तेल embedding और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए माइक्रोबियल कॉलोनी की धारा
Summary
हम निर्धारण, आयल embedding, और पतली माइक्रोबियल कॉलोनी फिल्म के लिए अनुभाग तकनीक का वर्णन । तैयार नमूनों में, फिल्म उपसंरचना और रिपोर्टर अभिव्यक्ति पैटर्न माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है ।
Abstract
आयल embedding के जरिए अनुभाग eukaryotic प्रणालियों में एक मोटे तौर पर स्थापित तकनीक है । यहां हम निर्धारण, embedding, और बरकरार माइक्रोबियल कॉलोनी perfused आयल मोम का उपयोग कर फिल्म के अनुभाग के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । कॉलोनी पर उपयोग के लिए इस विधि को अनुकूलित करने के लिए, हम अपने विकास सब्सट्रेट पर प्रत्येक नमूने को बनाए रखने और यह एक आगर परत के साथ फाड़ना के लिए तकनीक विकसित की है, और निर्धारण समाधान के लिए lysine जोड़ा । इन अनुकूलन नमूना प्रतिधारण और micromorphological सुविधाओं के संरक्षण में सुधार होगा । इस तरीके से तैयार किए गए नमूनों में प्रकाश, प्रतिदीप्ति, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पतले सेक्शनिंग और इमेजिंग के लिए उत्तरदायी होते हैं । हमने इस तकनीक को Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, बैसिलस सबटिलिस, और Vibrio हैजाकी कॉलोनियों में लागू किया है । इस विधि द्वारा उत्पंन नमूनों में दिखाई विस्तार के उच्च स्तर, रिपोर्टर तनाव इंजीनियरिंग या विशिष्ट रंगों के उपयोग के साथ संयुक्त, शरीर विज्ञान और माइक्रोबियल समुदायों के विकास में रोमांचक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
Introduction
अधिकांश रोगाणुओं की क्षमता है कि वे स्व-निर्मित मैट्रिक्स के द्वारा एक साथ आयोजित की जाने वाली कोशिकाओं के समुदायों को बनाते हैं । कई प्रकार के भौतिक स्थापकों में, पोषक तत्वों और सब्सट्रेट प्रावधान की विभिन्न सरकारों के साथ-साथ फिल्में उगाई जा सकती हैं । विशेष रूप से फिल्म निर्माण के लिए परख reproducible कोशिकीय संरचनाओं उपज करते हैं, और आम वास्तुकला समुदाय या macroscopic स्तर पर phylogenetically विविध प्रजातियों के लिए मनाया जाता है । जब रोगाणुओं एक वातावरण के तहत ठोस माध्यम पर कालोनियों के रूप में हो रहे हैं, macroscopic आकृति विज्ञान मैट्रिक्स उत्पादन के लिए क्षमता के बारे में जानकारी देते है और अक्सर अंय लक्षण 1,2,3के साथ संबद्ध । माइक्रोबियल कालोनियों की आंतरिक वास्तुकला भी जैव फिल्म विशिष्ट रसायन विज्ञान और शरीर विज्ञान के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं, लेकिन विशेषताएं मुश्किल हो गया है । बैक्टीरियल कालोनियों के लिए cryoembedding और cryosectioning तकनीक के हाल के अनुप्रयोगों के अभूतपूर्व संकल्प 4,5,6पर इमेजिंग और विशिष्ट सुविधाओं के दृश्य सक्षम है । हालांकि, पशु ऊतक के साथ अध्ययन से पता चला है कि आयल embedding के बेहतर संरक्षण प्रदान करता है, जब cryoembedding 7 की तुलना में है और ऊतकों में बैक्टीरिया की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 8,9. हम इसलिए निर्धारण, आयल embedding, और माइक्रोबियल कॉलोनी की पतली धारा के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । यहां, हम Pseudomonas aeruginosa PA14 कॉलोनी की तैयारी का वर्णन-फिल्म पतली वर्गों 10,11, लेकिन हम भी सफलतापूर्वक बैक्टीरिया द्वारा बनाई गई फिल्म के लिए इस तकनीक को लागू किया है Pseudomonas synxantha, बैसिलस सबटिलिस, र Vibrio हैजा१२।
आयल-एम्बेडिंग और थिन-सेक्शनिंग की प्रक्रिया एक साधारण तर्क के बाद होती है । सबसे पहले, प्रसंस्करण के दौरान आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए, एक परत में विचित्रित हैं । दूसरा, crosslink अणुओं और micromorphology को संरक्षित करने के लिए एक निर्धारण में डूबे हुए हैं । ये तो शराब के साथ निर्जलित हैं, एक और गैर-ध्रुवीय विलायक के साथ मंजूरी दे दी, और फिर तरल तेल मोम के साथ घुसपैठ की । एक बार घुसपैठ के नमूने, अनुभाग के लिए मोम ब्लॉकों में एंबेडेड हैं । अनुभाग स्लाइड पर घुड़सवार, काट रहे हैं, और फिर एक अधिक देशी राज्य के लिए उन्हें वापस करने के क्रम में reहाइड्रेटेड. इस बिंदु से, वे दाग या सूक्ष्म विश्लेषण के लिए बढ़ते माध्यम में कवर किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त माइक्रोबियल फिल्म के पतले वर्गों का उत्पादन । इस विधि का उपयोग कर तैयार पतली वर्गों प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा imaged कर रहे हैं जब कॉलोनी फिल्म उपसंरचना दिखाई दे रहे हैं. फिल्म भी फ्लोरोसेंट दाग व्यक्तिगत सुविधाओं या निर्जलीकरण कदम पर दाग के लिए विशिष्ट युक्त मीडिया पर उगाया जा सकता है, तुरंत बढ़ते (चरण 9.5-9.6) से पहले । अंत में, रोगाणुओं को एक गठित या विनियमित फैशन इन समुदायों के भीतर सेल वितरण या जीन अभिव्यक्ति की रिपोर्टिंग में सीटू की अनुमति में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन इंजीनियर जा सकता है । हम कॉलोनी फिल्म गहराई, सेल वितरण, मैट्रिक्स वितरण, विकास पैटर्न, और spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आयल-embedding और पतली-खंड ऊतक के नमूने एक क्लासिक ऊतकवैज्ञानिक तकनीक है कि सूक्ष्म रूपात्मक संरचनाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है और सामांयतः eukaryotic ऊतकों पर प्रयोग किया जाता है, और माइक्रोबियल नमूनों को कुछ सफल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को NSF कैरियर अवार्ड १५५३०२३ और NIH/NIAID अवार्ड R01AI103369 द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
