Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57177
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry, Charles University

Summary

Evaluatie van de potentie van milieu chemische stoffen en drugs, enzymatisch worden bioactivated op tussenproducten genereren covalente DNA adducten, is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. Methoden worden beschreven voor samengestelde activering aan formulier die DNA, evenals de technieken voor de detectie en kwantificering adducten.

Abstract

Covalente DNA adducten gevormd door chemicaliën of drugs met kankerverwekkend vermogen worden beoordeeld als een van de belangrijkste factoren in de initiatie fase van kankerverwekkende processen. Deze covalente binding, die wordt beschouwd als de oorzaak van tumorvorming, wordt nu geëvalueerd als een centrale dogma van chemische carcinogenese. Hier worden de methoden beschreven die de reacties gekatalyseerd door cytochroom P450 en extra biotransformatie enzymen te onderzoeken van de potentie van chemicaliën of drugs voor hun activatie naar metabolieten vormen deze DNA adducten. Procedures worden gepresenteerd met een beschrijving van het isolement van cellulaire breuken bezitten biotransformatie enzymen (microsomale en cytosolische monsters met cytochromes P450 of andere biotransformatie enzymen, dat wil zeggen, Peroxidasen, NADPH: cytochroom P450 oxidoreductasen, NAD (P) quinone oxidoreductasen of xanthine oxidase). Bovendien worden de methoden beschreven die kunnen worden gebruikt voor de metabole activering van geanalyseerde chemische stoffen door deze enzymen, alsmede die voor isolatie van DNA. Verder, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van de chemische stof/drug-afgeleid DNA adducten, d.w.z., verschillende wijzigingen van de 32P-postlabeling techniek en werkgelegenheid van de radioactieve gelabelde geanalyseerd van chemische stoffen, zijn in detail weergegeven.

Introduction

Het metabolisme van xenobiotica (milieu chemicaliën of drugs) vindt plaats in twee fasen1. Fasen I en II willen maken van de oorspronkelijk hydrofobe (niet oplosbare) stoffen meer hydrofiele (in water oplosbaar), waardoor ze gemakkelijk excretable zijn via urine, ontlasting of zweet. Fase I (functionalization) Reacties omvatten oxidatie, vermindering, en hydroxylering gekatalyseerd door enzymen zoals cytochroom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (dwz., cyclooxygenase, COX), aldo-keto-reductases (AKRs), en microsomale Flavin-bevattende monooxygenases (FMO). Fase I bevat ook vermindering reacties, gemedieerd door een scala aan reductases dat wil zeggen, microsomale NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytosolische NAD (P) quinone oxidoreductasen (NQO1), xanthine oxidase (XO) en aldehyde oxidase (AO)1 . In de tweede fase (conjugatie), de functionele groepen die gekoppeld waren in fase zijn ik gewend conjugaat kleine polaire moleculen verder verhogen de polariteit. Voorbeelden van enzymen beschouwd om deel te nemen in de reactie van fase II omvatten sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases zoals catechol -O- methyltransferase (COMT), glutathione S- transferasen (GSTs), en uridine difosfaat glucuronosyltransferases (UGTs)1. De indeling van de enzymen in fase I of II is, echter, niet stijf, en sommige enzymen aantoonbaar kunnen worden gegroepeerd in beide categorieën.

P450 enzymen (EG 1.14.14.1) zijn de Heem met eiwitten aanwezig in verschillende organismen, die deelnemen aan de biotransformatie van veel chemische stoffen, hun conversie3,4te katalyseren. De P450 enzymen katalyseren hydroxylatie van vele verschillende ondergronden, met een reactie waar één atoom van dioxygen is ingevoerd in de molecule van xenobiotica, terwijl het tweede atoom zuurstof is teruggebracht tot vorm water door de reactie die twee elektronen [de vergelijking (1 vereist )]3,4:

RH + O2 NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450 enzymen gelokaliseerd in het membraan van het endoplasmatisch reticulum van zoogdiercellen (microsomale P450-systemen) zijn leden van de multi monooxygenase-systeem, waarin verder NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytochroom b5 , het substraat voor het enzym genoemd als NADH: cytochroom b5 reductase. Een algemeen aanvaarde theorie veronderstelt dat de donor van de twee elektronen die nodig zijn voor de P450 het NADPH/POR-systeem is. Niettemin kan cytochroom b5 ook fungeren als een donor van elektronen voor P450, namelijk als donor van het elektron verminderen van P450 tijdens tweede verlaging van haar reactie-cyclus, waar het fungeert samen met NADH: cytochroom b5 reductase2,3,4.

Zoogdieren gebruiken verschillende P450 enzymen (bijvoorbeeld de enzymen van gezinnen 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 en 27) voor de synthese van waardevolle endogene stoffen, zoals steroïden, en ze gebruiken voor katabolisme van natuurproducten2,3 . De andere CYP zoogdieren enzymen, zoals menselijke CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 en 3A4, metaboliseren exogene chemicaliën die worden gebruikt als geneesmiddel. 5 , 6 de belangrijkste enzymen katalyseren metabolisme van drugs zijn CYPs van de onderfamilie 3A, vooral CYP3A4. De conversies van xenobiotica, zoals pro-kankerverwekkende stoffen en pro-toxische stoffen, zijn gemedieerd door menselijke CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 en 3A42,5. De meeste van deze CYPs zijn aanwezig in de lever (behalve CYP1A1 en 1B1). De CYPs zijn echter eveneens uitgedrukt in verscheidene extrahepatic organen. Dergelijke P450s zou van grote betekenis, voornamelijk wanneer nemen ze in bioactivation metabolisme van chemische stoffen (drugs) aan reactieve intermediairen in deze organen7. Verschillende P450s worden veroorzaakt door de diverse verbindingen die hun substraten, maar dit niet noodzakelijkerwijs het geval is.

Vele P450 enzymen spelen een rol in de (drug) chemische toxiciteit. Zij kunnen de xenobiotica omzetten niet alleen in hun metabolieten van detoxificatie, maar ook activeren hen reactieve soorten, waarvoor wijzigen van endogene macromoleculen die bovendien verschillende biologische eigenschappen, meestal veroorzaakt door hun toxiciteit vertonen. DNA, lipiden en eiwitten mogelijk de doelstellingen voor hun wijziging door reactieve elektrofielen en radicalen gegenereerd op basis van geactiveerde chemicaliën. In het geval van DNA, oplossen van verschillende belangrijke gene reacties en hun mechanismen zijn al bekend2,3,4,5.

De veranderingen in DNA kunnen resulteren in een afname van de cel groei controle, en dit verschijnsel wordt beschouwd als de overheersende factor die leidt tot de ontwikkeling van kankerverwekkende processen. De generatie van covalente DNA adducten met chemische stoffen die kankerverwekkend vermogen wordt beoordeeld als een van de belangrijkste stappen in de initiatie fase van kankerverwekkende8,9,10,11 processen. Het bleek dat de relaties tussen de vorming van DNA adducten en tumorvorming optreden, terwijl een daling in de hoeveelheid DNA adducten is verantwoordelijk voor chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. de vorming van kankerverwekkende stof/drug-afgeleid DNA adducten is afhankelijk van individuele basissen van DNA, en wordt beïnvloed door de volgorde van deze basen in DNA. De reparatie van DNA adducten zijn afhankelijk van hun locatie (op de getranscribeerde of niet-getranscribeerd bundel van DNA) en soorten gemodificeerde nucleotide sequences8,11,12,15, 16.

In dit artikel beschrijven we procedures met behulp van het enzym-gekatalyseerde conversie van chemische stoffen (drugs) te onderzoeken hun potentie te worden geactiveerd in metabolieten die gemodificeerd DNA (genereren van DNA adducten). Covalente binding van DNA, de teststof moet meestal worden geactiveerd door oxidatieve of reductieve reacties, afhankelijk van individuele geneesmiddelen. Oxidatieve of reductieve activering van geteste chemische stoffen wordt gemedieerd door een P450-afhankelijke enzymatische systeem aanwezig in de microsomale subcellular fractie of door reductie met reductases presenteren zowel in microsomes (POR, NADH: cytochroom b5 reductase, P450 enzymen) en cellulaire cytosolische subcellular breuken (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reactieve metabolieten daarna binden aan DNA vorming DNA adducten. Omdat zowel oxiderende en reducerende reacties belangrijk zijn voor het activeren van deze reactieve soorten verschillende drugs, worden de experimentele procedures met de enzymatische oxidatie/verwijderingssysteem beschreven. Bovendien, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van deze DNA adducten in detail worden beschreven.

Twee onafhankelijke procedures om te bepalen of de teststof, geactiveerd door enzymatische systems, is gebonden aan DNA worden aanbevolen: de 32P-postlabeling techniek en met behulp van radioactief gelabelde stof (bijv., 3H of 14 C). Voor de eerste wordt piloot, screening van de 32P-postlabeling bepaling aanbevolen. De bepaling van het DNA-gehalte in oplossingen, juist geëvalueerd, moet voorafgaan aan beide methoden.

De 32P-postlabeling techniek maakt gebruik van de enzymatische hydrolyse van DNA gewijzigd door niet-radioactieve chemische producten (carcinogeen/drug) 3´-phosphodeoxynucleosides, extra fosforylatie met radioactief fosfor (32P) bij de 5´- OH adducten positie, en de scheiding van chemische-deoxynucleotide van normale (ongewijzigde) deoxynucleotides door chromatografie17 (Figuur 1). DNA gewijzigd door een chemische verbinding is gehydrolyseerd door een mengsel van endonuclease en micrococcal nuclease exonuclease, bekend als fosfodiësterase milt. Het mengsel van gehydrolyseerde DNA dat beide normaal (ongewijzigd) bevat en bewerkt deoxyribonucleoside 3´-monophosphates is gereageerd met [γ -32P] ATP in het bijzijn van de vervoerder (niet-radioactieve) ATP en T4-polynucleotide kinase bij pH 9,5 naar formulier 5´- 32P-label 3´, 5´-bisphosphates ("standaard" procedure in Figuur 1). De gebruikte alkalische pH is geschikt voor het minimaliseren van de enzymactiviteit van T4-polynucleotide kinase aan dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates op positie 3´. Scheiding en resolutie van 32P-geëtiketteerden adducten van gelabelde deoxynucleotides die niet zijn gewijzigd door chemische stoffen wordt uitgevoerd door meerdere richtingen anion-uitwisseling Dunnelaagchromatografie (TLC) op polyethyleneimine (PEI) cellulose (Figuur 2 ). In de eerste en tweede elutie stappen (in de richting van D1 en D2), worden gelabelde normale (ongewijzigde) deoxynucleotides evenals [32P] fosfaat geëlueerd vanaf het begin van de plaat van de TLC-PEI-gemengd met cellulose met behulp van water oplossingen van elektrolyt op een kort stukje chromatografische papier toegepast op de bovenkant van de TLC-plaat, dat het deoxynucleotides gebonden chemicaliënhoudend exposeren hydrofobe eigenschappen (carcinogeen/drug-adducten) gehandhaafd aan het begin van PEI-gemengd met cellulose plaat blijven worden bovendien opgelost met verschillende oplosmiddel systemen in D3 en D4 richtingen (Figuur 2). Lokalisatie van adducten wordt uitgevoerd met behulp van autoradiografie scherm verbeterd; de gescheiden adducten die worden herkend als donkere herkenbare plekken op X-ray films. De gebieden van spots zijn weggesneden uit de plaat en gebruikt te kwantificeren van de radioactiviteit door vloeibare scintillatietelling of Cerenkov tellen. Een opslag fosfor imaging methode die aangepast is voor kaart en kwantificeren van DNA adducten op chromatogrammen gedetecteerd door de 32P-postlabeling assay wordt nu ook gebruikt. 18 the Instant Imager machine wordt vaak gebruikt voor dergelijke detectie en kwantificering van DNA adducten. Deze methode biedt meer dan 10 - keer hogere gevoeligheid voor het opsporen van 32P dan de techniek van het scherm verbeterd autoradiografie19.

Hoeveelheid DNA adducten als waarden van relatieve labeling (RAL) adduct, berekend met behulp van de vergelijking (2) als volgt worden bepaald:

CPM. in adduct deoxynucleotides
RAL =---(2)
specifieke activiteit van 32P-ATP (in cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

De waarden van de RAL's zijn de verhouding tussen de tarieven van de graaf van deoxynucleotides geadduceerd over graaf tarieven van totaal [geadduceerd en normale (ongewijzigde) deoxynucleotides]2120,deoxynucleotides. Echter, deze berekening is gebaseerd op gelijke etikettering efficiëntie van adducten en normale deoxynucleotides22. De klassieke ("standaard") procedure van de 32P-postlabeling techniek is geschikt voor verschillende DNA adducten (omvangrijk en/of niet-omvangrijk adducten), de gevoeligheid is echter niet bevredigend te detecteren adducten gevonden in lage bedragen in DNA. Met deze procedure, is het bedrag van een adduct in 107 ongewijzigd deoxynucleotides in DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) aantoonbaar.

Een aantal wijzigingen van deze klassieke 32P-postlabeling procedure hebben gebruikt te verheffen van de gevoeligheid van de techniek. Maximaal 10 tot 100 keer hogere gevoeligheid van bepaling van adducten door 32P-labeling is geboekt met behulp van beperkende niveaus van [γ -32P] ATP (de intensivering procedure). 23 , 24 een verdere procedure die dat een toename van de gevoeligheid van de 32P-postlabeling-methode maakt gebruik van een incubatie verteerd DNA bevatten adducten met nuclease P1 (van Penicillium citrinum)21 (Figuur 1). Dit enzym verkiest te ongewijzigde deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate, overwegende dat de deoxynucleotides met afhankelijke chemicaliën (geadduceerd nucleotiden) in wezen niet de substraten van dit enzym zijn. Daarom gedefosforyleerd deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (d.w.z., deoxyribonucleosides) zijn niet phosphorylated door T4-polynucleotide kinase door [32P] fosfaat uit γ -32P] ATP. Echter, sommige van nucleotiden waar chemicaliën zijn gebonden (geadduceerd deoxynucleotides), zoals arylamine adducten vervangen bij C8 van deoxyguanosine, kan bedephosphorylated door dit enzym. In tegenstelling, de meeste andere adducten (b.v.adducten vervangen op N2 voor deoxyguanosine) zijn niet gedefosforyleerd door nuclease P1. Deze wijziging van 32P-postlabeling maakt deze methode aanzienlijk gevoeliger, verhogen van de gevoeligheid van meer dan drie ordes van grootte. Bovendien, deze versie van 32P-postlabeling biedt een methode waar hogere hoeveelheden DNA (5-10 µg) en een overmaat aan vervoerder-vrije [γ - 32P] ATP kan worden gebruikt.

Een andere methode te verrijken de adducten, beschreven door Gupta25, maakt gebruik van de fysisch-chemische eigenschappen van de omvangrijke deoxynucleotide adducten, die kan worden gewonnen in n-butanol in aanwezigheid van een fase transfer agent tetrabutylammoniumwaterstofsulfaat chloride (TBA) (Figuur 1) vóór [32P] fosfaat labeling, overwegende dat ongewijzigde deoxynucleotides slecht worden geëxtraheerd door dit organisch oplosmiddel. Echter, minder hydrofobe adducten, bestaande voor voorbeeld van deoxynucleotides gemodificeerde met niet-aromatische omvangrijk wordt of kleine alkyl residuen, zijn niet effectief gewonnen met n-butanol. Vandaar, zijn zij in wezen niet op te sporen wanneer zijn geanalyseerd door deze wijziging van de 32P-postlabeling methode.

Zowel de eerder genoemde versie van 32P-postlabeling verhoging van de gevoeligheid en de kwantificering van DNA adducten enorm (tot drie ordes van grootte), zijnde kundig voor speurder een adduct per 109,10 normale nucleotiden (0.3 - 3 amol/µg DNA). Deze twee methoden worden aanbevolen voor het testen van de chemicaliën voor hun efficiëntie covalent binden aan DNA en daarom worden ze beschreven in dit werk in details.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd overeenkomstig de voorschriften voor de zorg en het gebruik van proefdieren (311/1997, ministerie van landbouw, Tsjechische Republiek), die in overeenstemming met de verklaring van Helsinki is.

1. isolatie van hepatische microsomale en cytosolische breuken

  1. Bereiden lever subcellular breuken (microsomes rijk aan enzymen van de P450 of cytosols rijk aan reductases of oplosbare Peroxidasen) van ratten door eenvoudige differentiële centrifugeren (105.000 x g).
    Opmerking: De pellet en supernatant worden genomen als microsomes en cytosols, respectievelijk.
    1. Wassen van de lever monsters (1-10 g) tweemaal met 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 met 150 mM KCl buffer (buffer 1) (10-keer hogere volumes dan het gewicht van het weefsel, dat wil zeggen 10-100 mL) en de weefsels in kleine stukjes gesneden (van ongeveer de grootte van de 2 x 2 mm).
    2. Meng het weefsel in de aanwezigheid van deze buffer (> 3 volume/gewicht mL/g) in homogenizer bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en gooi de resterende niet-gehomogeniseerd stukken van het weefsel door middel van filtratie filteren papier. Centrifugeer het homogenaat bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en het supernatant overbrengen in een andere buis van centrifugeren.
    3. Meng opnieuw de pellet in buffer 1 (1 mL per 1 g weefsel), herhaalt u stap 1.1.3., en zich te ontdoen van de pellet. Centrifugeer gepoolde supernatant bij 15.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Het supernatant overbrengen in een andere buis van centrifugeren.
    4. Centrifugeer het supernatant bij 105.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C. Het supernatant (cytosol) te verzamelen en op te slaan in (1-10 mL) aliquots bij-80 ° C. Cytosol voor de hoeveelheid eiwit met behulp van de methode beschreven door Bradford26karakteriseren.
    5. Resuspendeer de pellet in 100 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7.4 (> 2 volume/gewicht mL/g), centrifuge op 105.000 x g voor 60 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Meng opnieuw de pellet (microsomes) in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 met 150 mM KCl en 20% glycerol (< 5 volume/gewicht mL/g) in homogenizer bij 4 ° C. Microsomes opslaan in 0.5 - 1 mL aliquots bij-80 ° C. Microsomes voor het gehalte aan eiwitten met behulp van de methode beschreven door Bradford26karakteriseren.
    6. Bepaal de concentratie van cytochroom P450 in microsomes.
      Opmerking: De concentratie van P450 enzymen in de microsomes wordt gemeten zoals beschreven door Omura en Sato27, bepalen van de absorptie van het complex van verminderde P450 met koolmonoxide (CO). Koolmonoxide is een giftige stof, en moet worden behandeld met zorg en in een capuchon.

2. incubations van teststoffen (kankerverwekkende stoffen/Drugs) met DNA in aanwezigheid van enzymatische systemen

  1. Incubatie van teststoffen (kankerverwekkende stoffen/drugs) met DNA in aanwezigheid van oxidatieve enzymatische systemen met cytochromes P450
    1. Incubatie mengsels die, in een eindvolume van 0,75 mL bij 4 ° C, de volgende verbindingen en enzymatische systemen voor te bereiden.
      1. Meng 100 mM fosfaatbuffer, pH 7.4, (0.375 mL) met 10 mM NADPH of NADPH genererende systeem (10 mM MgCl2, 10 mM D-glucose-6-fosfaat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glucose-6-fosfaat dehydrogenase) (75 µL).
      2. Voeg in dit mengsel microsomes of pure recombinante P450 in Supersomes, die microsomes geïsoleerd uit insect cellen transfected met een baculovirus constructie met cDNA van recombinante P450 enzymen, 50 pmol P450 enzymen in 50 µL microsomale of supersomal preparaten - hepatische microsomale breuken geïsoleerd in het laboratorium of een commerciële bron.
      3. Voeg 1 mg kalf thymus DNA (0.3 mL van de stockoplossing - 3.3 mg/mL in gedestilleerd water), en schudden in een roteerapparaat vortex voor 5 s.
      4. Ten slotte, voeg 7.5 µL 0.1 mM test ellipticine drug opgelost in DMSO en 42.5 µL gedestilleerd water tot een volume van incubatie mengsel van 0,75 mL. Gebruik chemische stoffen aangeduid met 3H of 14C of chemicaliën, afhankelijk van de procedure voor de opsporing van DNA adducten.
      5. Schudden in een roteerapparaat vortex voor 5 s. Incubate in geopende buizen bij 37 ° C gedurende 30-60 min.
      6. Ook bereiden twee controle incubations op dezelfde manier, maar (i) zonder een activerend systeem (microsomale monsters) of (ii) mee, maar zonder de teststof.
  2. Incubations van teststoffen (kankerverwekkende stoffen/drugs) met DNA in aanwezigheid van reductieve enzymatische systemen
    1. Incubatie mengsels die, in een eindvolume van 0,75 mL bij 4 ° C, de volgende verbindingen en enzymatische systemen voor te bereiden.
      1. Bij 4 ° C, meng 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, met 0,2% Tween 20, (0.375 mL), 10 mM oplossing van cofactor van NQO1 reductieve enzym (NADPH) (75 µL), cytosolische breuk (hepatische cytosolische breuken - in het laboratorium of in het geval van met behulp van de cytosolische geïsoleerd breuken van individuele menselijke donoren die zij zijn verkregen uit commerciële bron met 1 mg eiwit (50 µL) geïsoleerd).
      2. Voeg 1 mg kalf thymus DNA (0,2 mL van de stockoplossing - 3.3 mg/mL gedestilleerd water), en schudden in een roteerapparaat voor 5 s.
      3. Ten slotte voeg 7,5 µL 0.1 mM teststof (opgelost in gedestilleerd water, methanol, ethanol of DMSO, afhankelijk van de oplosbaarheid van de stof) en 42.5 µL gedestilleerd water tot een volume van 0,75 mL voor de incubatie-mengsel. Gebruik chemische stoffen aangeduid met 3H of 14C of chemicaliën, afhankelijk van de procedure voor de opsporing van DNA adducten (zie hieronder).
      4. Purge het reactiemengsel met argon voor 1 min. schudden in een roteerapparaat voor 5 s. Incubate in gesloten buizen bij 37 ° C gedurende 30-60 min.
      5. Ook bereiden twee controle incubations op dezelfde manier, maar (i) zonder een activerend systeem (cytosolische breuken) of (ii) mee, maar zonder de teststoffen.
  3. Extractie van incubatie mengsels met organische oplosmiddelen om de overmaat van teststoffen
    1. Meng het mengsel van de incubatie in een reageerbuis met een dop met hetzelfde volume van ethylacetaat (of diethylether of hexaan) door toevoeging van deze oplosmiddelen. Schud de inhoud van de tube op een shaker tot een emulsie vormen.
    2. Spin (3 min) op 1.600 x g in een centrifuge bij kamertemperatuur. Indien de organische en waterige fase niet goed gescheiden zijn, draaien nog eens voor een langere periode of met een hogere snelheid van centrifugeren.
    3. Verwijder de bovenste, organische fase verzamelen met een pipet. Als kleine volumes (< 400 µL) worden gebruikt, gebruiken een automatische Pipetteer uitgerust met een geschikte tip. Deze organische fase terzijde geschoven.
    4. Herhaal stap 2.3.1., 2.3.2., en 2.3.3. Verwijderen van residuele oplosmiddelen door een stroom van stikstofgas (minstens 5-10 min van verwijdering nodig zijn).
  4. Isolatie van DNA uit incubations
    1. Extractie van DNA van oplossingen met fenol/chloroform en haar neerslag met ethanol
      1. Elimineren van eiwitten om te isoleren van DNA van incubatie mengsels door winning van eiwitten uit oplossingen van DNA met fenol, fenol/chloroform (1:1), en chloroform door de procedure hieronder.
      2. Het mengsel van incubatie combineren met hetzelfde bedrag van fenol, fenol/chloroform (1:1) in een Valk of Eppendorf buis met een cap. Roer het mengsel tot een emulsie vormen.
      3. Spin (3 min) op 1.600 x g in een centrifuge bij kamertemperatuur. Indien de organische en waterige fase niet goed gescheiden zijn, draaien nog eens voor een langere periode of met een hogere snelheid van centrifugeren.
      4. De bovenste waterfase met een pipet overbrengen in een nieuwe polypropyleen buis. Als kleine volumes (< 400 µL) worden gebruikt, gebruiken een automatische Pipetteer uitgerust met een geschikte tip. De eiwit-interface samen met de organische fase te verwijderen.
      5. De bovenste waterfase combineren met hetzelfde bedrag uit een mengsel van fenol en chloroform (1:1). Reproduceren stappen 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. De bovenste waterfase combineren met dezelfde hoeveelheid chloroform en herhaal de stappen 2.4.1.2. -2.4.1.4. Het DNA herstellen door precipitatie met 2 delen van koude (-20 ° C) ethanol. Vastgesteld wat de omvang van de DNA-oplossing.
      7. De concentratie van monovalent caties aan te passen door toevoeging van 5 M natriumchloride voor de finale concentraties van 0,1 M. Roer krachtig. Combineren met 2 delen van koude (-20 ° C) ethanol en meng goed. Koel af tot-20° C.
      8. Bewaren bij-20 ° C tot DNA wordt neergeslagen. Wanneer DNA is gefragmenteerd tijdens de incubations (bv., door vorming van zuurstof radicalen tijdens de activering van de enzymatische reactie) of tijdens de procedure van de isolatie aan de grootte van DNA dat is klein (< 1 kb) of wanneer het DNA is aanwezig in kleine hoeveelheden (< 0.1 mg / mL), de tijd van koeling moet worden verhoogd en de temperatuur verlaagd naar 70 ° C.
      9. Spin (10 min) bij 1600 x g bij 0 ° C in een centrifuge. Als DNA aanwezig bij lage concentraties of in de vorm van kleine fragmenten is, draaien nog eens voor een langere periode (30 min). Verwijder het supernatant.
      10. Wassen als wilt verwijderen sommige opgeloste stoffen (of resterende sporen van de teststof) die mogelijk aanwezig zijn in geprecipiteerde DNA, DNA met 70% ethanol en diethylether. Wash neergeslagen DNA met koude (-20 ° C) 70% ethanol. Spin (10 min) bij 1600 x g bij 0 ° C in een centrifuge. Verwijder het supernatant.
      11. Herhaal de stap 2.4.1.10. Wash neergeslagen DNA met koude (-20 ° C) 70% ethanol. Spin (10 min) bij 1600 x g bij 0 ° C in een centrifuge. Verwijder het supernatant.
      12. Herhaal de stap 2.4.1.10. Zet de buis in een verticale stand op absorberend papier te verwijderen van de resterende bovendrijvende substantie. Het wassen van de DNA-pellet door toevoeging van 1 mL diethylether te negeren de potentiële residuen van de chemische uit geïsoleerde DNA test. Spin (10 min) bij 1600 x g bij 0 ° C in een centrifuge. Verwijder het supernatant.
      13. Los van de DNA-pellet in het juiste volume (meestal in 100-400 µL om een DNA-concentratie van 0,5 - 1 µg/µL) gedestilleerd water (of in 0,15 mM Natriumcitraat en 1,5 mM natrium chloride). De DNA-oplossing kan staan bij 4 ° C's nachts, of kan worden verwarmd tot 37 ° C gedurende 10-30 minuten toe ontbinding van DNA.
      14. Voordat u opbergt, scheidt u de DNA in kleine porties (10-20 µL), omdat herhaald bevriezen en ontdooien van DNA oplossingen kan resulteren in een afname van het adduct van concentraties. Opslaan bij-80 ° C of kouder.
        Opmerking: Spectrofotometrische bepaling van DNA: de eenvoudige en nauwkeurige methode, die veel gebruikt wordt voor het meten van de hoeveelheid DNA in een preparaat als het monster puur is (dat wil zeggen, zonder grote hoeveelheden contaminanten zoals eiwitten, fenol, of andere Nucleic zuren), is de spectrofotometrische meting van de hoeveelheid DNA van UV straling geabsorbeerd door de basen (Zie de eerder beschreven procedures)28.
  5. Procedures voor de opsporing van DNA adduct vorming
    1. 32 P-postlabeling test
      Opmerking: DNA hydrolyse maakt gebruik van het hydrolysaat bereid in dit stadium voor de analyse van adducten (2.5.1.), alsmede van normale (ongewijzigde) deoxynucleotides (2.5.7.).
      1. Los micrococcal nuclease (MN) in water met een concentratie van 450 ~ units (U) / mL. Dialyze tegen gedestilleerd water en aan te passen aan 300 U/mL. Dialyze van de milt fosfodiësterase (SPD) oplossing en pas op 4 U/mL.
      2. Meng MN en SPD eindconcentraties 150 mU/µL MN en 2,5 mU/µL EPD (MN/SPD-oplossing). Nemen van DNA oplossing met 12,5 µg en damp deze volledig in een verdamper. Ontbinden in 6.5 µL gedistilleerd water.
      3. Toevoegen van 5.0 µL MN/SPD oplossing (eindconcentratie van MN is 60 mU/µL, eindconcentratie van EPD is 1 mU/µL) en 1,0 µL spijsvertering buffer (eindconcentratie van natrium succinaat is 20 mM, eindconcentratie van CaCl2 is 8 mM). Het uiteindelijke volume van het mengsel is 12,5 µL. Mix en toestaan dat reacties gedurende 3 uur bij 37 ° C.
      4. Verwijderen van 2,5 µL (transfer naar een andere buis) voor verdere verdunning en analyse van ongewijzigde deoxynucleotides (2.5.7.)
    2. Nuclease P1 verrijking procedure
      1. De resterende 10.0 µL van hydrolysaat, toevoegen 0,65 µL natrium acetaat buffer (eindconcentratie, 40 mM), 0,65 µL ZnCl2 oplossing (eindconcentratie 0.1 mM), 1,25 µL NP1 oplossing (eindconcentratie, 0.385 µg/µL) en 0,45 µL gedestilleerd water. Het uiteindelijke volume van het mengsel is 13 µL.
      2. Laat het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 ° C reageren, en het einde van de reactie met toevoeging van 3 µL van Tris oplossing.
    3. n-Butanol verrijking procedure
      1. Voeg aan de resterende 10.0 µL van DNA-hydrolysaat, 215 µL van 25 µL 10 mM TBA chloride oplossing, pH 3,5 en 11,6 mM ammonium formate oplossing. Uittreksel met 250 µL n-butanol (verzadigd met water) door het krachtig mengen. Spin (3 min) op 1.600 x g te scheiden van de lagen, en het opstijgen van de bovenste n-butanol laag. Pak nog eens met 250 µL n-butanol (verzadigd met water), spin, de bovenste nopstijgen-butanol laag en combineren met voormalige extract.
      2. Voeg 400 µL water (verzadigd met n-butanol) daartoe pak en krachtig mengen. Spin om te scheiden van lagen en de onderste waterige laag verwijderen. Herhaal deze procedure van wassen met behulp van 400 µL van water (verzadigd met n-butanol). Voeg 3 µL van 250 mM Tris-HCl-oplossing, pH 9.5, voor de n-butanol laag. Verdampen van n-butanol aan droogte in een verdamper bij kamertemperatuur.
      3. Los het residu op in 100 µL n-butanol, damp deze volledig weer, en los het residu op in 16,0 µL water.
    4. Etikettering van de adducten
      1. Voeg 1 µL van bicine bufferoplossing (labeling buffer) en 4.5 µL van een mix met 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol van koude ATP en 10,0 U van T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinase) tot 16.0 µL oplossing uit NP1 of butanol verrijking mix. De eindconcentraties van de reagentia zullen de volgende: 20 mM bicine, 10 mM MgCl210 mM dithiotreitol, spermidine 0.5 mM en 0,5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Het totale volume van het mengsel is 20 µL.
      2. Laat het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur reageren. Toepassing van het gehele monster (dwz. 20 µL) op de PEI-gemengd met cellulose TLC-plaat (2.5.6.).
    5. Evaluatie van de werkzaamheid van NP1 of n -butanol versterking van procedures
      1. De onderkant van de buis met 50 µL water wassen. Mix krachtig gedurende 30 s en spin (1 min) op 1.600 x g in een centrifuge om er is geen besmetting op de deksel. Ter plaatse 5 µL op een PEI-gemengd met cellulose TLC-plaat (20 x 20 cm). Chromatograaf met behulp van een oplossing 280 mM in (NH4)2dus4 en 50 mM NaH2PO4, pH 6.8.
    6. TLC scheiding van geadduceerd deoxynucleotides
      1. Vooraf wassen de TLC platen met gedestilleerd water. Het wordt aanbevolen met name voor huis-en-klare platen.
        Opmerking: Deze wassing moet worden uitgevoerd om de gele kleur van platen, een kleur die de achtergrond, met name vooraan het oplosmiddel kan verheffen.
      2. Ter plaatse van het gehele monster op de PEI-gemengd met cellulose TLC-plaat en start chromatografie (2.5.4.); Clean-up van adducten wordt uitgevoerd door het ontwikkelen van de plaat in de D1 en D2 richtingen (Figuur 2).
      3. Ontwikkelen van de plaat in de richting van een D1 (Figuur 2). Gebruik 1.7 M natrium fosfaatbuffer, pH 6.8, om ervoor te zorgen dat het DNA adducten zijn nog aan het begin van de TLC-plaat. Naar analogie, ontwikkelen de plaat in een richting van de D2 met behulp van deze buffer. Voor informatie over mogelijke buffers voor procedures, zie oplossingen beschreven voor oplossing van verschillende soorten adducten20,28.
        Opmerking: Ontwikkeling van de plaat in de richting van een D2 kan worden weggelaten.
      4. De plaat in gedeïoniseerd water wassen na chromatografie gedurende ongeveer 5 min. in twee opeenvolgende Baden. Na dat, droge de platen.
      5. Ontwikkelen van de platen in de D3 en D4 richting met behulp van 3,5 M lithium formate buffer, pH 3,5, met 8,5 M ureum voor de richting van de D3 en 0.5 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, met 0,8 M LiCl en 8,5 M ureum voor D4 richting (Figuur 2). De oplosmiddelen moeten worden aangepast om de adduct plekken over de TLC-plaat. Zie voor informatie over mogelijke buffers voor D3 en D4 ontwikkelende procedures, de oplossingen beschreven voor resolutie van verschillende soorten23,24,25,28 adducten.
      6. Ontwikkelen om te voorkomen dat eventuele problemen in D4, na ontwikkeling in de richting van een D4 en een water wassen, de platen (langs de D4) in 1.7 M natriumfosfaat, pH 6.0 (meestal toegewezen als de ontwikkeling in de richting D5), naar de top van een papieren wick (12 x 11,5 cm).
        Opmerking: De D5 richting kan ook worden weggelaten. Het is in dit geval moet de TLC-tank openen wanneer het oplosmiddel heeft bereikt de top van de TLC, en toestaan dat een run voor maximaal 60 min. Deze methode is zelfs beter dan het toevoegen van een wick (vaak gebruikte methode in veel laboratoria voor het verwijderen van eventuele problemen in D4).
    7. Kwantificering van normale (ongewijzigde) deoxynucleotides na hydrolyse
      1. Verdun een aliquoot gedeelte van het hydrolysaat (van 2.5.1. beschrijven DNA hydrolyse) met gedestilleerd water, (dwz., 2.5 µL van het mengsel van de spijsvertering van 2.5.1. aangepast aan 250 µL, en 10 µL van deze oplossing aangepast aan 150 µL).
      2. Neem een 5 µL (10 pmol normale deoxynucleotides) hoeveelheid van deze digest, 2.5 µL 10 mM Tris-HCl buffer, pH 9.0 en label als in toevoegen 2.5.4. (het uiteindelijke volume van het mengsel is 10 µL). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur reageren.
      3. Neem een 4 µL van het mengsel aliquoot en Verdun tot 750 µL met 10 mM Tris-HCl, pH 9.0. Mix en spin om vast te stellen dat er geen besmetting van het deksel. Breng 5 µL op een PEI-gemengd met cellulose TLC plaat. Ontwikkelen van de TLC-plaat in een oplossing van 280 mM (NH4)2dus4 en 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Laten drogen na TLC.
      4. Gebruik autoradiografie die wordt uitgevoerd voor ongeveer 45 min bij kamertemperatuur te lokaliseren van de vier ongewijzigde deoxynucleotide bis-fosfaten. Gesneden webspots gemaakt voor de kwantificering door vloeibare scintillatietelling of Cerenkov tellen.
    8. Berekening van de relatieve adduct labeling (RAL)
      1. Het bepalen van de waarden van de graven in de adduct vlekken en de graven in het afgepipetteerde deel van gelabelde ongewijzigd (normale) deoxynucleotides.
        Opmerking: De laatste moeten worden bepaald op 180.000 punten minder materiaal dan de eerste, een cijfer dat de omrekeningsfactor toe te passen aan de graaf van ongewijzigde (normale) deoxynucleotides is voor de evaluatie van de waarden van de RAL van adduct niveaus. RAL van DNA adducten wordt berekend volgens de vergelijking (2) hierboven.
    9. Detectie van de binding van de test kankerverwekkend of drugs DNA met behulp van radioactief gelabelde drug
      1. Evalueren de 3H of 14C radioactiviteit van DNA die zijn bewerkt met chemicaliën door vloeistofscintillatietelling.
      2. 10-50 µL van DNA oplossing aan een Scintillatie oplossing in de Scintillatie flacon 3 mL toevoegen. Meng goed. Het meten van de radioactiviteit met behulp van het prestatiemeteritem scintillatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de protocollen die hier beschreven voor het gebruik van enzym-gekatalyseerde activering (dat wil zeggen, P450 peroxidase, reductase) te onderzoeken van de potentie van chemische stoffen (kankerverwekkende stoffen/drugs) om te worden gemetaboliseerd tussenproducten resulterend in hun covalente binden aan DNA (generatie van DNA adducten), we waren in staat om op te lossen (i) een nieuw mechanisme van de farmacologische werking van de ellipticine van antikanker agent (Zie voor een overzicht,29,30,31), (ii) de etiologie van twee nephropathies die is gekoppeld aan de urothelial van de bovenste tractus kanker veroorzaakt door plant alkaloïde aristolochic zuur (Aristolochic zuur nefropathie en Balkan endemisch nefropathie) (Zie voor een overzicht,32,33,34, 35,,36,,37,38,39), en (iii) de genotoxische mechanismen van carcinogeniteit van verschillende carcinogenen zoals een luchtvervuiler 3 - nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 en zijn reductieve tegenhanger, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 planten alkaloïde aristolochic zuur,32,33,34,35,,36,,37 , 38 , 39 en een aromatische amine o- anisidine. 49 , 50 , 51 , 52 verder, de bepaling van de biologische effecten van deze chemicaliën enzymen waren vastbesloten de beschreven methoden in dienst.

Hier, vertegenwoordiger op de oxidatieve activering van ellipticine door P450s en Peroxidasen resulterend in de generatie van covalente adducten met DNA, en vermindering van 3-NBA voor metabolieten die covalent gemodificeerd DNA, worden weergegeven.

De plant alkaloïde ellipticine (5,11-dimethyl-6H- pyrido [4,3 -b] carbazole) en derivaten daarvan wordt antitumorale stoffen, die als verdovende middelen met een DNA-beschadiging via verschillende mechanismen handelen, opgenomen in de arrestatie van de celcyclus en inductie van Apoptosis (voor een overzicht, Zie29,30,31). Met behulp van de protocollen die zijn beschreven in dit werk, we laten zien dat de antikanker drug covalente DNA genereert adducten na metabolische bioactivation gekatalyseerd door microsomale P450s (Figuur 3) en Peroxidasen (Figuur 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61en dit verklaard de sterke efficiëntie van deze agent tegen kanker cellen30. De [3H]-radiolabeled ellipticine en de nuclease P1-versie van de 32P-postlabeling techniek werden voornamelijk gebruikt in de studies29,30,31,53 ,61. Met behulp van de complexe studie met subcellular enzym systemen, het enzym remmers en zuivere enzymen in de experimenten met behulp van de beschreven protocollen, de overheersende P450 enzymen oxiderende ellipticine reactieve soorten vorming DNA adducten en structuren van deze reactieve soorten werden gekenmerkt29,30,31,55. Van de P450s onderzocht, is het enzym CYP3A4 menselijke het meest efficiënt in ellipticine oxidatie 12-hydroxyellipticine en 13-hydroxyellipticine, de ellipticine metabolieten, die spontaan ellipticine-12-ylium en ellipticine-13-ylium ontleden binding met DNA (Figuur 5). 55 , 61 de CYP-enzymen ook genereren verdere metabolieten zoals 9-hydroxyellipticine, die wordt beschouwd als een ontgifting metaboliet, 7-hydroxyellipticine en ellipticine N2-oxide, die worden gevormd als de minderjarige ellipticine metabolieten. De 9-hydroxyellipticine, evenals 7-hydroxyellipticine en ellipticine N2-oxide worden voornamelijk gevormd door CYP1A1 en CYP2D6, respectievelijk. 55 , 57 , 58

Peroxidasen (d.w.z., horseradish peroxidase (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) en cyclooxygenases (COX-1 en COX-2)) metaboliseren ellipticine voor het genereren van hetzelfde ellipticine afkomstige DNA adducten (Figuur 4)61 door de mechanismen die zijn afgebeeld in Figuur 5.

De nitroaromatic 3-NBA (3-nitro-7H-benzdeanthracen-7-one) is een onderdeel van diesel uitlaatgassen en deeltjes in de lucht62,63,,64vlindertje. De belangrijkste metaboliet van deze verontreinigende stof, 3-ABA,64,65 werd ontdekt in urine van werknemers van zoutmijnen die werden blootgesteld aan de uitstoot van diesel voor een lange tijd-63. Deze bevinding wordt aangetoond dat deze werknemers werden blootgesteld aan 3-NBA. Deze nitroaromatic veroorzaakt longkanker tumors bij ratten na intratracheale instillatietest67. 3-NBA fungeert ook als een mutagene stof in de test van de Ames Salmonella typhimurium (in stam YG1024 overexpressing nitroreductase en O- acetyltransferase), het genereren van meer dan 6 miljoen terugmutanten per nanomole in deze stam62. De potentie van genotoxische werd ook aangetoond door generatie covalente adducten met DNA in vitro, na activering door verschillende enzymen, met behulp van de protocollen die zijn beschreven in dit werk, en in vivo in verscheidene organen van knaagdier dieren (Figuur 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,,67,68.

De 3-NBA-afgeleide DNA adducten gevormd nadat 3-NBA activering met cytosolische reductases (d.w.z., NQO1) werden gemeten door de nuclease P1 en n-butanol verrijking methoden van de 32P-postlabeling methode beschreven in de protocollen in deze studie gepresenteerd. De resultaten aangegeven de vorming van maximaal vijf DNA adducten (adduct plekken 1-5 in Figuur 7), en drie van hen werden gekenmerkt te 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (dA -N6-C2-ABA; adductie ter plaatse van 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG -N2-C2-ABA; adduct van plek 3) en N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8 -N-ABA; adduct plekken 4. en 5) (Figuur 7 en Figuur 8). Met behulp van de nuclease P1-versie van de 32P-postlabeling methode, het dG-C8 -N-ABA (adduct plekken 4 en 5) was niet detecteerbaar (Figuur 7 en Figuur 8). Dit resultaat wijst erop dat sommige beperkingen van deze versie van 32P-postlabeling optreden, namelijk, de lage (indien aanwezig) detectie van geadduceerd deoxynucleotides die gedefosforyleerd door nuclease P1 (dat wil zeggen, adducten gevormd tijdens oxidatie van arylamines of door vermindering van aromatische nitroderivatives N- hydroxyarylamine-derivaten vervangen bij C8 van deoxyguanosine). Gelijkaardig aan de studie met ellipticine, gebruik makend van de complexe studie met subcellular enzym systemen, het enzym remmers, pure enzymen en DNA adduct normen in de experimenten met de protocollen die zijn beschreven in dit werk, de overheersende cytosolische vermindering van enzymen hen metaboliseren 3-NBA voor metabolieten genereren DNA adducten, namelijk de reactieve metaboliet gevormd door vermindering van de 3-NBA (N-OH-ABA), en structuren van drie DNA adducten gegenereerd door 3-NBA werden gekenmerkt (Figuur 7 en Figuur 8). In de lever, bioactivation van 3-NBA in vitro bleek vooral te wijten aan menselijke en rat NQO1 (Figuur 7), terwijl menselijke N,O- acetyltransferases (NAT), NAT2, NAT1, zwavelbevattende (SULT), SULT1A1, en een mindere mate, SULT1A2 zijn de overheersende enzymen van fase II 3-NBA42activeren. Hepatische microsomale POR is ook effectief in de activering van 3-NBA41, maar bij muizen, 3-NBA is voornamelijk bioactivated door NQO1 in plaats van deze microsomale POR42. In Long, oftewel het doelweefsel voor 3-NBA carcinogeniteit67, reduceren NQO1 zowel XO tot metabolieten die genereren DNA adducten 3-NBA. XO lijkt echter te fungeren als een kleine 3-NBA activerend enzym in dit orgel69.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de 32P-postlabeling bepaling. De afzonderlijke stappen van de 32P-postlabeling methode en de verbeterde procedures worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: patroon van DNA adduct elutie op PEI-gemengd met cellulose TLC platen. De multidirectionele chromatografie van DNA adducten op PEI-gemengd met cellulose platen worden weergegeven. OORSPRONG is een beginpositie op de PEI-gemengd met cellulose TLC plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: 32P-postlabeling analyses van DNA adducten gevormd in kalf thymus DNA geïncubeerd met ellipticine, NADPH en rat (A) en (B) menselijke hepatische microsomes, (C) een besturingselement proeven zonder microsomes. Adducten 1en 2 toegewezen door middel van pijlen worden gegenereerd in de deoxyguanosine in DNA door ellipticine geactiveerd met microsomes. 32 P-postlabeling werd uitgevoerd met de nuclease P1-versie van de methode (stap 2.5.2.) Oorsprong bevinden zich in de onderste linker hoeken (D3 van beneden naar boven- en D4 van links naar rechts). D2 werd weggelaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: 32P-postlabeling analyses van ellipticine-gemedieerde DNA adducten. Adducts gevormd in kalf thymus DNA reageerde met ellipticine (100 µM) en mierikswortelperoxidase (A), runderen lactoperoxidase (B), menselijke myeloperoxidase (C), schapen cyclooxygenase-1 (D), menselijke cyclooxygenase-2 () E) (5 µg Peroxidasen waren aanwezig in de incubations), uit de lever van ratten behandeld met ellipticine van 40 mg per kilogram lichaamsgewicht (bw) (F), van kalf thymus DNA DNA met ellipticine en menselijke CYP3A4 reageerde (G), met 13 - hydroxyellipticine(H), ellipticine N2-oxide (ik), en 12-hydroxyelipticine (J). Experimenten werden uitgevoerd met behulp van de nuclease P1-versie van de test (stap 2.5.2.) Oorsprong zijn in de onderste linker hoeken (D3 van beneden naar boven- en D4 van links naar rechts). D2 werd weggelaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: oxidatie van ellipticine door Peroxidasen en CYPs met de ellipticine metabolieten en die stelde voor het genereren van DNA adducten. De verbindingen tussen haakjes hebben niet nog ontdekt onder de proefomstandigheden die in de experimenten worden gebruikt, en ze zijn de elektrofiele metabolieten gepostuleerd als ultieme soorten binding met DNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: metabole activering van en DNA adduct vorming door 3-nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) quinone oxidoreductasen; NAT, N,O- acetyltransferases; SULT, zwavelbevattende; CYP, cytochroom P450; POR, NADPH: cytochroom P450 oxidoreductasen; HRP, mierikswortelperoxidase; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; COX-1, cyclooxygenase-1. R = COCH -3 of -zo3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; dG -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: 32P-postlabeling analyses van 3-NBA-afgeleide DNA adducten. De nuclease P1-(links panelen) en n-butanol extractie versies (juiste panelen) van de methode werden gebruikt. Aeen en A,b, adducten gevormd in kalf thymus DNA reageerde met 3-NBA (300 µM) na activering met rat hepatische cytosols. Been en Bb, adducten gevormd in kalf thymus DNA, reageerde met 3-NBA (300 µM) na activering met menselijke hepatische cytosol (gepoolde breuk). Ceen en Cb, adducten gevormd in kalf thymus DNA, reageerde met 3-NBA (300 µM) na activering met zuivere rat hepatische NQO1 (0.09 eenheden). Deen en Db, adducten gevormd in kalf thymus DNA, reageerde met 3-NBA (30 µM) na activering met menselijke recombinante NQO1 (0.06 eenheden). Eeen en Eb, adducten gevormd in zalm testis DNA behandeld met N-OH-ABA. Feen en Fb, adducten gevormd in lever DNA van wild-type nestgenoten op een achtergrond van de C57BL/6 blootgesteld aan 2 mg 3-NBA per kg b.w. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: 32P-postlabeling analyses van DNA 3-NBA-afgeleide adduct normen [dG -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) en dG-C8 -N-ABA (C)] (panelen een) en structuren van 3-NBA en deze 3-NBA-DNA adducten () panelen b). De n-butanol extractie versie van de methode werd gebruikt (panelen een). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze paper wordt aangetoond een breed toegankelijke methode om te studeren van de potentie van chemische stoffen als bioactivated metabole tussenproducten, resulterend in de generatie van covalente DNA adducten. Dit is een cruciaal probleem, omdat de evaluatie van de potentie van milieu chemicaliën of drugs van hun enzymatische activatie te metabolieten genereren covalente DNA adducten is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. De wijziging van DNA door kankerverwekkende stoffen beschouwd als de oorzaak van de ontwikkeling van de tumor is nu beoordeeld als een centrale dogma van carcinogenese veroorzaakt door kankerverwekkende stoffen. Deze suggestie wordt bevestigd door een scala aan bevindingen, zoals de verschijnselen die: (i) de kankerverwekkende eigenschappen van verschillende carcinogenen is afhankelijk van bioactivation van deze verbindingen om metabolieten te reageren met nucleofiele centra in DNA; (ii) niveaus van DNA adducten vaak overeen met vele kankerverwekkende reacties; (iii) en de mutatie in bepaalde tumor suppressor genen en de activering van verschillende proto-oncogenes kan worden veroorzaakt door hun modificatie met chemicaliën met kankerverwekkende potencies. De covalente modificatie van DNA door geneesmiddelen blijkt bovendien als één van de meest efficiënte DNA-schadelijk effecten van deze drugs, wat resulteert in het gebruik ervan in de behandeling van kanker.

Er zijn twee kritieke punten die de succesvolle evaluatie van chemicaliën voor hun genotoxische eigenschappen, dat wil zeggen hun potencies bepalen vormen covalente DNA adducten, specifiek: (i) te vinden, oplossen, en de efficiëntie van enzymatische karakteriseren systemen die kunnen activeren van kankerverwekkende stoffen/drugs elektrofiele soorten bindende de nucleofiele centra van DNA, en (ii) te ontwikkelen en gebruiken van de meest geschikte technieken, door die carcinogeen/drug-DNA adducten zijn gevonden en structureel gekenmerkt. De geëigende methoden voor beide functies worden beschreven in deze studie.

Isolatie procedures voor cellulaire breuken met biotransformatie enzymen (microsomale of cytosolische monsters met P450s en extra bioactivating enzymen d.w.z. Peroxidasen of reductases POR, NQO1, XO en AO), de protocollen voor bioactivation van test kankerverwekkende stoffen/drugs door de enzymatische systemen (incubations met DNA), en het gebruik ervan aangetoond in dit werk aangegeven, zoals blijkt uit de representatieve resultaten, hun geschiktheid voor de evaluatie van genotoxische eigenschappen van chemische stoffen.

Verder, de methoden die geschikt zijn voor de detectie en kwantificering van adducten met DNA zoals twee versies van de verrijking van de 32P-postlabeling techniek (de nuclease P1- en n -butanol extractie procedures) en het gebruik van radioactief gelabelde geteste stoffen werden getoond geschikt voor studies genotoxiciteit van carcinogeen/drug xenobiotica evalueren.

Betreffende de bepaling van de covalente DNA adducten, niet alleen deze twee methoden, maar ook andere methoden die bruikbaar zijn voor de detectie en meting van DNA adducten geweest gevestigde8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. tot 1981, de kwantificering van DNA adducten benutte radioactieve chemische stoffen (kankerverwekkende stoffen/drugs), gelabeld door 3H of 14C, die kunstmatig zijn voorbereid. Dergelijke methoden hebben gebruikt nuttig voor studies met ellipticine zoals beschreven in dit werk (Zie53,54). Het is echter meestal moeilijk te bereiden de derivaten met hoge radioactiviteit voor hun succesvolle gebruik73,80,81. Dus, hoewel deze procedure nog steeds gebruikt wordt, het is helaas beperkt tot in vitro experimenten vergelijkbaar zijn met die hier beschreven. Van andere technieken, massaspectrometrie, elektron spray ionisatie (ESI), laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie (MALDI), versneller massaspectrometrie (AMS), fluorescentie, biologische methoden zoals immunoassay en 32 P-postlabeling in deze studie in detail beschreven werden ontwikkeld (Zie voor herziening,8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,,81,82).

De 32P-postlabeling assay beschreven in het protocol van dit werk wordt getoond, die heeft niet alleen de toepasbaarheid in de in vitro experimenten (Zie vertegenwoordiger resultaten), namelijk, het testen van nieuwe verbindingen voor genotoxiciteit of mechanistische onderzoeken van de kankerverwekkende stof/drug activering, maar heeft ook verdere toepassingen zoals de evaluatie van de blootstelling van de mens aan milieu carcinogene agentia, studies over de mechanismen van tumor-ontwikkeling, toezicht op reparatie van DNA, onderzoek van DNA schade door endogene verbindingen en oxidatieve reacties en onderzoeken van de reactie van patiënten op cytotoxische antikanker geneesmiddelen72,-83.

Deze techniek is, echter niet zonder enige beperkingen73. De laesies in DNA, die niet stabiel als monodeoxynucleotides, kunnen betrouwbaar worden bepaald. De 32P-postlabeling methode is niet in staat van identificatie van de structuren van DNA adductie. Daarom, structurele karakterisering van DNA adducten vaak berust op het aantonen van hun co-chromatografie met synthetische normen van bekende structuren. Inderdaad, een dergelijke methode werd gebruikt in beide voorbeelden van de representatieve resultaten die in dit werk (ellipticine, 3-NBA) weergegeven.

Kortom, de protocollen weergegeven in dit werk kunnen worden beschouwd als geschikte methoden voor de evaluatie van de potentie van milieu chemicaliën of drugs als enzymatisch bioactivated om metabolieten genereren covalente DNA adducten, een zeer belangrijke proces voor de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door Tsjechische Science Foundation (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Biochemie kwestie 133 Drug carcinogeen bioactivation,cytochroom P450 reductases DNA adducten 32P-postlabeling
Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs <em>In Vitro</em> en hun vastberadenheid door <sup>32</sup>P-postlabeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stiborova, M. Formation of Covalent… More

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter