Summary

Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico

Published: March 23, 2018
doi:

Summary

Describimos a fijación, inclusión en parafina y finas técnicas seccionamiento de biofilms microbianos de la Colonia. En muestras preparadas, patrones de expresión de subestructura y reportero de biofilm pueden visualizarse por microscopía.

Abstract

Seccionamiento mediante inclusión en parafina es una técnica ampliamente establecida en sistemas eucarióticos. Aquí proporcionamos un método para la fijación, inclusión y secciones de biofilms intacto Colonia microbiana utilizando parafina perfundido. Para adaptar este método para el uso en Colonia biofilms, desarrollado técnicas para mantener cada muestra en su sustrato de crecimiento y laminar con un overlayer de agar y lisina ha añadido a la solución fijadora. Estas optimizaciones mejoran la retención de la muestra y la preservación de Características micromorfológicas. Muestras preparadas de esta manera son susceptibles de fino corte y proyección de imagen por microscopía de luz, fluorescencia y transmisión. Hemos aplicado esta técnica a biopelículas de la colonia de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisy Vibrio cholerae. El alto nivel de detalle visible en las muestras generadas por este método, combinado con cepa reportero ingeniería o el uso de colorantes específicos, puede proporcionar ideas interesantes sobre la fisiología y el desarrollo de las comunidades microbianas.

Introduction

La mayoría de microbios tienen la capacidad para forma biofilms, comunidades de células ligan por matrices de producción propia. Biofilms se puede cultivar en muchos tipos de configuraciones físicas, con diversos regímenes de suministro de nutrientes y sustrato. Ensayos específicos para la formación del biofilm tienden a producir estructuras multicelulares reproducibles, y arquitecturas comunes se observan especies filogenéticamente diversas a nivel macroscópico o comunidad. Cuando microbios crecen como colonias en medio sólido bajo una atmósfera, morfología macroscópica transmite información sobre la capacidad de producción de la matriz y a menudo se correlaciona con otros rasgos 1,2,3. La arquitectura interna de las colonias microbianas también puede proporcionar pistas sobre biofilm específica química y fisiología, pero ha sido difícil de caracterizar. Recientes aplicaciones de las técnicas de crioinclusiones y cryosectioning a colonias bacterianas han permitido la proyección de imagen y visualización de características específicas en la resolución sin precedentes 4,5,6. Sin embargo, estudios con tejidos animales han demostrado que inclusión en parafina proporciona superior conservación de la morfología comparada con crioinclusiones 7 y se ha utilizado para visualizar las bacterias en los tejidos 8,9. Por lo tanto hemos desarrollado un protocolo para la fijación, inclusión en parafina y finas secciones de biofilms microbianos de la Colonia. Aquí, describimos la preparación de secciones delgadas 10,11de Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm, pero también con éxito hemos aplicado esta técnica a biofilms formados por las bacterias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, y Vibrio cholerae12.

El proceso de inclusión en parafina y secciones delgadas de biopelículas sigue una simple lógica. En primer lugar, los biofilms están contenidos en una capa de agar para preservar la morfología durante el proceso. En segundo lugar, los biofilms encajonadas son sumergidos en un fijador para macromoléculas de la reticulación y preservar micromorfología. Estos son luego deshidratados con alcohol, limpiados con un solvente más polar y luego infiltrados con cera de parafina líquida. Una vez infiltrado, las muestras están incrustadas en bloques de cera para seccionamiento. Las secciones son corte montadas en portaobjetos y luego rehidratadas para volver a un estado más nativo. Desde este punto, pueden ser manchadas o cubiertas de medio de montaje para el análisis microscópico.

Este protocolo produce finas secciones de biofilms microbianos adecuados para análisis histológico. Subestructuras de biofilm de Colonia son accesibles cuando secciones delgadas preparadas utilizando este método son imágenes por microscopia ligera. Biofilms también puede ser crecidos en las manchas fluorescentes que contienen los medios de comunicación específicos para características individuales o manchados en la etapa de rehidratación, inmediatamente antes del montaje (pasos 9.5 9.6). Por último, microbios pueden ser diseñados para producir proteínas fluorescentes de manera constitutiva o regulada, lo que en situ informes de expresión de la distribución o gen de la célula dentro de estas comunidades. Hemos utilizado estos métodos para determinar la profundidad de biofilm de Colonia, distribución celular, distribución de la matriz, patrones de crecimiento y expresión génica espaciotemporal.

Protocol

1. crecimiento de aeruginosa de los Pseudomonas Biofilms de Colonia Preparación de placas de medio-bicapa Preparar un 10 G/l triptona, agar 10 g/L solución (véase Tabla de materiales) en agua desionizada. Autoclave durante 20 min enfriar a 50-60 ° C en un baño de agua. 45 mL de la solución de agar triptona vierta un plato cuadrado de 100 x 100 mm (véase Tabla de materiales) utilizando un tubo cónico de 50 mL. Permitir que el agar se solidif…

Representative Results

Este método genera biofilm delgada-secciones en donde distintas características morfológicas y las zonas de la expresión génica pueden ser reflejadas por DIC, microscopía de fluorescencia y TEM. Mientras que la proyección de imagen DIC utilizando un 40 X objetivo de inmersión de aceite puede ser suficiente para mostrar algunos rasgos morfológicos (Figura 2E), hemos encontrado que la fluorescencia microscopía de variedades dirigido a proteína consti…

Discussion

Muestras de inclusión en parafina y secciones delgadas del tejido es una técnica histológica clásica que permite proyección de imagen de estructuras morfológicas micro se usa comúnmente en los tejidos eucarióticos y se ha aplicado con cierto éxito a muestras microbianas8 ,9. Mientras que crioinclusiones permite la fuerte retención de señal endógena e inmunofluorescente, inclusión en parafina es generalmente preferible ya que proporciona mejor preser…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por NSF carrera Premio 1553023 y Premio de NIH/NIAID R01AI103369.

Materials

5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

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Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

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