von kovalenten DNA Addukte ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Die Veränderung der DNA durch Karzinogene, die als der Urs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch tschechischen Wissenschaftsstiftung (GACR, Grant 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
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