Summary

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Published: March 23, 2018
doi:

Summary

Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Abstract

Parafin katıştırma üzerinden kesit bir genel olarak kurulan ökaryotik sistemlerinde bir tekniktir. Burada biz gömme ve bozulmamış mikrobiyal koloni biyofilmler periosteum parafin balmumu kullanarak kesit fiksasyon için bir yöntem sağlayın. Bu yöntem koloni biyofilmler kullanmak için adapte, agar overlayer ile laminasyon ve her örnek, büyüme substrat olarak muhafaza geliştirilen ve lizin sabitleştirici çözümü eklendi. Bu en iyi duruma getirmeleri örnek saklama ve koruma micromorphological özellikleri geliştirmek. Bu şekilde hazırlanan numune kesit ve ışığı, floresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile düşsel ince mükellef bulunmaktadır. Bu teknik, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisve Vibrio choleraekoloni biyofilmler için başvurdum. Ayrıntı bu yöntemle oluşturulan örneklerinde görünür yüksek düzeyde muhabir gerilme ile birlikte mühendislik veya belirli boya, kullanımı heyecan verici yorumlara fizyolojisi ve mikrobiyal topluluklar gelişimi sağlayabilir.

Introduction

Çoğu mikroplar için formu biyofilmler kapasitesine sahip, hücre toplulukları birlikte kendi ürettiği matrisler tarafından düzenlenen. Biyofilmler fiziksel kurulumları, birçok türde besin ve substrat hükmün çeşitli rejimleri ile yetiştirilen olabilir. Biyofilm oluşumu için belirli deneyleri tekrarlanabilir çok hücreli yapıları verim eğilimi ve ortak mimariler topluluk veya makroskopik düzeyinde filogenetik çeşitli türler için gözlenir. Mikroplar bir atmosfer altında katı ortamdaki koloniler yetiştirilmektedir, makroskopik Morfoloji için matris üretim kapasitesi hakkında bilgi veriyor ve sık sık diğer özellikleri 1,2,3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Mikrobiyal kolonileri iç mimarisini de biyofilm özel kimya ve fizyolojisi ile ilgili ipuçları sağlayabilir ama karakterize için zor olmuştur. Cryoembedding ve cryosectioning teknikleri son uygulamaları bakteri kolonileri için görüntüleme ve görselleştirme benzeri görülmemiş çözünürlük 4,5,6‘ daki belirli özelliklerin etkinleştirdiniz. Ancak, çalışmalar ile hayvan doku parafin gömme cryoembedding 7 ‘ ye göre Morfoloji üstün koruma sağlar ve bakteri doku 8,9görselleştirmek için kullanılan göstermiştir. Bu nedenle bir protokol fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler ince kesit için geliştirdik. Burada, Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biyofilm ince kesitler 10,11hazırlanması anlatacağız ama biz de başarıyla bu teknik bakteriler tarafından kurulan biyofilmler başvuran Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ve Vibrio cholerae12.

İşlemi parafin gömme ve ince kesit biyofilmler için basit bir mantık uygulanabilir. İlk olarak, biyofilmler Morfoloji işleme sırasında korumak için agar tabakası kaplı. İkinci olarak, kaplı biyofilmler bir sabitleştirici crosslink oluştururlar sular altında ve micromorphology korumak. Bunlar, bir daha kutup solvent ile temizlenir, alkol ile sıvı kaybı ve Sıvı parafin balmumu ile sızmış. Sızmış bir kez örnekleri kesit için balmumu bloklara yerleştirilmiştir. Bölümler kesmek, slaytların üzerine monte edilmiş ve sonra onları daha yerel bir duruma döndürmek için rehydrated. Bu noktadan sonra onlar lekeli veya montaj orta mikroskobik analizlerin yapıldığı için kapalı.

Bu iletişim kuralı ince mikrobiyal biyofilmler histolojik analiz için uygun bölümlerini üretir. Bu yöntem kullanılarak hazırlanan ince bölümleri tarafından ışık mikroskobu görüntüsü zaman koloni biyofilm kümelendirilebilir görülebilir. Biyofilmler Ayrıca medya içeren floresan lekesi için bireysel özellikleri belirli yetiştirilen veya hemen önce (adım 9.5-9,6) Montaj rehidrasyon aşamada lekeli. Son olarak, mikroplar floresan proteinler hücre dağıtım veya gen ifade bu topluluklar içinde in situ raporlama sağlayan bir kurucu veya düzenlenmiş moda üretmek için tasarlanmış. Koloni biyofilm derinlik, hücre dağıtım, matris dağılım, büyüme kalıpları ve kronolojik zamanmekansal gen ekspresyonu belirlemek için bu yöntemler kullandık.

Protocol

1. Pseudomonas aeruginosa koloni biyofilmler büyüme Orta-Bilayer plakaları hazırlanması Hazırlamak bir 10 g/L tryptone, 10 g/M agar (bakınız Tablo reçetesi) çözüm deiyonize su. Otoklav 20 dk. 50-60 ° c serin bir su banyosunda. 45 mL agar-tryptone çözeltisi bir 100 x 100 mm kare tabak içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL konik tüp kullanarak. Agar kuvvetlendirmek izin (~ 20-30 dk). İlk katman üzerinde bir ikinci, 15 mL …

Representative Results

Bu yöntem biyofilm ince-neyin farklı Morfolojik özellikleri ve gen ekspresyonu bölgeleri DIC, Floresans mikroskobu ve TEM tarafından yansıması bölümleri oluşturur. DIC görüntüleme 40 X yağı daldırma amacı istimal bazı Morfolojik özellikleri (şekil 2E) göstermek yeterli olabilir, biz o floresan bulduk mikroskobu yapısal ifade floresan protein Mühendisliği suşları sağlar gelişmiş hücre dağıtım örnek (şekil…

Discussion

Parafin gömme ve ince kesit doku örnekleri mikro morfolojik yapılarının görüntüleme sağlar ve ökaryotik dokular üzerinde yaygın olarak kullanılan ve bazı başarı ile mikrobiyal örnekleri8 için uygulanan bir tekniktir klasik histolojik ,9. Cryoembedding endojen ve immünfloresan sinyal güçlü saklamak için izin verirken, Morfoloji16daha iyi koruma sağladığından parafin katıştırma genellikle tercih edilir. Bu yön…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NSF kariyer Ödülü 1553023 ve NIH/NIAID Ödülü R01AI103369 tarafından desteklenmiştir.

Materials

5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).

Play Video

Cite This Article
Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

View Video