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Biochemistry

Formación de covalente ADN aductos carcinógenos activados enzimáticamente y fármacos In Vitro y su determinación por 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales y las drogas, ser enzimáticamente bioactivación intermedios generando covalente DNA aducciones, es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. Se describen los métodos para la activación de compuestos para formar que aductos de ADN, así como técnicas para su detección y cuantificación.

Abstract

Aductores de ADN covalente formado por sustancias químicas o fármacos con potencia carcinógena se juzgan como uno de los factores más importantes en la fase de iniciación de los procesos cancerígenos. Esta unión covalente, que se considera la causa de la tumorigénesis, ahora se evalúa como un dogma central de la carcinogénesis química. Aquí se describen los métodos que emplean las reacciones catalizadas por el citocromo P450 y las enzimas de biotransformación adicionales para investigar la potencia de productos químicos o drogas para su activación a metabolitos formando estos ADN aductos. Se presentan los procedimientos que describe el aislamiento de fracciones celulares que poseen enzimas de biotransformación (microsomales y citosólicas muestras con citocromos P450 u otras enzimas de biotransformación, es decir, peroxidasas, NADPH: citocromo P450 oxidorreductasa H:quinone oxidorreductasa de NAD (P) y xantina oxidasa). Además, se describen métodos que puede utilizar para la activación metabólica de las sustancias químicas analizadas por estas enzimas, así como aquellos para el aislamiento de ADN. Además, los correspondientes métodos capaces de detectar y cuantificar ADN químicos/drogas-derivados de aductores, es decir, diferentes modificaciones de la técnica de P-postlabeling de 32y empleo de marcado radiactivo analizado productos químicos, son muestra en detalle.

Introduction

El metabolismo de xenobióticos (ambientales productos químicos o drogas) se produce en dos fases1. Fases I y II pretenden representar los compuestos originalmente hidrófobos (no soluble en agua) más hidrofílico (soluble en agua), por lo tanto haciéndolos fácilmente excretable por la orina, heces o sudor. Fase I (funcionalización) reacciones incluyen la oxidación, reducción, y la hidroxilación catalizada por enzimas como la citocromo P450s (P450s, APP), peroxidasas (es decir., ciclooxigenasa, COX), aldo-ceto reductasas (AKRs) y microsomal monooxigenasas que contienen flavina (consistente). Fase I también incluye reacciones de reducción, mediadas por una variedad de reductasas , microsomal NADPH: citocromo P450 reductasa (POR) y citosólica oxidorreductasa H:quinone de NAD (P) (NQO1), xantina oxidasa (XO) y aldehído oxidasa (AO)1 . En la segunda fase (verbal), los grupos funcionales que se adjunta en fase se solía conjugar las moléculas polares pequeñas para aumentar más la polaridad. Ejemplos de enzimas consideradas para participar en la reacción de fase II incluyen Sulfotransferasas (resultados), N, O– acetiltransferasas (NATs), metiltransferasas como catecol –O– metiltransferasa (COMT), glutatión S– Transferasas (GSTs) y uridina difosfato glucuronosyltransferases (UGTs)1. La clasificación de las enzimas de fase I o II es, sin embargo, no rígidos, y algunas enzimas pueden agruparse sin duda en cualquier categoría.

Las enzimas P450 (EC 1.14.14.1) son la hemo que contiene las proteínas presentes en distintos organismos, que participan en la biotransformación de muchos productos químicos, catalizando su conversión3,4. Las enzimas P450 catalizan la hidroxilación de muchos sustratos, con una reacción donde un átomo de dioxígeno se introduce en la molécula de xenobióticos, mientras que el segundo átomo de oxígeno se reduce para formar agua por la reacción que requiere dos electrones [la ecuación (1 de3,)]4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

Las enzimas P450 localizadas en la membrana del retículo endoplásmico de células de mamífero (sistemas de P450 microsomales) son miembros del sistema monooxigenasa multienzimáticos, que contiene más NADPH: citocromo P450 reductasa (POR) y citocromo b5 , el sustrato de la enzima denominada como NADH: citocromo b5 reductasa. Una teoría generalmente aceptada presume que el donante de los dos electrones necesarios para P450 es el sistema de la NADPH/POR. Sin embargo, citocromo b5 puede también actuar como donante de electrones de P450, es decir, como un donante del electrón reducción P450 durante la segunda reducción de su ciclo de reacción, donde actúa junto con NADH: citocromo b5 reductasa2,3,4.

Mamíferos utilizan varias enzimas P450 (por ejemplo, las enzimas de las familias 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 y 27) para la síntesis de valiosos compuestos endógenos, tales como esteroides y usarlos para el catabolismo de los productos naturales2,3 . Las otras enzimas de la mamíferas CYP, como humano CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 y 3A4, metabolizan sustancias químicas exógenas que se utilizan como drogas. 5 , 6 las más importantes enzimas catalizan el metabolismo de fármacos son App de la subfamilia 3A, especialmente CYP3A4. Las conversiones de los xenobióticos, como pro-carcinógenos y pro-sustancias tóxicas, son mediadas por humanos CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 y 3A42,5. La mayoría de estas App está presente en el hígado (excepto CYP1A1 y 1B1). Sin embargo, la APP se expresa también en varios órganos extrahepáticos. Tal P450s podría ser de gran importancia, principalmente cuando ellos participar en el metabolismo de la bioactivación de sustancias químicas (fármacos) intermedios reactivos en estos órganos7. Varios P450s son inducidas por varios compuestos que son sus sustratos, aunque esto no es necesariamente el caso.

Muchas enzimas P450 desempeñan un papel en la toxicidad de productos químicos (drogas). Pueden convertir los xenobióticos no sólo en sus metabolitos de desintoxicación, pero también activarlas a especies reactivas, que modificar macromoléculas endógenas que además exhiben diferentes propiedades biológicas, generalmente causando su toxicidad. ADN, lípidos y proteínas pueden ser los objetivos para su modificación por reactivos electrophiles y radicales generados a partir de productos químicos activados. En el caso de ADN, resolver varios genes importantes respuestas y sus mecanismos ya conocen a2,3,4,5.

Los cambios en el ADN pueden resultar en una disminución en el control del crecimiento celular, y este fenómeno es considerado como el factor predominante que lleva al desarrollo de procesos cancerígenos. La generación de covalente DNA aducciones con productos químicos que potencia carcinógena es juzgado como uno de los pasos más importantes en la fase de iniciación de cancerígenos procesos8,9,10,11. Se demostró que las relaciones entre la formación de ADN aductos y tumorogénesis ocurre, mientras que una disminución en la cantidad de ADN aductos es responsable de quimioprevención8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. la formación de carcinógeno/drogas-derivados de aductos de DNA depende de las bases individuales del ADN y es afectado por las secuencias de estas bases en el ADN. Aductores de las reparaciones de ADN depende de su ubicación (en el filamento de la DNA transcrito o no transcrito) y tipos de nucleótido modificado secuencias8,11,12,15, 16.

En este artículo, describen los procedimientos utilizando la conversión catalizada por la enzima de sustancias químicas (fármacos) para investigar su potencia para ser activado en metabolitos que modificado ADN (generar ADN aductos). Unión covalente del ADN, la sustancia de ensayo debe ser generalmente activado por reacciones oxidantes o reductoras, dependiendo de los fármacos individuales. Activación oxidativa o reductiva de químicos probados es mediado por un sistema enzimático dependiente de P450 presente en la fracción microsomal subcelular o por reducción con reductasas presentes tanto en microsomas (POR, NADH: citocromo b5 reductasa, enzimas P450) y en fracciones celulares citosólicas subcelulares (NQO1 XO, AO, peroxidasa). Metabolitos reactivos después de eso se unen al ADN formando ADN aductos. Porque las reacciones oxidativas y reductivas son importantes para activar varias drogas para estas especies reactivas, se describen los procedimientos experimentales empleando el sistema enzimático de oxidación/reducción. Además, los correspondientes métodos capaces de detectar y cuantificar estos ADN aductos se describen en detalle.

Dos procedimientos independientes para determinar si la sustancia activa sistemas enzimáticos, se enlaza al ADN se recomiendan: la técnica de P-postlabeling de 32y utilizando compuestos radiactivos marcados (por ej., 3H o 14 C). Para el primer piloto, investigación el ensayo P-postlabeling de 32se recomienda. La determinación del contenido de ADN en soluciones, evaluadas con precisión, debe preceder a ambos métodos.

32postlabeling P técnica utiliza la hidrólisis enzimática del ADN modificado por productos químicos no radiactivo (cancerígeno drogas) para 3´-phosphodeoxynucleosides, fosforilación adicional con fósforo radioactivo (32P) en el 5´- OH posición y la separación de Deoxinucleótidos químicos aductos de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal por cromatografía17 (figura 1). Modificados por el compuesto químico del ADN es hidrolizado por una mezcla de endonucleasa, nucleasa micrococcal y exonucleasa, conocida como la fosfodiesterasa del bazo. La mezcla de ADN hidrolizado que contiene ambos normal (sin modificar) y modificado desoxinucleósidos 3´-Unión es reaccionado con ATP [γ –32P] en presencia del portador (no radiactivo) ATP y T4 Polinucleótido cinasa de la a pH 9,5 a forma 5´- 323´ marcado con P, 5´-bifosfonatos (procedimiento “estándar” en la figura 1). El pH alcalino utilizado es capaz de reducir al mínimo la actividad enzimática de la cinasa T4 Polinucleótido al dephosphorylate desoxinucleósidos 3´-Unión en posición 3´. Separación y resolución de 32P etiquetados aductos de Deoxynucleótidos etiquetados por que no es modificado por los productos químicos se lleva a cabo por cromatografía en capa fina (TLC) intercambio multidireccional polietilamina (PEI) celulosa (figura 2 ). En los pasos de la primera y segunda elución (en dirección a D1 y D2), se eluyen Deoxynucleótidos por (no modificados) normal etiquetados como fosfato [32P] desde el inicio de la placa de TLC-PEI-celulosa utilizando soluciones de electrólitos en un pedazo corto de papel cromatográfico aplicado en la parte superior de la placa del TLC, mientras que el Deoxynucleótidos por que contienen químicos enlazados exhibiendo propiedades hidrofóbicas (carcinógeno/drogas-aductores) se mantienen en el inicio de la placa de celulosa PEI resolverse además con varios diversos sistemas solventes en D3 y D4 (figura 2). Localización de aductos se realiza mediante autorradiografía de pantalla mejorado; aductores de los separados son detectados como manchas oscuras reconocibles en las radiografías. Las áreas de puntos son suprimidas de la placa y utilizadas para cuantificar la radioactividad por centelleo líquido o conteo Cerenkov. Un fósforo de almacenamiento de información de método que se ha adaptado y cuantificar ADN aductos en cromatogramas detectados por 32ensayo P-postlabeling ahora también se utiliza. 18 máquina el Imager instantánea se utiliza con frecuencia para tal detección y cuantificación de ADN aductos. Este método proporciona más de 10 – veces mayor sensibilidad para detectar 32P que la técnica de pantalla había mejorado autorradiografía19.

Cantidades de ADN aductos son determinadas como valores de relativa aducción etiquetado (RAL), calculado utilizando la ecuación (2) como sigue:

CPM. en aducción Deoxynucleótidos por
RAL =—(2)
actividad específica de 32P-ATP (en cpm / pmol) Deoxynucleótidos por x pmol

Los valores de RALs son el cociente de tasas de conteo de Deoxynucleótidos aducidos por sobre las tasas de recuento del total [aducidos y normal (no modificados) Deoxynucleótidos por] Deoxynucleótidos por20,21. Sin embargo, este cálculo se basa en igual etiquetado eficiencias de aductos y normal Deoxynucleótidos por22. El procedimiento clásico (“estándar”) de los 32P-postlabeling técnica es apropiado para varios ADN aductos (voluminosos y no voluminosos aductos), sin embargo, su sensibilidad no es satisfactoria detectar aductos encontradas bajas cantidades en el ADN. Mediante este procedimiento, la cantidad de un aducto en 10 Deoxynucleótidos por7 sin modificaciones en el ADN (0,3 fmol aducto/μg de DNA) es detectable.

Una variedad de modificaciones de este clásico 32procedimiento P-postlabeling se han utilizado para elevar la sensibilidad de la técnica. Hasta 10 a 100 veces mayor sensibilidad de la determinación de aductos por 32P de etiquetado se ha logrado utilizando limitando los niveles de ATP [γ –32P] (el procedimiento de intensificación). 23 , 24 otro procedimiento proporcionando que un aumento en la sensibilidad del método de P-postlabeling de 32utiliza una incubación de digeridos ADN conteniendo aductos con nucleasa P1 (de Penicillium citrinum)21 (figura 1). Esta enzima prefiere al dephosphorylate desoxinucleósidos sin modificar 3´-Unión, mientras que el Deoxynucleótidos por químicos enlazados (aducidos nucleótidos) son esencialmente no los sustratos de esta enzima. Por lo tanto, desfosforilatado desoxinucleósidos 3´-Unión (es decir, Desoxirribonucleosidos) no es fosforiladas por la cinasa T4 Polinucleótido de fosfato [32P] de γ –32P] ATP. Sin embargo, algunos de los nucleótidos que son productos químicos límite (Deoxynucleótidos aducidos por), como aductos arilamina sustituido en C8 de desoxiguanosina, puede bedephosphorylated por esta enzima. En contraste, la mayoría otros aductos (p. ej., aductos sustituido en N2 de desoxiguanosina) no son defosforilaciones por nucleasa P1. Esta modificación de 32postlabeling P hace este método mucho más sensible, aumentando su sensibilidad por más de tres órdenes de magnitud. Además, esta versión de 32P-postlabeling ofrece un método donde mayores cantidades de ADN (5-10 μg) y un exceso de portador-libre [γ – 32P] ATP puede utilizarse.

Otro método para enriquecer los aductos, descrito por Gupta25, utiliza el fisicoquímicas propiedades de Deoxinucleótidos voluminosos aductores, que pueden extraerse en n-butanol en presencia de un Tetrabutilamonio de agente de transferencia de fase cloruro (TBA) (figura 1) antes de [32P] etiquetado de fosfato, mientras que sin modificar Deoxynucleótidos por mal son extraídos por este solvente orgánico. Sin embargo, aductos menos hidrofóbicos, que consiste en por ejemplo de Deoxynucleótidos por modificado con grupos voluminosos no aromáticos o alkyl pequeños residuos, no son efectivamente extraído con n-butanol. Por lo tanto, son esencialmente indetectables cuando son analizadas por esta modificación de 32método P-postlabeling.

Las anteriores versiones de 32postlabeling P aumento de la sensibilidad y la cuantificación de ADN aductos enormemente (hasta tres órdenes de magnitud), siendo capaz de detectar una aducción por9,1010 normal nucleótidos (0.3 – 3 amol/μg de DNA). Estos dos métodos se recomiendan para las pruebas de los productos químicos para su eficacia que se unen covalentemente al ADN y, por lo tanto, se describen en este trabajo en los detalles.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las normas para el cuidado y uso de animales de laboratorio (311/1997, Ministerio de agricultura, República Checa), que está en conformidad con la declaración de Helsinki. 1. aislamiento de fracciones Microsomal y citosólicas hepáticas Preparar el hígado fracciones subcelulares (microsomas ricos en enzimas P450 o cytosols ricos en reductasas o peroxidasas solubles) de ratas por simple centrifugación diferencial (105….

Representative Results

Utilizando los protocolos descritos aquí para la utilización de la activación de enzima-catalizado (es decir, P450, peroxidasa, reductasa) para investigar la potencia de los productos químicos (cancerígenos, drogas) para ser metabolizado a productos intermedios dando por resultado su covalente Unión a DNA (generación de ADN aductos), hemos sido capaces de resolver (i) un nuevo mecanismo de la acción farmacológica de la ellipticine agente contra el cáncer (para una revis…

Discussion

En este trabajo, se demuestra una metodología ampliamente accesible para el estudio de la potencia de los productos químicos que bioactivación a intermediarios metabólicos, resultando en generación de covalente DNA aducciones. Este es un tema crucial, porque la evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales o medicamentos de su activación enzimática a metabolitos generando covalente ADN aductos es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. La modificación del ADN por agen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por la Fundación para la ciencia Checa (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
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