JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Bildandet av kovalent DNA addukter av enzymatiskt aktiverade carcinogener och droger In Vitro och deras beslutsamhet av 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Utvärdera styrkan av miljömässiga kemikalier och läkemedel, vara enzymatiskt bioaktiverade till intermediärer genererar kovalent DNA addukter, är ett viktigt område i utvecklingen av cancer och dess behandling. Metoderna beskrivs för sammansatta aktivering att bilda DNA addukter, samt tekniker för deras upptäckt och kvantifiering.

Abstract

Kovalent DNA addukter bildas av kemikalier eller läkemedel med cancerframkallande potential bedöms som en av de viktigaste faktorerna i den inledande fasen av cancerframkallande processer. Denna kovalent bindning, vilket anses vara orsaken till tumourigenesis, bedöms nu som en centraldogm av kemisk carcinogenes. Här metoder beskrivs sysselsätter de reaktioner som katalyseras av cytokrom P450 och ytterligare biotransformationsenzymer att undersöka styrkan av kemikalier eller mediciner för sin aktivering metaboliter utgör dessa DNA addukter. Förfaranden presenteras som beskriver isolering av cellulära fraktioner som har biotransformationsenzymer (mikrosomala och cytosoliska prover med cytokrom P450 eller andra biotransformationsenzymer, dvsperoxidaser, NADPH: cytokrom P450 mitokondriskt, NAD (P) H:quinone mitokondriskt eller xantin oxidas). Dessutom beskrivs metoder som kan användas för metabolisk aktivering av analyserade kemikalier av dessa enzymer samt för isolering av DNA. Ytterligare, lämpliga metoder kan detektera och kvantifiera kemiska/drog-derived DNA addukter, dvsolika modifieringar av 32P-postlabeling teknik och sysselsättning av radioaktivt märkt analyseras kemikalier, är visas i detalj.

Introduction

Metabolismen av xenobiotika (miljö kemikalier eller droger) sker i två faser1. Faserna I och II syftar till att återge de ursprungligen hydrofoba (inte vattenlösliga) föreningarna mer hydrofil (vattenlösligt), vilket gör dem lätt excretable via urin, avföring eller svett. Fas I (funktionalisering) reaktioner inkluderar oxidation, reduktion, och hydroxylering katalyseras av enzymer såsom cytokrom P450s (P450s, CYP), peroxidaser (dvs., cyklooxygenas, COX), aldo-keto reductases (AKRs), och mikrosomalt flavin-innehållande monooxygenases (ram av ömsesidiga åtaganden). Fas jag även reduktion reaktioner, medieras av en mängd reductases dvs, mikrosomalt NADPH: cytokrom P450-reduktas (POR) och cytosoliska NAD (P) H:quinone mitokondriskt (NQO1), xantin oxidas (XO) och aldehyd oxidas (AO)1 . I den andra fasen (Konjugation), de funktionella grupperna som fästes i fas är jag brukade konjugat små polära molekyler för att ytterligare öka polariteten. Exempel på enzymer anses delta i reaktionen av fas II inkluderar sulfotransferaser (resultat), N, O– acetyltransferaser (NAT), metyltransferaser såsom katekol –O– metyltransferas (COMT), glutation S– transferaser (GSTs) och uridin diphosphate difosfoglukuronosyltransferaser (UGT)1. Klassificering av enzymer i fas I eller II är, dock, inte strikt, och vissa enzymer kan utan tvekan grupperas i antingen kategori.

P450-enzymer (EG 1.14.14.1) är den heme innehållande proteiner närvarande i olika organismer, som deltar i metabolismen av många kemikalier, katalysera deras konvertering3,4. P450 enzymerna katalyserar hydroxylering av många substrat, med en reaktion där en atom av dioxygen införs i molekyl av xenobiotika, medan den andra Atomen av syre reduceras till formuläret vatten genom en reaktion som kräver två elektroner [ekvationen (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450-enzymer lokaliserade i endoplasmatiska retikulet membranet i däggdjursceller (mikrosomala P450-system) är medlemmar i multienzymkomplex monooxygenas systemet, som innehåller ytterligare NADPH: cytokrom P450-reduktas (POR) och cytokrom b5 , substraten av enzymet betecknas som NADH: cytokrom b5 reduktas. En allmänt accepterad teori hypothesizes att givare av de två elektroner som behövs för P450 är NADPH/POR systemet. Dock kan cytokrom b5 också agera som givare av elektroner för P450, nämligen som givare av elektronen att minska P450 under andra minskning av dess reaktion cykel, där den fungerar tillsammans med NADH: cytokrom b5 reduktas2,3,4.

Däggdjur utnyttja olika P450-enzymer (t.ex. familjer 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 och 27-enzymer) för syntesen av värdefulla endogena föreningar, såsom steroider, och använda dem för katabolismen av naturliga produkter2,3 . De andra CYP däggdjur enzymerna, såsom mänskliga CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2 d 6 och 3A4, metabolisera exogena kemikalier som används som droger. 5 , 6 de viktigaste enzymer som katalysera metabolism av läkemedel är CYP 3A och, speciellt CYP3A4. Omvandlingarna av xenobiotika, såsom pro-cancerframkallande ämnen och pro-gifter, medieras av mänskliga CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 och 3A42,5. De flesta av dessa CYP finns i levern (förutom CYP1A1 och 1B1). Dock uttrycks CYP också i flera extrahepatiska organ. Sådana P450s kan vara av stor betydelse, huvudsakligen när deltar de i bioaktivering metabolismen av kemikalier (droger) till reaktiva intermediärer i dessa organ7. Olika P450s induceras av flera föreningar som är deras substrat, men detta inte är nödvändigtvis fallet.

Många P450 enzymer spelar en roll i kemiska (drog) toxicitet. De kan omvandla xenobiotika inte bara till deras avgiftning metaboliter, men också aktivera dem reaktiva arter, som ändrar endogena makromolekyler som dessutom uppvisar olika biologiska egenskaper, oftast orsakar deras giftighet. DNA, lipider och proteiner kan vara mål för sin modifiering av reaktiv elektrofil och radikaler som genereras från aktiverade kemikalier. När det gäller DNA, lösa flera viktiga genen svaren och deras mekanismer är redan kända2,3,4,5.

Förändringar i DNA kan resultera i en minskning av värdcellens tillväxtkontroll, och detta fenomen anses vara den dominerande faktorn som leder till utveckling av cancerframkallande processer. Generering av kovalent DNA addukter med kemikalier att ha cancerframkallande potential bedöms som en av de viktigaste stegen i den inledande fasen av cancerframkallande bearbetar8,9,10,11. Det visades att relationer mellan bildandet av DNA addukter och tumourigenesis inträffa, medan en minskning av mängden DNA addukter ansvarar för chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. bildandet av cancerframkallande/drog-derived DNA addukter beror på individuella grunder av DNA, och påverkas av sekvenserna av dessa baser i DNA. Reparationer av DNA addukter är beroende av deras läge (på de transkriberade eller icke-transkriberas DNA-strängen) och typer av modifierade nukleotid sekvenser8,11,12,15, 16.

I den här artikeln beskriver vi förfaranden utnyttja enzymkatalyserade omvandlingen av kemikalier (narkotika) för att undersöka deras styrka aktiveras till metaboliter som modifierad DNA (generera DNA addukter). För kovalent DNA-bindning, test föreningen bör vanligtvis aktiveras antingen genom oxidativ eller reduktiv reaktioner, beroende på enskilda läkemedel. Oxidativa eller reduktiv aktivering av testade kemikalier medieras av ett P450-beroende enzymatiska system finns i den mikrosomala subcellulära fraktionen eller genom reduktion med reductases presentera båda i mikrosomer (POR, NADH: cytokrom b5 reduktas, P450-enzymer) och cellulära cytosoliska subcellulär fraktioner (NQO1 XO, AO, peroxidas). Reaktiva metaboliter därefter binda till DNA bildar DNA addukter. Eftersom både oxidativ och reduktiv reaktioner är viktigt att aktivera flera läkemedel till dessa reaktiva arter, de experimentella anställa oxidation/reduktion enzymatisk systemet beskrivs närmare. Dessutom lämpliga metoder kan detektera och kvantifiera dessa DNA addukter beskrivs i detalj.

Två oberoende förfaranden för att avgöra om testkemikalien, aktiveras av enzymatiska system, är bunden till DNA rekommenderas: 32P-postlabeling teknik och utnyttja radioaktivt märkt substans (t.ex., 3H eller 14 C). För först rekommenderas pilot, screening 32P-postlabeling analysen. Bestämning av DNA innehållet i lösningar, exakt utvärderas, måste föregå båda metoderna.

32P-postlabeling teknik använder tredjeparts enzymatisk hydrolys av DNA genom icke-radioaktiva kemikalier (cancerframkallande/läkemedel) till 3´-phosphodeoxynucleosides, ytterligare fosforylering med radioaktivt fosfor (32P) vid den 5´- Åh addukter position och separation av kemisk-deoxynucleotide från normal (oförändrad) deoxinukleotider av kromatografi17 (figur 1). DNA som ändras av en kemisk förening hydrolyseras av en blandning av Amiiiiin, micrococcal nuclease och exonuclease, känd som mjälte fosfodiesteras. Blandningen av hydrolyserat DNA som innehåller både normal (oförändrad) och modifierade deoxyribonucleoside 3´-monophosphates är reagerade med [γ –32P] ATP i närvaro av transportören (icke-radioaktiva) ATP och T4-polynucleotide kinase vid pH 9,5 till formuläret 5´- 32P-märkt 3´, 5´-bisphosphates (”standard” förfarande i figur 1). Används alkaliska pH kan minimera enzymaktiviteten T4-polynucleotide-Kinas till dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på position 3´. Separation och upplösning av 32P-märkt addukter från märkt deoxinukleotider som inte ändras av kemikalier utförs av mångfacetterat anjon-exchange tunnskiktskromatografi (TK) på polyethyleneimine (PEI) cellulosa (figur 2 ). I första och andra eluering steg (i D1 och D2 riktning) elueras märkt normal (oförändrad) deoxinukleotider samt [32P] fosfat från början av TLC-PEI-cellulosa plattan med vattenlösningar av elektrolyt på en kort bit kromatografiska papper tillämpas på toppen av TLC plattan, medan de deoxinukleotider som innehåller bundna kemikalier uppvisar hydrofoba egenskaper (cancerframkallande/drog-addukter) bibehålls i början av PEI-cellulosa plattan dessutom lösas med flera olika lösningsmedel system i D3 och D4 riktningar (figur 2). Lokalisering av addukter utförs med hjälp av skärmen enhanced autoradiografi; de separerade addukter upptäcks som mörka igenkännliga fläckar på X-ray filmer. Områdena av fläckar är censurerade från plattan och används för att kvantifiera radioaktiviteten av liquid scintillation eller Cerenkov räknar. En lagring fosfor imaging metod som har anpassats för att kartlägga och kvantifiera DNA addukter på kromatogram som upptäckts av de 32P-postlabeling assay nu används också. 18 the Instant Imager maskin utnyttjas ofta för sådan detektion och kvantifiering av DNA addukter. Denna metod ger mer än 10 gånger högre känslighet för att upptäcka 32P än tekniken med skärmen enhanced autoradiografi19.

Mängder av DNA addukter bestäms som värden på relativ addukt märkning (RAL), beräknas med hjälp av ekvation (2) enligt följande:

CPM. i addukt deoxinukleotider
RAL =—(2)
specifik aktivitet i 32P-ATP (i cpm. / pmol) x pmol deoxinukleotider

Värden i RAL är förhållandet mellan räkna andelen adducerad deoxinukleotider över räkna andelen totalt [adducerad och normal (oförändrad) deoxinukleotider] deoxinukleotider20,21. Dock beräkningen är baserad på lika märkning effektivitetsvinsterna av addukter och normala deoxinukleotider22. Klassisk (”standard”) förfarandet för 32P-postlabeling teknik är lämplig för olika DNA addukter (skrymmande eller icke-skrymmande addukter), dess känslighet är dock inte tillfredsställande att upptäcka addukter finns i låga mängder i DNA. Med den här proceduren, detekteras mängden en addukt i 107 oförändrad deoxinukleotider i DNA (0.3 fmol addukt/µg DNA).

En mängd olika modifieringar av denna klassiska 32P-postlabeling förfarande har använts för att höja känsligheten av tekniken. Upp till 10 – till 100 gånger högre känslighet för bestämning av addukter av 32P-märkning har uppnåtts med hjälp av begränsande nivåer av [γ –32P] ATP (intensifiering förfarandet). 23 , 24 ett ytterligare förfarande som ger en ökad känslighet för 32P-postlabeling metoden använder tredjeparts en inkubation av smält DNA innehållande addukter med nuclease P1 (från Penicillium citrinum)21 (figur 1). Detta enzym föredrar att dephosphorylate oförändrad deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, medan deoxinukleotider med bundna kemikalier (adducerad nukleotider) är i huvudsak inte substratesna för detta enzym. Därför defosforyleras deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) är inte fosforyleras av T4-polynucleotide kinase av [32P] fosfat från γ –32P] ATP. Men några av nukleotider där kemikalier är bunden (adducerad deoxinukleotider), såsom arylamine addukter ersätts på C8 av deoxyguanosine, kan bedephosphorylated av detta enzym. Däremot de flesta andra addukter (t.ex., addukter ersätts på N2 av deoxyguanosine) är inte defosforyleras av nuclease P1. Denna ändring av 32P-postlabeling gör denna metod betydligt känsligare, ökar dess känslighet med mer än tre tiopotenser. Dessutom, denna version av 32P-postlabeling ger en metod där högre mängder DNA (5-10 µg) och ett överskott av carrier-fri [γ – 32P] ATP kan utnyttjas.

En annan metod att berika den addukter, beskrivs av Gupta25, utnyttjar de fysikalisk-kemiska egenskaperna för skrymmande deoxynucleotide addukter, som kan utvinnas i n-butanol i närvaro av en fas överföring agent tetrabutylammonium klorid (TBA) (figur 1) före [32P] fosfat märkning, medan oförändrad deoxinukleotider extraheras dåligt av detta organiska lösningsmedel. Dock mindre hydrofoba addukter, bestående för exempel på deoxinukleotider modifierade med icke-aromatiska skrymmande beståndsdelarna eller små alkyl rester, inte effektivt extraheras med n-butanol. De är därför i huvudsak omätbara när analyseras av denna ändring av den 32P-postlabeling metod.

Både tidigare nämnda versioner av 32P-postlabeling ökar känsligheten och kvantifiering av DNA addukter enormt (upp till tre tiopotenser), att kunna upptäcka en addukt per 109,10 normala nukleotider (0.3 – 3 amol/µg DNA). Dessa två metoder rekommenderas för testning av kemikalier för deras effektivitet kovalent binda till DNA och, därför, de beskrivs i detta arbete i detaljer.

Protocol

Alla djurförsök har utförts enligt föreskrifter för skötsel och användning av försöksdjur (311/1997, ministeriet för jordbruk, Tjeckien), vilket är i enlighet med Helsingforsdeklarationen. 1. isolering av hepatisk mikrosomal och cytosoliska fraktioner Förbereda levern subcellulär fraktioner (mikrosomer rik på P450-enzymer eller cytosols rik på reductases eller lösliga peroxidaser) från råttor genom enkel differentiella centrifugering (105 000 x g).Obs: …

Representative Results

Med de protokoll som beskrivs här för utilizationen av enzymkatalyserade aktivering (dvs P450, peroxidas, reduktas) för att undersöka styrkan av kemikalier (cancerframkallande ämnen/droger) för att vara metaboliseras till intermediärer vilket resulterar i deras kovalent bindning till DNA (generering av DNA addukter), vi skulle kunna lösa en ny mekanism av den farmakologiska verkan av den mot cancer agent ellipticine (för en granskning se29,</…

Discussion

I detta papper, är det visat en lättillgänglig metod att studera styrkan av kemikalier för att vara bioaktiverade till metabola intermediärer, vilket resulterar i generation av kovalent DNA addukter. Detta är en avgörande fråga, eftersom utvärderingen av styrkan av miljömässiga kemikalier eller droger av sin enzymatisk aktivering metaboliter genererar kovalent DNA addukter är ett viktigt område i utvecklingen av cancer och dess behandling. Modifiering av DNA av cancerframkallande ämnen anses vara orsaken ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av tjeckiska vetenskapsstiftelsen (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image