Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

आम मन्या धमनी के लिए Jugular नस में टिकाऊ Transgene अभिव्यक्ति का एक खरगोश मॉडल भ्रष्टाचार

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/57231
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Medicine, University of Washington School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस विधि खरगोशों में, भ्रष्टाचारियों के transduction, और टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति की उपलब्धि के स्थान नस भ्रष्टाचारियों की नियुक्ति का वर्णन है । यह transgenes की शारीरिक और रोग भूमिकाओं की जांच और उनके प्रोटीन उत्पादों को भ्रष्टाचारी नसों में, और नस भ्रष्टाचार रोग के लिए जीन उपचार के परीक्षण की अनुमति देता है ।

Abstract

नस भ्रष्टाचार बाईपास सर्जरी पूर्णावरोधक धमनी रोग के लिए एक आम उपचार है; हालांकि, दीर्घकालिक सफलता घनास्त्रता, intimal हाइपरप्लासिया, और atherosclerosis के कारण भ्रष्टाचार की विफलता द्वारा सीमित है । इस अनुच्छेद के लक्ष्य को एक खरगोश में द्विपक्षीय शिरापरक स्थिति भ्रष्टाचारों रखने के लिए एक विधि का प्रदर्शन है, तो एक जीन हस्तांतरण वेक्टर कि टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त के साथ भ्रष्टाचार transducing है । विधि सामान्य नस भ्रष्टाचार homeostasis में जीन की जैविक भूमिकाओं और उनके प्रोटीन उत्पादों की जांच की अनुमति देता है । यह भी गतिविधियों है कि नस भ्रष्टाचार विफलता को रोकने सकता है के लिए transgenes के परीक्षण की अनुमति देता है, उदाहरणके लिए, चाहे एक transgene की अभिव्यक्ति neointimal विकास रोकता है, संवहनी सूजन, कम कर देता है या खरगोशों में atherosclerosis कम हो जाती है खिलाया एक उच्च वसा वाले आहार के साथ । एक प्रारंभिक जीवन रक्षा सर्जरी के दौरान, सही और बाएं बाहरी jugular नस के खंडों और उत्पाद के रूप में रखा गया है द्विपक्षीय अंत के लिए साइड आम मन्या धमनी का किनारा भ्रष्टाचार के रूप में उलट । एक दूसरे अस्तित्व सर्जरी के दौरान, 28 दिनों के बाद प्रदर्शन किया, भ्रष्टाचारियों के प्रत्येक संवहनी क्लिप के साथ संचलन से अलग है और लुमेन (एक arteriotomy के माध्यम से) एक सहायक-निर्भर adenoviral (HDAd) वेक्टर युक्त समाधान के साथ भर रहे हैं । एक 20 मिनट की मशीन के बाद, वेक्टर समाधान aspirated है, arteriotomy की मरंमत की है, और प्रवाह बहाल है । नसों समय व्यक्तिगत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल द्वारा तय बिंदुओं पर काटा जाता है । भ्रष्टाचार के स्थान और transduction के बीच 28 दिन की देरी धमनी परिसंचरण के लिए नस भ्रष्टाचार के अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इस अनुकूलन से पहले या तुरंत भ्रष्टाचार के बाद transduced नस भ्रष्टाचार में होता है कि transgene अभिव्यक्ति की तेजी से नुकसान से बचा जाता है । विधि अपने को भ्रष्टाचारी नसों में टिकाऊ, स्थिर transgene अभिव्यक्ति प्राप्त करने की क्षमता में अद्वितीय है । अंय बड़े जानवर नस भ्रष्टाचार के मॉडल की तुलना में, खरगोश कम लागत और आसान से निपटने के फायदे हैं । कुतर नस भ्रष्टाचार मॉडल की तुलना में, खरगोश बड़ा है और आसान करने के लिए हेरफेर रक्त वाहिकाओं कि विश्लेषण के लिए प्रचुर मात्रा में ऊतक प्रदान करते हैं ।

Introduction

Atherosclerosis एक पुरानी भड़काऊ बीमारी है जिसमें लिपिड संचय और रक्त वाहिका दीवार में सूजन पोत लुमेन के संकुचन के लिए सीसा, दिल के दौरे, स्ट्रोक, और अंगों की हानि1,2. Percutaneous हस्तक्षेप (जैसे, एंजियोप्लास्टी और स्टेंटिंग) और चिकित्सा थेरेपी (जैसे, statins और antiplatelet एजेंटों) atherosclerosis के लिए उपयोगी उपचार कर रहे हैं; हालांकि, वे अक्सर दोनों कोरोनरी और परिधीय संचलन में गंभीर प्रतिरोधी रोग के इलाज में अप्रभावी रहे हैं । बाईपास भ्रष्टाचार, autogenous नस क्षेत्रों का उपयोग, गंभीर, फैलाना कोरोनरी और परिधीय संवहनी रोग3,4के साथ रोगियों के इलाज के लिए एक आम प्रक्रिया बनी हुई है । हालांकि, नस दोनों कोरोनरी और परिधीय संचलनों में रखा भ्रष्टाचार दीर्घकालिक प्रत्यक्षता दरों गरीब है । कोरोनरी संचलन में, नस भ्रष्टाचार के लगभग 10-20% 1 साल में occluded है और ५०% 10 साल5,6से occluded हैं । परिधीय संचलन में, नस भ्रष्टाचार विफलता दर 5 साल7में 30-50% हैं ।

जीन थेरेपी नस भ्रष्टाचार की रोकथाम के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है क्योंकि यह रोग की साइट पर ठीक एक चिकित्सीय जीन उत्पाद उद्धार कर सकते हैं । तदनुसार, कई नैदानिक अध्ययन नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी8,9का परीक्षण किया है । हालांकि, अनिवार्य रूप से इन अध्ययनों के सभी प्रारंभिक समय अंक (2-12 सप्ताह)10,11,12,13,14,15, पर प्रभावकारिता की जांच की है 16 , 17. हम कोई सबूत नहीं है कि जीन चिकित्सा हस्तक्षेप टिकाऊ (वर्ष) देर नस भ्रष्टाचार विफलता है कि आम तौर पर neointimal हाइपरप्लासिया और atherosclerosis4से परिणाम के खिलाफ संरक्षण प्रदान कर सकते है के बारे में पता कर रहे हैं । हम एक तरीका है कि भ्रष्टाचारी नसों में टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति की अनुमति देता है विकसित की है, और इस तरह की अनुमति देता है जीन के परीक्षण-चिकित्सा हस्तक्षेप देर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जल्दी समय अंक । टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, विधि HDAd वैक्टर और एक विलंबित transduction रणनीति शामिल है । HDAd वैक्टर लंबे समय तक transgene अभिव्यक्ति प्रदान क्योंकि वे वायरल जीन की कमी, मांयता (और transduced कोशिकाओं के प्रतिरक्षा प्रणाली18,19,20 द्वारा अस्वीकृति) को रोकने, 21. विलंबित transduction (प्रदर्शन 28 दिनों के बाद भ्रष्टाचार नियुक्ति) arterialization प्रक्रिया के दौरान transduced कोशिकाओं के नुकसान को रोकता है कि जल्दी से22भ्रष्टाचार के बाद होता है ।

नस भ्रष्टाचार की दीवार में चिकित्सीय transgene अभिव्यक्ति को प्राप्त करने वाले अन्य तरीकों में भ्रष्टाचार की नियुक्ति के समय नस भ्रष्टाचार के transduction पर निर्भर10,11,12,15,16 ,17. जब मापा प्रश्नपत्र, transgene अभिव्यक्ति इस दृष्टिकोण का उपयोग कर जल्दी transduction के बाद गिरावट आती है22,23। तदनुसार, इस दृष्टिकोण का उपयोग अध्ययनों से परे प्रभावकारिता की जांच नहीं की है 12 सप्ताह के बाद नस कलम बांधना, के साथ सबसे अधिक प्रभावकारिता का आकलन 4 सप्ताह से परे नहीं. इसके विपरीत, हमारी विधि नस भ्रष्टाचार transgene अभिव्यक्ति है कि कम से कम 24 हफ्तों के लिए छुरा बनी हुई है और इसी तरह की धमनियों में प्रदर्शन किया अध्ययन पर आधारित प्राप्त-संभावना अब तक जारी है22,24। हम कोई अंय नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी हस्तक्षेप है कि इस अवधि के स्थिर transgene अभिव्यक्ति प्राप्त के बारे में पता कर रहे हैं ।

हम एक खरगोश मॉडल इस्तेमाल के लिए हमारी विधि विकसित करना । दूसरों कुतर, खरगोश, या बड़ा जानवरों का उपयोग किया है नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी का परीक्षण10,11,12,15,16,17,25, 26. कुतर मॉडलों की तुलना में, खरगोश अधिक महंगे है और अधिक कठोर विनियामक आवश्यकताओं के अधीन हैं । हालांकि, बड़े जानवरों की तुलना में (जैसे, सूअर और कुत्ते), खरगोशों अभी तक कम खरीद और घर और अधिक आसान संभाल करने के लिए महंगा है । इसके अलावा, खरगोश जहाजों मानव वाहिकाओं शारीरिक रूप से समान27, वे पर्याप्त बड़े है कि वे percutaneous हस्तक्षेप28,29के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और वे पर्याप्त ऊतक प्रदान करते है कि एकाधिक अंतिमबिंदु (जैसे, प्रोटोकॉल, प्रोटीन, आरएनए) एक एकल रक्त वाहिका नमूना22,30का उपयोग कर जांच की जा सकती है । इसके अलावा, जब नस भ्रष्टाचार के साथ खरगोश एक उच्च वसा वाले आहार के साथ खिलाया जाता है, वे नस भ्रष्टाचार atherosclerosis31,३२है, जो कोरोनरी धमनी बाईपास नस भ्रष्टाचार का एक आम कारण है विकसित की विफलता4,5 . इन atherosclerotic खरगोश नस भ्रष्टाचार इस पद्धति के साथ दिया जीन चिकित्सा उपायों के परीक्षण के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में सेवा कर सकते हैं । प्रदान की प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को खरगोश नस भ्रष्टाचार में टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक तकनीकी कौशल मास्टर करने के लिए मदद कर सकते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल और अध्ययन विश्वविद्यालय के वाशिंगटन कार्यालय के पशु कल्याण के द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. पूर्व आपरेशन (सभी सर्जरी के लिए)

  1. Anesthetize खरगोश को paraspinous की मांसपेशियों में इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (आईएम) द्वारा 30 मिलीग्राम/kg ketamine और १.५ मिलीग्राम/kg xylazine के साथ ।
    नोट: सर्जरी से पहले भोजन और पानी प्रतिबंधित नहीं है ।
  2. संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई के लिए प्रतीक्षा करते हुए, तैयारी के कमरे और ऑपरेटिंग कमरे (या) में टेबल की स्थापना की ।
    1. खरगोश की गर्दन और कान (जीवन रक्षा सर्जरी केवल) में नसों (IV) बंदरगाह के स्थान शेविंग के लिए तैयारी कमरे तैयार करते हैं । तैयारी टेबल पर नेत्र मरहम, fentanyl पैच (जीवन रक्षा सर्जरी), बाल कतरनी, शराब तैयारी पैड, 24-जी एक्स ¾ "कैथेटर, इंजेक्शन बंदरगाह, और सर्जिकल टेप रखें ।
    2. में या, निगरानी उपकरण और संबद्ध जांच सेट अप (इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईकेजी), पल्स oximetry (एसपीओ2), और तापमान) । एक 18-g या 19-g सुई के साथ एक १०० मिलीलीटर खारा चतुर्थ बैग के साथ चतुर्थ पंप तैयार करें और प्रवाह की दर के रूप में निर्धारित 10 मिलीलीटर/ एक nosecone (नस भ्रष्टाचार या फसल सर्जरी) के साथ ऑक्सीजन और isoflurane उपकरण सेट करें ।
      1. खरगोश के लिए nosecone सुरक्षित मदद करने के लिए, पाश ट्यूब के आसपास एक धुंध पट्टी कि nosecone को गैस की आपूर्ति. इस पाश ट्यूब जहां यह nosecone को देता है चारों ओर चाहिए । धुंध पट्टी के मुक्त समाप्त होता है दोनों लगभग ४५ सेमी लंबा होना चाहिए । मेज के सिर के अंत पर nosecone (संलग्न धुंध के साथ) रखें ।
    3. घूम पानी और/या या मेज पर मजबूर एयर वार्मिंग कंबल पर बारी । वार्मिंग कंबल पर, एक गर्दन के समर्थन के रूप में एक लुढ़का तौलिया की स्थिति और electrocautery फैलाव इलेक्ट्रोड प्लेट जगह है ।
    4. एक स्थानीय एनाल्जेसिक के रूप में, एक सिरिंज 2% lidocaine एचसीएल के 1 मिलीलीटर और ०.५% bupivacaine एचसीएल के 1 मिलीलीटर में गठबंधन । वांछित एकाग्रता के लिए वायरस पतला (यहाँ, उपयोग 2 x 1011 वायरल कणों/HDAd के लिए एमएल) बाँझ DMEM में और बर्फ पर रखने के लिए (जीन हस्तांतरण सर्जरी केवल).
    5. एक पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई तक पहुंच गया है के बाद, सर्जरी के लिए खरगोश तैयार करते हैं ।
      नोट: पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई सुनिश्चित करने के लिए एक पेडल वापसी पलटा की कमी के लिए परीक्षण. सर्जरी में पैडल पलटा निगरानी जारी रखें ।
      1. खरगोश की आंखों में नेत्र मरहम लागू करें ।
      2. एक गुदा तापमान जांच के स्थान के लिए अनुमति देने के लिए, बस मलाशय से ऊपर दस्ताने उंगलियों के साथ प्रेस और खरगोश मलाशय से मल हटाने के लिए गुदा की ओर उंगलियों को स्थानांतरित.
      3. mandible के किनारे करने के लिए स्टर्नल पायदान से खरगोश दाढ़ी । चतुर्थ स्थान के लिए एक कान दाढ़ी और fentanyl पैचफ्रंटएण्ड प्रशासन के लिए विपरीत कान (केवल जीवन रक्षा सर्जरी) । एसपीओ2 जांच के स्थान के लिए बाएं रियर मध्य पैर की उंगलियों दाढ़ी ।
    6. वेक्टर अर्क सर्जरी के लिए, खरगोश intubate । एक 4 मिमी ओडी/3 मिमी आईडी uncuff endotracheal ट्यूब का प्रयोग करें, एक arthroscope पर लड़ी पिरोया । कड़ी recumbency में खरगोश प्लेस और हाइपर-गर्दन का विस्तार । खरगोश के मुंह को खुला रखें और glottis और स्वरयंत्र परतों की कल्पना करने के लिए arthroscope का उपयोग करें । प्रेरणा के दौरान, धीरे गला के माध्यम से endotracheal ट्यूब डालने और श्वासनली में ।
    7. अस्तित्व सर्जरी के लिए, जगह है और खरगोश के बाएं कान की नस में एक 24 जी चतुर्थ कैथेटर सुरक्षित और एक इंजेक्शन बंदरगाह के साथ यह टोपी । खरगोश के दाहिने कान के लिए एक 25 µ g/h fentanyl पैच लागू करें ।
      नोट: प्रोटोकॉल एक खरगोश के दाईं ओर पर तैनात सर्जन के लिए है । यदि सर्जन खरगोश की बाईं ओर होगा, इस कदम में पक्षों रिवर्स करने के लिए तारों और सर्जन के चतुर्थ विपरीत रखने के लिए । आवश्यकतानुसार भविष्य के चरणों में पक्षों को स्विच करें ।
    8. नस भ्रष्टाचार और फसल सर्जरी के लिए, एक nosecone के साथ सामान्य संज्ञाहरण प्रशासन; वेक्टर अर्क सर्जरी के लिए, एक endotracheal ट्यूब के माध्यम से सामान्य संज्ञाहरण प्रशासन ।
      नोट: इंटुबैषेण सभी सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।  हमारे अनुभव में, तथापि, इंटुबैषेण के दौरान सांस और स्वरयंत्र आघात से जटिलताओं के जोखिम इंटुबैषेण के लाभों पल्ला झुकना कर सकते हैं ।  एक भ्रष्टाचार (विशेष रूप से कोलेस्ट्रॉल खिलाया खरगोशों में) के लिए जीन हस्तांतरण शामिल है कि सर्जरी केवल सर्जरी जिसमें इंटुबैषेण एक शुद्ध लाभ प्रदान करने के लिए लगता है ।
    9. या में खरगोश ले । बस खरगोश के सिर के नीचे तैनात गर्दन का समर्थन तौलिया के साथ ऑपरेटिंग मेज पर एक लापरवाह स्थिति में खरगोश प्लेस । धीरे खरगोश की गर्दन का विस्तार जब तक यह सीधे और लगभग क्षैतिज है ।
    10. खरगोश को nosecone प्लेस (नस भ्रष्टाचार और फसल सर्जरी) या endotracheal ट्यूब कनेक्ट (वेक्टर अर्क सर्जरी) ओ2 के साथ 1 L/मिनट पर, और isoflurane शुरू करते हैं । यदि एक nosecone का उपयोग कर, यह खरगोश गर्दन समर्थन तौलिया के आसपास संलग्न धुंध स्ट्रिप्स के सिरों लपेटकर सुरक्षित । संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा स्तर को बनाए रखने के लिए जरूरत के रूप में isoflurane एकाग्रता (आमतौर पर 1-2%) समायोजित करें ।
    11. केंद्र खरगोश पीठ के तहत electrocautery disperser इलेक्ट्रोड प्लेट । गुदा तापमान जांच डालें और एसपीओ2 जांच और ईकेजी खरगोश को लागू होता है ।
    12. खरगोश के बाएँ कान में कैथेटर बंदरगाह के लिए खारा चतुर्थ रेखा से कनेक्ट और 10 मिलीलीटर में चतुर्थ अर्क पंप शुरू/ 1 ज के बाद, खारा अर्की दर को घटाकर 5 मि. ग्रा./
    13. ढीला है खरगोश के सामने पैर ऑपरेटिंग मेज पर एक संयम के रूप में टाई ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक छोटे से प्लास्टिक की मेज खरगोश पर रखा जा सकता है खरगोश छाती पर दबाव से रोकने के लिए/पेट, और संभावित कारण एसिडिटी भाटा और आकांक्षा ।
    14. lidocaine/bupivacaine (2 मिलीलीटर, 50/50 मिश्रण, चरण 1.2.4) चमड़े की योजना बनाई चीरा लाइन के साथ गर्दन में (वर्ग), स्थानीय संज्ञाहरण के लिए सुई ।
    15. सहायक chlorhexidine gluconate और isopropanol के 3 बारी सफ़ाई के साथ शल्य साइट को संक्रमित है, तो povidone-आयोडीन के साथ साइट स्प्रे । सर्जन हाथ धोने, गाउन, और दस्ताने, अपूतित सिद्धांतों के बाद ।
      1. अपूतित शर्तों के तहत अस्तित्व सर्जरी प्रदर्शन । सहायक किसी भी गैर बाँझ आइटम संभाल, और सर्जन के लिए बाँझ सामग्री aseptically पास या aseptically लिपटी साधन मेज पर उन्हें जगह है.
      2. सर्जन बाँझ तौलिए का उपयोग करने के लिए इस तरह माइक्रोस्कोप के रूप में गैर बाँझ उपकरणों में हेरफेर aseptically । सर्जरी के पहले आधे प्रदर्शन करते हुए सर्जन 2x सर्जिकल loupes पहनते हैं ।

2. नस भ्रष्टाचार सर्जरी (अस्तित्व)

  1. उपकरणों और बाँझ क्षेत्र तैयार करते हैं ।
    1. सहायक खुले बाँझ पैक (एक टेबल कपड़ा, एक कागज कपड़ा, और 6 तौलिए) और aseptically सर्जन के लिए सामग्री हस्तांतरण है ।
    2. साधन तालिका कपड़ा । लिपटी साधन मेज पर कागज कपड़े और बाँझ तौलिए प्लेस । 4 तौलिए के साथ, खरगोश कपड़े, केवल गर्दन उजागर पर शल्य साइट छोड़ने । खरगोश पर कागजी कपड़ा रखना । एक तौलिया बाद में इस्तेमाल किया जाएगा, और पिछले एक बैकअप है ।
    3. सहायक निष्फल साधन पैक खोलने के लिए और aseptically सर्जन के लिए साधन ट्रे पास । इंस्ट्रूमेंट टेबल पर यंत्रों की व्यवस्था करें ।
    4. सहायक निम्नलिखित उपकरण खुला है और aseptically या तो यह सर्जन के पास या यह साधन मेज पर जगह: एक 1 मिलीलीटर सिरिंज, एक 3 मिलीलीटर सिरिंज, १ २०-एमएल सिरिंज, १ २१ जी सुई, 3-0 polyglycolic एसिड (पीजीए) टांका, 5-0 पीजीए टांका , 7-0 के टांके, और १ २४ ग्राम आईवी कैथेटर ।
    5. खरगोश को कवर कपड़े के लिए electrocautery केबल सुरक्षित, एक ७.२५ "Kantrowitz संदंश का उपयोग कर । electrosurgery इकाई से कनेक्ट और सहायक द्वारा चालू करने के लिए आपरेटिंग तालिका के किनारे पर केबल का प्लग एंड ड्रॉप करें ।
    6. एक 20 मिलीलीटर एक खारा बैग या सहायक द्वारा आयोजित की शीशी से बाँझ खारा के साथ सिरिंज भरें । इस खारा प्रयोग के रूप में आपरेशन के दौरान उजागर ऊतक के निर्जलीकरण को रोकने की जरूरत है ।
    7. एक छोटी सी शल्य कटोरी में ५,००० IU/एमएल हेपरिन के 5 मिलीलीटर खारा समाधान, यानी, १०० IU हेपरिन/एमएल के ०.१ मिलीलीटर जोड़कर heparinized शारीरिक खारा समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करें । मन्या धमनी और नस भ्रष्टाचार निरोधक प्रक्रिया के दौरान नियमित रूप से फ्लश करने के लिए इस समाधान का उपयोग करें ।
    8. खरगोश की गर्दन पर शल्य साइट पर कागज के कपड़े में एक छेद में कटौती । उपयोग तौलिया clamps के लिए जगह में निहित तौलिए को छेद के कोनों दबाना ।
  2. संवहनी विच्छेदन
    नोट: उपयोग 2x शल्य चिकित्सा loupes सर्जरी के इस हिस्से के साथ सहायता के लिए ।
    1. स्टर्नल पायदान और mandible के बीच midline साथ electrocautery के साथ त्वचा में कटौती (लंबाई में लगभग 7-9 सेमी) और तौलिया clamps के साथ तौलिए को खरगोश की गर्दन त्वचा दबाना । caudal अंत में, electrocautery के साथ प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा पार्श्व कट बनाओ । बड़ी कैंची का उपयोग कर पूरे midline साथ प्रावरणी के तहत कुंद काटना । electrocautery के साथ midline के साथ विच्छेदित fascial परत के माध्यम से काटें ।
    2. दाईं ओर प्रारंभ करें । sternohyoid मांसपेशी के बीच काटना श्वासनली और वी के आकार sternocephalic मांसपेशी, आम मन्या धमनी को बेनकाब करने के लिए ।
    3. ध्यान से आम मन्या धमनी के 4-5 सेमी खंड काटना और इसकी बड़ी शाखाओं (आम तौर पर 1-2 प्रति पक्ष) आसपास के ऊतकों से मुक्त. ग्रसनी तंत्रिका विलम्ब के पार करने के लिए समीपस्थ गर्दन के आधार से विच्छेदन का विस्तार । विच्छेदन के दौरान मन्या धमनी के पुनर्कर्षण में सहायता करने के लिए सर्जिकल सिलिकॉन छोरों का उपयोग करें. Ligate प्रत्येक शाखा के काटने से पहले 5-0 रेशम टांके के साथ आम मन्या धमनी की बड़ी शाखाओं का विलम्ब ।
      नोट: आम मन्या धमनी, या धमनी पर पार कि छोटे नसों समानताएं कि vagus तंत्रिका परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना.
    4. बाईं ओर (step 2.2.3) पर विच्छेदन दोहराएं ।
    5. चमड़े के नीचे ऊतक परत को अस्थाई रूप से बंद करने के लिए ऊतक-होल्डिंग संदंश का प्रयोग करें । बाहरी jugular नस उजागर होने तक दायीं ओर त्वचा से सतही प्रावरणी को काटना । काटना बाहरी jugular नस की एक 4-5 सेमी खंड और आसपास के ऊतकों से अपनी शाखाओं को मुक्त, शाखा काटने से पहले 5-0 रेशम टांके के साथ छोटी शाखाओं ligating ।
    6. बाईं ओर (step 2.2.5) पर विच्छेदन दोहराएं ।
    7. हेपरिन (१५० IU/किग्रा) आईवी कैथेटर में इंजेक्ट करें और खारा के 10 मिलीलीटर के साथ फ्लश ।
    8. सही पक्ष पर बाहरी jugular नस की एक 3 सेमी खंड को मापने और 5-0 रेशम सीवन के साथ इस खंड के caudal अंत ligate । नस को खून से भरने की अनुमति दें, फिर शिरा सेगमेंट के कपाल अंत ligate. बाहरी jugular नस खंड के कपाल अंत विभाजित, ध्यान से heparinized सामांय खारा के साथ पोत फ्लश (१०० U/एमएल) एक 3 एमएल एक 24-जी चतुर्थ कैथेटर से जुड़ी सिरिंज का उपयोग कर । अपने caudal अंत में नस खंड विभाजित । शिरा सेगमेंट को मानकीकृत स्थिति में रखें, जिसमें caudal और कपालीय छोर स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य हों.
  3. नस भ्रष्टाचार
    1. सहायक शल्य loupes सर्जन से हटाने और शल्य माइक्रोस्कोप (25X) की स्थिति में ले जाने के लिए ।
      नोट: सर्जन माइक्रोस्कोप पर एक बाँझ तौलिया कपड़े चाहिए. इस सर्जन को बाँझ बनाए रखते हुए माइक्रोस्कोप में हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है ।
    2. छोटी-clamps के साथ अलग खंड के प्रत्येक छोर पर सही आम मन्या धमनी दबाना, कपाल दबाना पहले धमनी भरने के लिए अनुमति देने के लिए, तो caudal दबाना रखने.
    3. कड़ी कागज के एक 1 × 2 सेमी टुकड़ा काट (बाँझ टांका पैकेजिंग से उपलब्ध है) और यह आम मन्या धमनी के नीचे जगह है, जोखिम में सुधार करने के लिए.
    4. एक arteriotomy बस caudal दबाना (caudal arteriotomy) को कपाल प्रदर्शन । arteriotomy लंबाई शिरा खंड के कपाल अंत के व्यास के बराबर होना चाहिए । caudal arteriotomy के माध्यम से चतुर्थ कैथेटर के साथ सिरिंज डालें और heparinized सामान्य खारा के साथ मन्या धमनी लुमेन फ्लश.
    5. caudal arteriotomy के लिए नस के कपाल अंत टांका, एकल टांके के साथ 7-0 के टांके (चित्रा 1) का उपयोग कर ।
      1. caudal arteriotomy के caudal अंत को शिरा खंड के कपालीय छोर तक टांका लगाने के लिए पहले टांके लगाएं । पहली सिलाई से दूसरे टांका १८० ° प्लेस, नस खंड के कपाल अंत करने के लिए caudal arteriotomy के कपाल अंत टांका ।
      2. पहले दो टांके से एक बिंदु equidistant पर तीसरी सिलाई प्लेस, सम्मिलन के पार्श्व पक्ष पर । सम्मिलन के औसत दर्जे का पक्ष पर चौथी सिलाई प्लेस, पहले दो टांके से equidistant और तीसरा टांका से भर । 1-4 टांके से प्रत्येक के बीच 4 अतिरिक्त टांके (5-8 टांके) प्लेस ।
      3. कपालीय क्लिप के caudal ओर कपाल arteriotomy का प्रदर्शन करें. कपाल arteriotomy के कपालीय छोर और caudal arteriotomy के caudal छोर के बीच की दूरी शिरा खंड की लंबाई के समान होनी चाहिए. कपाल arteriotomy की लम्बाई शिरा खंड के caudal छोर के व्यास के बराबर होती है.
    6. सम्मिलन से शिरा कपाल विस्तार, मन्या के शीर्ष पर बिछाने, किसी भी twists शुरू करने के बिना. मन्या धमनी और नस heparinized सामांय खारा के साथ कपाल arteriotomy के माध्यम से फ्लश । खारा धमनी के माध्यम से प्रवाह होगा, caudal सम्मिलन के माध्यम से नस में और नस के स्वतंत्र और unsuture अंत से बाहर निकल जाएगा । नस निस्तब्धता भी इसे घुमा से रोकता है ।
    7. शिराओं के caudal अंत को कपाल arteriotomy में टांका (चित्रा १).
      1. शिरा खंड के caudal अंत तक कपाल arteriotomy के caudal अंत में टांके लगाने के लिए एक पहली सिलाई रखें । शिरा खंड के caudal अंत तक कपाल arteriotomy के कपालीय छोर को टांके लगाने के लिए एक दूसरी टांकी लगाएं । चरण 2.3.5.2 में बताए अनुसार सम्मिलन पूर्ण करें । बस से पहले पिछले गांठ कपाल सम्मिलन पर बंधा हुआ है, संक्षेप में विच्छेदित आम मन्या धमनी खंड के कपाल अंत पर दबाना खोलने के लिए, वापस खून बह रहा है कि मन्या धमनी और भ्रष्टाचार नस में हवा बाहर बहाकर अनुमति देते हैं । फिर, अंतिम गाँठ कस लें ।
    8. नस भ्रष्टाचार खून से भरने और फिर caudal दबाना जारी अनुमति देने के लिए कपाल दबाना छोड़ें । तेज स्पंदन नस भ्रष्टाचार में देखा जाना चाहिए । anastomoses पर किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए सूखी धुंध के साथ कोमल दबाव लागू करें ।
    9. Ligate आम मन्या धमनी खंड के दोनों सिरों कि एक 3-0 रेशम टांका के साथ anastomoses जोड़ता है और मन्या आधे रास्ते के बीच लिगेचर्स (चित्रा 1) विभाजित. मन्या धमनी के बगल में प्रत्येक सम्मिलन के लिए papaverine (३.५ मिलीग्राम/एमएल) की कई बूंदें लागू करें ।
    10. कान आईवी कैथेटर में हेपरिन (७५ IU/किग्रा) इंजेक्ट करें और खारा के 10 मिलीलीटर के साथ फ्लश । इस समय, सुई buprenorphine (वर्ग, ०.०२ मिलीग्राम/) पश्चात analgesia प्रदान करने के लिए जब तक fentanyl पैच fentanyl की एनाल्जेसिक प्लाज्मा स्तर प्रदान की गई है ।
      नोट: एक अतिरिक्त buprenorphine इंजेक्शन (वर्ग, ०.०२ मिलीग्राम/kg) पहले इंजेक्शन के बाद analgesia बनाए रखने के लिए आवश्यक 6 ज हो सकता है जब तक प्लाज्मा fentanyl एक चिकित्सीय एकाग्रता तक पहुंचता है ।
    11. दोहराएं वाम पक्ष पर भ्रष्टाचार (कदम 2.2.8, 2.3.2-2.3.9) ।
    12. 5-0 पीजीए सीवन एक सतत पैटर्न का उपयोग कर के साथ चमड़े के नीचे ऊतक बंद करो । 3-0 पीजीए सीवन एक intradermal पैटर्न का उपयोग कर के साथ त्वचा को बंद करें । दोनों सिरों पर गाँठ गाड़.
  4. पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी, सफ़ाई और देखभाल
    नोट: खरगोश एक शांत, शांत वातावरण में संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति देते हैं । उचित ऑक्सीजन और शरीर के तापमान के लिए लगातार खरगोश की निगरानी जब तक यह पूरी तरह से बरामद किया है ।
    1. isoflurane और ऑक्सीजन बंद करें और खरगोश से संज्ञाहरण मशीन को डिस्कनेक्ट कर दें । खरगोश से चतुर्थ द्रव टयूबिंग डिस्कनेक्ट करें, लेकिन आकस्मिक पहुँच के लिए कान की नस में चतुर्थ बंदरगाह छोड़ दें ।
    2. एक वसूली पिंजरे के लिए खरगोश परिवहन और अपनी तरफ जगह है । एक गर्म पानी कंबल (या मजबूर-एयर वार्मिंग) के साथ थर्मल समर्थन प्रदान करते हैं । जब तक एसपीओ2 स्थिर है nosecone करके ओ2 दे ।
    3. जब तक खरगोश बैठ सकते है और इसके पिंजरे में ambulate, अपनी दूसरी तरफ खरगोश फ्लिप हर 15 मिनट । इसके बाद कान के चतुर्थ प्रवेशनी को निकालकर खरगोश को उसके पिंजरे में वापस कर दें । यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद होने के बाद ही अन्य जानवरों की कंपनी के लिए खरगोश लौटें ।
    4. किसी भी अपशिष्ट के निपटान के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के बाद के लिए खतरा है और sharps अपशिष्ट निपटान ।
    5. पश्चात, खरगोश के स्वास्थ्य और शल्य चिकित्सा घाव प्रत्येक दिन की जाँच करें । प्रशासन buprenorphine के रूप में दर्द fentanyl पैच द्वारा प्रबंधित नहीं की जरूरत है । पोस्ट-ऑपरेटिव दिवस 3 पर fentanyl पैच को हटा दें ।

3. Transcutaneous अल्ट्रासाउंड

  1. भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता का आकलन करने के लिए, गैर anesthetized खरगोश पर अल्ट्रासाउंड परीक्षा प्रदर्शन 5-7 दिन नस-भ्रष्टाचार सर्जरी और जीन-हस्तांतरण सर्जरी के बाद ।
    1. लपेट गैर anesthetized खरगोश सुरक्षित रूप से एक कंबल में और जगह खरगोश लापरवाह एक पशु चिकित्सा V-गर्त में अपनी गर्दन के साथ विस्तारित । गर्दन दाढ़ी, या यदि आवश्यक हो, एक लोमनाशक एजेंट के साथ बालों को हटा दें । गर्दन पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें और एक अल्ट्रासाउंड परीक्षा प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: एक अल्ट्रासाउंड परीक्षा भी anesthetized खरगोशों दोनों जीन हस्तांतरण सर्जरी और टर्मिनल भ्रष्टाचार फसल सर्जरी के समय में भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता की जांच करने के लिए और भ्रष्टाचार लुमेन व्यास को मापने के लिए किया जाता है । परीक्षा बस झाड़ी से पहले किया जाता है और गैर anesthetized खरगोशों के लिए के रूप में एक समान तरीके से किया जाता है ।

4. जीन हस्तांतरण सर्जरी प्रदर्शन ~ 28 दिनों के बाद भ्रष्टाचार प्लेसमेंट (जीवन रक्षा सर्जरी)

  1. उपकरणों और बाँझ क्षेत्र तैयार करते हैं ।
    1. कदम 2.1.1-2.1.3 का पालन करें । नस भ्रष्टाचार सर्जरी में ।
    2. सहायक निम्नलिखित उपकरणों को खोलने और या तो aseptically सर्जन के पास या यह साधन मेज पर जगह: छह 1 एमएल सिरिंज (सुई के साथ), एक 3 एमएल सिरिंज, १ २०-एमएल सिरिंज, १ २१ जी सुई, १ १९-जी सुई, 3-0 पीजीए टांका , 5-0 पीजीए टांक, 7-0 के टांके, २ २४ ग्राम चतुर्थ कैथेटर, और एक बाँझ रक्त प्रवाह जांच ।
    3. चरणों का पालन करें 2.1.5-2.1.6 । नस भ्रष्टाचार सर्जरी में ।
    4. एक 1 एमएल सिरिंज धमनी और नस भ्रष्टाचार धोने के लिए 1 मिलीलीटर DMEM के साथ तैयार है और दो 1-एमएल-वायरस समाधान (~ 0.5-0.7 मिलीलीटर वायरस समाधान/नस भ्रष्टाचार) के साथ सीरिंज तैयार करते हैं । सहायक वायरस को गल जाने दें और उसे DMEM में पतला करें । lidocaine/bupivacaine (50/50 मिक्स, स्टेप 1.2.4) की ०.५ एमएल के साथ एक 3 एमएल सिरिंज तैयार करें ।
    5. नस भ्रष्टाचार सर्जरी में कदम 2.1.8 का पालन करें ।
  2. नस भ्रष्टाचार और आसंन मन्या धमनियों का अलगाव
    नोट: इस भाग के लिए 2x सर्जिकल loupes इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    1. स्टर्नल पायदान और mandible के बीच midline साथ electrocautery के साथ त्वचा में कटौती (लंबाई में लगभग 7-9 सेमी) और तौलिया clamps के साथ खुला त्वचा दबाना । lidocaine/bupivacaine (50/50 मिश्रण, चरण 1.2.4) के ०.५ मिलीलीटर चमड़े के नीचे ऊतक के लिए लागू होते हैं ।
    2. caudal अंत में, electrocautery के साथ प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा पार्श्व कट बनाओ । पूरी midline के साथ प्रावरणी के नीचे कुंद काटना । electrocautery के साथ, midline के साथ प्रावरणी के माध्यम से काटा ।
    3. दाईं ओर प्रारंभ करें । नस भ्रष्टाचार का पर्दाफाश करने के लिए, श्वासनली और वी के आकार का sternocephalic मांसपेशी ओवरले sternohyoid मांसपेशी के बीच काटना । सावधानी से नस भ्रष्टाचार और दोनों कपाल और caudal पक्षों पर भ्रष्टाचार के निकटवर्ती मन्या धमनी की 1.5-2.0 सेमी को अलग ।
    4. चरण 4.2.3 के बाद बाईं ओर विच्छेदन दोहराएँ ।
  3. नस भ्रष्टाचार में रक्त के प्रवाह को मापने ।
    1. सामांय खारा के साथ सही पक्ष पर शल्य घाव गुहा को भरने के लिए ध्वनि तरंगों के संचरण को सक्षम करें । घाव गुहा में खारा में एक 2 मिमी perivascular प्रवाह जांच (एक खंड प्रवाह मीटर से जुड़ा) विसर्जित कर दिया और शूंय करने के लिए प्रवाह की दर निर्धारित किया है ।
    2. इस नस भ्रष्टाचार के लिए मन्या धमनी caudal या कपाल के चारों ओर प्रवाह जांच रखें । एक इलेक्ट्रॉनिक डेटा अधिग्रहण प्रणाली के साथ प्रवाह जांच से डेटा रिकॉर्ड ।
    3. चरण 4.3.2 के बाद बाईं ओर प्रवाह माप दोहराएँ ।
    4. पीक सिस्टोलिक प्रवाह दर, न्यूनतम डायस्टोलिक प्रवाह दर, और माध्य प्रवाह दर के आधार पर pulsatility परिकलित करें । इसके अलावा, प्रवाह दर और लुमेन व्यास (transcutaneous अल्ट्रासाउंड के साथ मापा) के आधार पर लामिना कतरनी तनाव की गणना ।
  4. नस भ्रष्टाचार में वेक्टर समाधान संचार
    नोट: एक शल्य माइक्रोस्कोप (16X) puncturing, अर्क, और मन्या धमनी की मरंमत के लिए आवश्यक के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
    1. सहायक सर्जन की शल्य चिकित्सा loupes को दूर करने और स्थिति में शल्य माइक्रोस्कोप कदम है । सर्जन खुर्दबीन पर एक बाँझ तौलिया कपड़े है । बाँझ तौलिया सर्जन माइक्रोस्कोप में हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है, जबकि बाँझ बनाए रखने.
    2. सहायक हेपरिन (१५० IU/किग्रा) चतुर्थ कैथेटर में इंजेक्ट करें और खारा के साथ फ्लश ।
    3. बस बेवल के ऊपर लगभग ८० ° करने के लिए 21 जी सुई मोड़ करने के लिए एक बड़ी सुई चालक का प्रयोग करें (बेवल मोड़ नहीं; चित्र 2a) ।
    4. मिनी clamps के साथ नस भ्रष्टाचार के प्रत्येक छोर पर आम मन्या धमनी दबाना, कपाल दबाना पहले धमनी भरने के लिए अनुमति देने के लिए, तो caudal क्लिप रखने. caudal क्लिप लगभग 10 मिमी caudal सम्मिलन करने के लिए जगह है, arteriotomy के लिए कुछ कमरे में छोड़ दें ।
    5. धमनी के आसपास दो रेशम संबंध रखो सिर्फ भ्रष्टाचार के लिए caudal और उंहें कस के बिना एक पर एक भी हाथ गांठ टाई ।
    6. caudal नाड़ी क्लिप की बस कपाल तुला 21 जी सुई के साथ भ्रष्टाचार के लिए मन्या caudal पंचर. पीठ या बाजू की दीवारों को पंक्चर न करने के लिए सावधानी बरतें । वापस लुमेन में सुई अग्रिम-और आगे दो बार यह सुनिश्चित करें कि लुमेन स्पष्ट है, तो ध्यान से सुई वापस ले लो ।
      नोट: आम मन्या पंचर ठीक संदंश के साथ धमनी adventitia लोभी द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है और धीरे सामने की दीवार उठाने, जबकि सुई की नोक डालने सिर्फ लिफ्ट बिंदु करने के लिए caudal (चित्रा 2ए) । इससे सुई के साथ पीछे की दीवार से टकराने का खतरा कम हो जाता है ।
    7. कई सामने धुंध पैड के साथ, सुई लेनी के लिए इस्तेमाल किया सिरिंज जगह करने के लिए एक घोंसला बनाने. इस धुंध घोंसला caudal शल्य साइट पर रखें ।
    8. केवल DMEM के साथ सिरिंज पर एक 24 जी IV-कैथेटर रखो और बस रिसाव को रोकने के लिए पर्याप्त सिरिंज पर कैथेटर कस (सिरिंज हो जाएगा इस सर्जरी में बाद में हटा दिया) और यह जारी है के बाद इस मोड़ के बारे में ७५ डिग्री पर रखती है कि इतना टिप से कैथेटर ~ 4 मिमी मोड़ ।
    9. आम मन्या में चतुर्थ कैथेटर डालें मोड़ बिंदु तक arteriotomy और नस भ्रष्टाचार लुमेन DMEM के ०.५ मिलीलीटर के साथ दो बार धो. प्रत्येक पुनरावृत्ति के लिए, DMEM के साथ नस भ्रष्टाचार भरें । फिर भ्रष्टाचार के कपाल के छोर पर एक दस्ताने वाली उँगली से हल्के से दबाकर DMEM को भ्रष्टाचार से हटा दें. ध्यान से भ्रष्टाचार के caudal अंत की ओर उंगली स्लाइड करने के लिए arteriotomy के माध्यम से बाहर चमकदार सामग्री फ्लश ।
    10. कैथेटर से DMEM सिरिंज निकालें, पोत में कैथेटर छोड़ने. वायरस समाधान युक्त सिरिंज कनेक्ट, यकीन है कि कोई हवा कैथेटर में प्रवेश कर रही है । वे कैथेटर टिप के आसपास हैं, जब तक शिथिलता knotted रेशम संबंधों नीचे ले जाएँ, लेकिन उन्हें कस नहीं है ।
    11. वायरस समाधान के ०.०३ मिलीलीटर संचार कैथेटर से बाहर शेष DMEM धक्का । एक उंगली के साथ नस भ्रष्टाचार लुमेन से सभी द्रव निकालें, caudal के लिए धीरे से कपाल से दबाकर ।
    12. दो धमनियों के आसपास संबंधों को मजबूत और कैथेटर सील करने के लिए टिप । वायरस समाधान को भ्रमित जब तक नस का इरादा नहीं है । धीरे से धुंध के घोंसले पर सिरिंज करना ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि नस भ्रष्टाचार अपने पूर्व transduction कैलिबर के लिए फैलता है और वायरस अर्क के दौरान फुलाया रहता है । यदि नहीं, तो जीन अंतरण की मात्रा में काफी कमी आएगी.
    13. छोड़ वायरस-नस में समाधान 20 मिनट के लिए भ्रष्टाचार लुमेन, और फिर एक खाली सिरिंज के साथ कैथेटर से जुड़ी वायरस युक्त सिरिंज की जगह. धीरे महाप्राण जब तक भ्रष्टाचार से वायरस युक्त समाधान पोत गिर । सिरिंज निकालें, जगह में कैथेटर छोड़. रेशमी टांकों को काट कर खोल और कैथेटर को पोत से निकाल लें । endothelium को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ध्यान से मन्या धमनी से कैथेटर निकालें ।
    14. सर्जिकल माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, एक एक्स पैटर्न (चित्रा 2बी) का उपयोग 7-0 के साथ arteriotomy बंद टांका ।
      1. एक सुई धारक के साथ सीवन समझ, arteriotomy के नीचे सही पर पोत दर्ज करें, और नीचे छोड़ दिया पर पोत से बाहर निकलें । पोत के बाहर खुलने को पार करें और ऊपर-दाएं से ऊपर-बाएं से दूसरी पास करें ।
      2. टांका कसने से पहले, संक्षेप में कपाल संवहनी क्लिप जारी करने के लिए हवा और नस भ्रष्टाचार और धमनी से अवशिष्ट वायरस फ्लश । रक्त arteriotomy से बाहर प्रवाह होगा जब दबाना जारी है ।
      3. धीरे से सीवन खींच द्वारा arteriotomy बंद करो समाप्त होता है और उंहें 2 वर्ग समुद्री मील के साथ एक साथ टाई ।
        नोट: सीवन खींच भी तंग ऊतक जो प्रवाह परेशान, घनास्त्रता जोखिम में वृद्धि होगी के गुच्छन का कारण होगा, और संभावित अनियंत्रित चर परिचय ।
    15. कपाल संवहनी क्लिप रिलीज, तो caudal क्लिप । हल्का दबाव लागू करने के लिए धुंध का उपयोग करके किसी भी रक्तस्राव बंद करो ।
    16. इस समय के आसपास, सुई buprenorphine (वर्ग, ०.०२ मिलीग्राम/) पश्चात analgesia प्रदान करने के लिए जब तक fentanyl पैच एनाल्जेसिक fentanyl प्लाज्मा स्तर प्रदान की गई है ।
      नोट: एक अतिरिक्त buprenorphine इंजेक्शन (वर्ग, ०.०२ मिलीग्राम/kg) पहले इंजेक्शन के बाद analgesia बनाए रखने के लिए आवश्यक 6 ज हो सकता है जब तक प्लाज्मा fentanyl एक चिकित्सीय एकाग्रता तक पहुंचता है ।
    17. वायरस अर्क प्रोटोकॉल को बाईं ओर दोहराएं, चरण 4.4.5-4.4.15 के बाद ।
  5. घाव बंद
    1. 5-0 पीजीए सीवन के साथ चमड़े के नीचे ऊतक बंद, एक सतत पैटर्न का उपयोग कर । 3-0 पीजीए सीवन एक intradermal पैटर्न का उपयोग कर के साथ त्वचा को बंद करें । दोनों सिरों पर गाँठ गाड़.
  6. पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी, सफ़ाई और देखभाल
    1. चरण २.४ का पालन करें ।

5. हार्वेस्ट सर्जरी (टर्मिनल)

  1. उपकरणों और शल्य साइट तैयार करते हैं ।
    1. चरणों का पालन करें 2.1.1-नस भ्रष्टाचार सर्जरी में 2.1.3 ।
    2. सहायक खुला और साधन मेज पर aseptically जगह (या सर्जन के पास): १ २०-एमएल सिरिंज, एक 21G सुई, 3-0 रेशम सीवन, और एक बाँझ रक्त प्रवाह जांच करते हैं ।
    3. चरणों का पालन करें 2.1.5-2.1.6 और 2.1.8 नस भ्रष्टाचार सर्जरी ।
  2. आम मन्या धमनियों और नस भ्रष्टाचार के अलगाव
    1. स्टर्नल पायदान और mandible के बीच midline साथ electrocautery के साथ त्वचा में कटौती (लंबाई में लगभग 7-9 सेमी) और तौलिया clamps के साथ तौलिए को खरगोश की गर्दन त्वचा दबाना ।
    2. caudal अंत में, electrocautery के साथ प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा पार्श्व कट बनाओ । पूरी midline के साथ प्रावरणी के नीचे कुंद काटना । electrocautery के साथ midline के साथ विच्छेदित प्रावरणी के माध्यम से काटें ।
    3. दाईं ओर प्रारंभ करें । sternohyoid मांसपेशी के बीच काटना श्वासनली और वी के आकार sternocephalic मांसपेशियों को आम मन्या और नस भ्रष्टाचार बेनकाब करने के लिए ।
    4. काटना सही नस भ्रष्टाचार और आम मन्या धमनी के आसपास के ऊतकों से मुक्त. विच्छेदन के दौरान धमनी और नस भ्रष्टाचार के कर्षण के लिए सर्जिकल सिलिकॉन छोरों का प्रयोग करें ।
    5. चरण 5.2.3-5.2.4 के बाद बाईं ओर विच्छेदन दोहराएँ ।
  3. कदम के बाद प्रवाह माप बनाओ जीन हस्तांतरण सर्जरी में 4.3.1-4.3.3 ।
  4. नस भ्रष्टाचार की फसल
    1. 3-0 रेशम सीवन के साथ, ligate सही आम मन्या धमनी कपाल भ्रष्टाचार करने के लिए. फिर ligate ने मन्या caudal को भ्रष्टाचारी.
    2. एक्साइज ligations और अगल-बगल के सम्मिलन के बीच सटे मन्या धमनी को विभाजित करके सही नस भ्रष्टाचार । खरगोश से नस भ्रष्टाचार निकालें और खारा के साथ लुमेन फ्लश ।
    3. मन्या धमनी और नस भ्रष्टाचार के दोनों सिरों से anastomoses ट्रिम कर दीजिए । दूर नस भ्रष्टाचार से अतिरिक्त adventitial ऊतक ट्रिम और विभिंन समापन बिंदु विश्लेषण के लिए जरूरत के रूप में क्षेत्रों में भ्रष्टाचार में कटौती ।
    4. वाम नस भ्रष्टाचार को दोहराते हुए कदम 5.4.1-5.4.3.
  5. फ़िनाइटोइन/pentobarbital IV के खरगोश को euthanize करने के लिए 1 मिलीलीटर इंजेक्ट करें ।
  6. किसी भी अपशिष्ट के निपटान के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के बाद के लिए खतरा है और sharps अपशिष्ट निपटान ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ऑपरेटर इस पद्धति का उपयोग प्रयोगात्मक डेटा जनरेट करने के लिए कर सकते हैं इससे पहले कि एक नया ऑपरेटर की तकनीकी दक्षता मान्य होना चाहिए । पहले मील का पत्थर है कि एक नया ऑपरेटर प्राप्त करना चाहिए संगत नस भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता दोनों प्रारंभिक नस-भ्रष्टाचार सर्जरी और बाद में देरी-transduction सर्जरी के बाद है । सर्जरी के प्रत्येक के बाद ९०% प्रत्यक्षता से अधिक वांछनीय और प्राप्त है । प्रत्यक्षता गैर इनवेसिव transcutaneous अल्ट्रासाउंड, जो हम आमतौर पर पश्चात दिन 5-7 पर प्रदर्शन का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । पेटेंट नसों के साथ खरगोशों में, अल्ट्रासाउंड परीक्षा पूर्वकाल गर्दन के दोनों किनारों पर तेज caudal-कपाल रक्त प्रवाह के साथ एक बड़ी रक्त वाहिका प्रकट होगा (चित्रा 3ए) । यदि या तो शिरा भ्रष्टाचारियों का occluded है, तो occluded भ्रष्टाचार के साथ साइड (ओं) पर कोई जासूसी caudal-कपाल रक्त प्रवाह हो जाएगा. हालांकि, कपाल-से-caudal रक्त प्रवाह अभी भी आंतरिक jugular नस (चित्रा 3बी) में पता लगाया जाएगा ।

दूसरा मील का पत्थर है कि एक नए ऑपरेटर को प्राप्त करना चाहिए नस के कुशल transduction-भ्रष्टाचार endothelial कोशिकाओं है । यहां, एक adenoviral वेक्टर कि β-galactosidase व्यक्त endothelial जीन हस्तांतरण की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हमारी प्रयोगशाला transduced नस में एक नया ऑपरेटर एक एडीनोवायरस व्यक्त β-galactosidase (AdnLacZ) तरीकों का उपयोग कर के साथ भ्रष्टाचार । भ्रष्टाचारियों को transduction के 3 दिन बाद काटा गया और प्रखंडों में काट दिया गया । कुछ खंडों 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (एक्स-gal) के साथ दाग थे । En चमकदार सतहों के चेहरे इमेजिंग कुशल transduction (चित्रा 4ए) और गरीब transduction (चित्रा 4बी) के साथ नस भ्रष्टाचार दिखाया । आगे एक नए ऑपरेटर की प्रवीणता का मूल्यांकन करने के लिए, transduced नस भ्रष्टाचार के अर्क में β-galactosidase mRNA भी मात्रात्मक रिवर्स transcriptase-मध्यस्थता पीसीआर का उपयोग कर मापा जाता है और glyceraldehyde फॉस्फेट के स्तर के लिए संकेत को सामान्य डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) ही नस भ्रष्टाचारियों में mRNA मापी जाती है.

नए ऑपरेटर द्वारा transduced नस भ्रष्टाचार में β-galactosidase mRNA का स्तर एक अनुभवी ऑपरेटर द्वारा mRNA नस भ्रष्टाचार में β-galactosidase transduced के स्तर से काफी अलग नहीं थे (चित्रा 5). एक अनुभवी ऑपरेटर द्वारा transduced नस भ्रष्टाचार से mRNA नमूने तुलना के लिए उपलब्ध नहीं हैं, नकारात्मक नियंत्रण नस भ्रष्टाचार mRNA एक गैर व्यक्त नियंत्रण वेक्टर (AdNull) के साथ transducing नस भ्रष्टाचार द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है । हमने पाया है कि एक अनुभवी ऑपरेटर द्वारा transduced नस में β-galactosidase mRNA का मतलब स्तर लगभग १,०००-से उच्च गुना है β-galactosidase mRNA में मापा AdNull-transduced भ्रष्टाचार (चित्रा 5) के लिए पृष्ठभूमि पीसीआर सिग्नल की तुलना में अधिक .

Figure 1
चित्रा 1 . अंत करने वाली पक्ष anastomoses के साथ एक उलट सही बाहरी jugular नस-से-दाएँ आम मन्या धमनी भ्रष्टाचार की नियुक्ति. नस भ्रष्टाचार (नीला) दो anastomoses में आम मन्या धमनी (लाल) करने के लिए टांका है. प्रत्येक सम्मिलन में, टांके (व्हाइट एक्स के) क्रम में वे रखा जाता है में गिने जाते हैं । दोनों anastomoses के लिए, टांका 1 बाहरी jugular नस करने के लिए arteriotomy के caudal अंत टांके । टांका 2 बाहरी jugular नस को arteriotomy के कपाल अंत टांके । टांका 3 पहले दो टांके से एक बिंदु equidistant पर सम्मिलन के पार्श्व पक्ष पर रखा गया है । 4 टांका सम्मिलन के औसत दर्जे का पक्ष पर रखा गया है, पहले दो टांके से equidistant और 3 सिलाई से भर । चार अतिरिक्त टांके (टांके 5-8) चार मौजूदा टांके के बीच बीच में रखा जाता है । anastomoses के बीच मन्या धमनी खंड 3-0 रेशम टांके (तीर) के साथ दोनों सिरों पर ligated है और लिगेचर्स के बीच आधे रास्ते से विभाजित (धराशायी लाइन). वाम पक्षीय भ्रष्टाचार एक समान तरीके से किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . एक मन्या arteriotomy के निर्माण और बंद करने. (क) आम मन्या धमनी adventitia ठीक संदंश के साथ नस भ्रष्टाचार के पास समझा जाता है और ऊपर की ओर कर्षण धमनी की दीवार के लिए लागू किया जाता है. यह एक ऊर्ध्वाधर सतह बनाता है, तुला 21 जी सुई लगभग पोत लुमेन के लिए समानांतर डाला जा करने के लिए, धमनी के पीछे की दीवार puncturing के जोखिम को कम करने की अनुमति । (ख) arteriotomy एक एक्स पैटर्न में 7-0 के उपयोग टांका है । पहली टांका दर्रा arteriotomy (साइट 1) के नीचे सही में धमनी लुमेन में प्रवेश करती है और नीचे (साइट 2) छोड़ दिया लुमेन से बाहर निकालता है । टांका तो arteriotomy पार । अगले पास फिर से ऊपर सही (साइट 3) में लुमेन में प्रवेश करती है, और शीर्ष पर लुमेन से बाहर निकलता है (साइट 4) छोड़ दिया है । सीवन के सिरों पर कोमल कर्षण (1 साइट और साइट से बाहर समाप्त होता है 4) arteriotomy बंद कर देता है । सीवन समाप्त होता है 2 वर्ग समुद्री मील के साथ बंधे हैं । ठोस नीले हलकों स्थानों जहां सीवन धमनी दीवार में प्रवेश संकेत मिलता है । ठोस नीली लाइनों संकेत जहां सीवन धमनी की दीवार के बाहर गुजरता है; बिंदीदार नीली लाइनें संकेत मिलता है कि सीवन लुमेन के अंदर स्थित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . Transcutaneous अल्ट्रासाउंड छवियों खरगोश गर्दन, का मूल्यांकन नस भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता 5-7 दिनों के बाद भ्रष्टाचार । (एक) पेटेंट नस भ्रष्टाचार (लाल) caudal में रक्त के प्रवाह के साथ-कपाल दिशा (तीर) संकेत दिया है । (ख) Occluded नस भ्रष्टाचार । कोई caudal-कपाल रक्त प्रवाह (जो लाल प्रकट होता है) का पता चला है । कपाल-से-caudal दिशा में रक्त प्रवाह के साथ आंतरिक jugular शिरा (नीला) दर्शाया गया है (तारांकन). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . नस भ्रष्टाचार में बीटा-galactosidase transgene अभिव्यक्ति. 28 दिनों के भ्रष्टाचार के बाद, खरगोश नस भ्रष्टाचार शल्य चिकित्सा अलग नस भ्रष्टाचार के लुमेन के भीतर β-galactosidase व्यक्त adenoviral वैक्टर के एक 20-मिन मशीन द्वारा transduced थे । नस भ्रष्टाचार 3 दिन transduction के बाद काटा गया और 5 के साथ सना हुआ-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside । (एक) कुशल transduction दिखा एक नस खंड की चमकदार सतह की चेहरा छवि एन । (ख) गरीब transduction दिखा एक नस खंड की चमकदार सतह के चेहरे की छवि एन । स्केल बार = १.० mm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . बीटा-galactosidase (β-gal) की अभिव्यक्ति नस भ्रष्टाचार खंडों में transgene mRNA । 28 दिन jugular नस के स्थान के बाद खरगोश मन्या में भ्रष्टाचार, भ्रष्टाचार या तो transduced एक adenoviral वेक्टर एक्सप्रेस बीटा के साथ थे-galactosidase (AdnLacZ) या एक नियंत्रण adenoviral सदिश के साथ कि एक transgene व्यक्त नहीं करता है (AdNull ). सर्जरी या तो एक अनुभवी ऑपरेटर (सर्जन 1) या एक नए ऑपरेटर (2 सर्जन) द्वारा पूरा किया गया । नस AdnLacZ के साथ transduced भ्रष्टाचार सब transduction के बाद 3 दिन काटा गया । आरएनए AdNull के साथ transduced भ्रष्टाचार से निकाला और 14 दिनों के बाद transduction भी विश्लेषण किया गया था, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काटा । बीटा-galactosidase mRNA की अभिव्यक्ति मात्रात्मक रिवर्स transcriptase-मध्यस्थता पीसीआर, glyceraldehyde फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज mRNA के लिए सामान्यीकृत मूल्यों के साथ quantified था एक ही अर्क में मापा, और मनमाना इकाइयों के रूप में व्यक्त (AU). सलाखों मतलब मूल्यों का संकेत; p मान रैंक-योग परीक्षणों से हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम संज्ञाहरण, एंटिकोगुलेशन, धमनी की शल्य चिकित्सा हेरफेर के प्रबंधन में शामिल हैं, और भ्रष्टाचार नस की hemodynamic माप । संज्ञाहरण के उचित प्रबंधन के इस कई अस्तित्व सर्जरी मॉडल है कि दो अपेक्षाकृत लंबे आपरेशनों (आमतौर पर 3-द्विपक्षीय नस भ्रष्टाचार और द्विपक्षीय भ्रष्टाचार transduction के लिए 1.5-2.5 एच के लिए 3.5 एच) शामिल में महत्वपूर्ण है । हम दोनों एक nosecone के माध्यम से और endotracheal इंटुबैषेण द्वारा संज्ञाहरण प्रशासित किया है और पाया कि इंटुबैषेण भ्रष्टाचार transduction सर्जरी के बाद अस्तित्व में सुधार, संभवतः क्योंकि सकारात्मक दबाव वेंटिलेशन atelectasis रोकता है और जुड़े श्वसन विफलता । खरगोश intubate को चुनौती दे रहे हैं, और इंटुबैषेण-संबंधित airway आघात के बाद ऑपरेटिव stridor पैदा कर सकता है । हालांकि, चुनौतियों और इंटुबैषेण की जटिलताओं perioperative रुग्णता और नस भ्रष्टाचार सर्जरी के साथ जुड़े मृत्यु के अधिकांश को नष्ट करने के लाभ के लिए भुगतान करने के लिए एक छोटी सी कीमत हैं ।

एंटिकोगुलेशन में आदेश के बाद या तो अस्तित्व सर्जरी के बाद हो सकता है, जो भ्रष्टाचारी नसों के घनास्त्रता को रोकने के लिए आवश्यक है । घनास्त्रता एक प्रारंभिक पश्चात घटना प्रतीत होता है, क्योंकि नस भ्रष्टाचार कि transcutaneous अल्ट्रासाउंड परीक्षा 5-7 दिन पश्चात पर पेटेंट कर रहे है लगभग हमेशा फसल में पेटेंट हैं । पहले सर्जरी के बाद घनास्त्रता को रोकने के लिए (यानी, नस कलम बांधने), चतुर्थ हेपरिन पहले बाहरी jugular नस संचयन से पहले प्रशासित है । प्लाज्मा आधा खरगोश में हेपरिन के जीवन के आधार पर (1-2 ज), IV हेपरिन की एक अतिरिक्त आधा खुराक contralateral बाहरी jugular नस संचयन से पहले प्रशासित है । इसके अलावा, जब तक दोनों arteriovenous एक व्यक्ति नस भ्रष्टाचार के anastomoses पूरा कर रहे हैं, हम मन्या धमनी के लुमेन फ्लश और नस भ्रष्टाचार लगभग हर 8 मिनट के साथ heparinized सामान्य खारा. भ्रष्टाचार घनास्त्रता से बचने के लिए, ध्यान नस भ्रष्टाचार को नुकसान नहीं-विशेष रूप से endothelium-कटाई और भ्रष्टाचार के दौरान लिया जाना चाहिए । यह शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ नस की कोमल हैंडलिंग शामिल है और नस से जुड़ी adventitial वसा ऊतक की एक पतली परत छोड़ने । हम भी भ्रष्टाचारी मन्या धमनी के लिए सामयिक papaverine की एक खुराक प्रशासन, को रोकने या रिवर्स vasospasm, जो घनास्त्रता के लिए योगदान कर सकते हैं.

सर्जिकल तकनीक के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान नस भ्रष्टाचार निरोधक सर्जरी के दौरान की आवश्यकता है । anastomoses, भ्रष्टाचार घनास्त्रता, और अनियंत्रित hemodynamic चर की शुरूआत में खून बह रहा से बचने के लिए, दो arteriotomies उचित लंबाई का होना चाहिए । यदि एक arteriotomy बहुत कम है, नस भ्रष्टाचार ostial दीवार सम्मिलन की साइट पर बेमानी हो जाएगा, अंतराल है कि रक्तस्राव की अनुमति बनाने । arteriotomy बहुत लंबा है, तो arteriotomy को कवर करने के लिए नस खींच बंद निकटता में नस भ्रष्टाचार की दीवारों लाएगा, यह मुश्किल सर्जन suturing का विरोध नस भ्रष्टाचार की दीवारों को एक साथ से बचने के लिए बनाने (अनिवार्य रूप से पश्चात की गारंटी घनास्त्रता) । इसके अलावा, अगर नस भ्रष्टाचार लुमेन संकुचित है क्योंकि नस एक जरूरत से ज्यादा लंबे समय तक arteriotomy को कवर करने के लिए बढ़ाया गया था, एक प्रकार का रोग है कि बढ़ जाती है कतरनी तनाव,३३घनास्त्रता के लिए संवेदनशील, और संभावित जैसे परिणाम चर बदल जाएगा neointimal वृद्धि और संवहनी remodeling३४,३५। इसके अलावा, यह नस भ्रष्टाचार में twists शुरू करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो लुमेन संकुचन या असामान्य प्रवाह में परिणाम सकता है । भ्रष्टाचार के घुमा से बचने में मदद करने के लिए, हम हमेशा आम मन्या धमनी की ventral सतह के साथ नस खंड संरेखित करें और यह सुनिश्चित नस में कोई twists हैं । क्योंकि चर सर्जिकल तकनीक के लिए क्षमता की नस भ्रष्टाचार hemodynamics बदलने के लिए, और क्योंकि बदल hemodynamics उपचार के स्वतंत्र रूप से परिणाम चर को प्रभावित कर सकते हैं, हम नियमित रूप से मापने के रक्त प्रवाह और भ्रष्टाचार के व्यास से पहले वेक्टर अर्क और फसल का समय है । हम कतरनी तनाव और pulsatility की गणना करने के लिए इन मूल्यों का उपयोग करें । नस पूर्व निर्धारित पर्वतमाला के बाहर hemodynamic माप के साथ भ्रष्टाचार आगे विश्लेषण से होना चाहए बाहर रखा जा सकता है, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने और सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि.

जैसा कि हम इस पद्धति विकसित की है, हम कई संशोधनों बनाया । शुरू में, हम भ्रष्टाचार निरोधक कार्रवाई के दौरान नस भ्रष्टाचार जीन हस्तांतरण का प्रयास किया । हालांकि, इन परिस्थितियों के तहत, transgene अभिव्यक्ति लगभग पूरी तरह से 3 दिन से खो गया था जीन स्थानांतरण के बाद22। Transgene अभिव्यक्ति तेजी से खो दिया है कि नस खंड सीटू में transduced था और फिर भ्रष्टाचार या कि क्या नस पहले भ्रष्टाचार किया गया था, और फिर transduced । केवल transduction देरी के बाद जब तक नस भ्रष्टाचार धमनी परिसंचरण को अनुकूलित किया था (हम 28 दिनों तक इंतजार करने के लिए जीन हस्तांतरण प्रदर्शन भ्रष्टाचार के बाद, हालांकि एक छोटे से संभव हो सकता है देरी), transgene अभिव्यक्ति की तेजी से नुकसान था22 टाल . हम भी intraoperative और पश्चात मौतों का अनुभव करने के बाद endotracheal ट्यूब-दूसरा (जीन स्थानांतरण) सर्जरी के लिए दिया संज्ञाहरण के लिए nosecone-दिया संज्ञाहरण से परिवर्तित । इसके अलावा, एक पश्चात खरगोश में स्पष्ट आकांक्षा निमोनिया का सामना करने के बाद, हम खरगोश के पेट पर एक छोटे से प्लास्टिक की मेज जगह (बाँझ पर्दे के नीचे) शुरू किया । तालिका को अनजाने में खरगोश के पेट पर झुकाव से सर्जन को रोकने के लिए तैनात किया गया था, संभवतः एसिडिटी भाटा और आकांक्षा उत्तेजक । हम मेज की नियुक्ति के बाद कोई और अधिक आकांक्षा घटनाओं था । हालांकि, क्योंकि इस स्थान endotracheal इंटुबैषेण को शिफ्ट के साथ मेल, हम यकीन नहीं किया जा सकता है जो हस्तक्षेप आकांक्षा घटनाओं को नष्ट करने के लिए जिंमेदार है ।

इस विधि की भी सीमाएं हैं । संयुक्त राज्य अमेरिका में, १९६६ के प्रयोगशाला पशु कल्याण अधिनियम की आवश्यकताओं के साथ कुतर आवश्यक अनुपालन के बजाय खरगोशों का उपयोग । तदनुसार, जांचकर्ताओं खरगोशों का उपयोग (या अंय इस अधिनियम द्वारा कवर जानवरों) अच्छी तरह से सुसज्जित है ऑपरेटिंग कमरे और विशेषज्ञ anesthesiologists और पश्चात की निगरानी और देखभाल के एक उच्च स्तर प्रदान करना चाहिए । दूसरी सीमा है कि 2 सर्जरी के लिए निर्बाध transgene अभिव्यक्ति22सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । दूसरी सर्जरी प्रयोगों की लागत बढ़ जाती है और संभावित ऑपरेटिव और perioperative जटिलताओं का एक अतिरिक्त सेट करने के लिए प्रत्येक खरगोश को उजागर करता है । लेकिन, हम किसी भी अंय जीन स्थानांतरण दृष्टिकोण है कि नस भ्रष्टाचार में टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त की जानकारी नहीं है । इस विधि की तीसरी सीमा है कि यह HDAd वैक्टर और उच्च titer HDAd शेयरों की तैयारी के निर्माण में विशेषज्ञता की आवश्यकता है । कई प्रयोगशालाओं पहली पीढ़ी adenoviral, lentiviral, और adeno वायरल (AAV) वैक्टर के साथ विशेषज्ञता है, लेकिन अपेक्षाकृत कुछ समूहों HDAd के साथ अनुभव है और आम तौर पर इस विशेषज्ञता प्राप्त करने के लिए एक सहयोग स्थापित करने की आवश्यकता होगी । विधि के नैदानिक प्रयोज्यता भी सीमित किया जा सकता है । मनुष्यों के लिए, एक दूसरी सर्जरी लागत और जटिलता दोनों जोखिम में वृद्धि होगी । इसके अलावा, मानव saphenous नसों की तुलना में (कोरोनरी और परिधीय बाईपास सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया), खरगोश बाहरी jugular नसों बहुत पतली दीवारों है । यह संभव है कि दीवार और अधिक मोटा होना है कि धमनी परिसंचरण में एक खरगोश बाहरी jugular नस भ्रष्टाचार के बाद होता है अगर नस भ्रष्टाचार पहले से ही एक मोटा दीवार है तनु होगा । अंत में, 6 महीने तक चलने वाले इस मॉडल में प्रयोगों में, भ्रष्टाचारी नसों में से कोई एक प्रकार का रोग22विकसित. इसलिए, इस विधि के सभी जैविक प्रक्रियाओं है कि नस भ्रष्टाचार विफलता के लिए योगदान करने के लिए प्रकट नहीं होता है ।

अंत में, विधि मानव संवहनी रोग (खरगोश) के एक मजबूत पशु मॉडल का उपयोग करता है को भ्रष्टाचारी नसों जिसमें transgenes छुरा समय की लंबी अवधि के लिए व्यक्त कर रहे है उत्पंन (कम से 6 महीने)22। नस भ्रष्टाचार में transgenes की स्थिर अभिव्यक्ति सामांय नस भ्रष्टाचार homeostasis में अपनी भूमिका प्रकट करेंगे और नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी के लिए अपनी क्षमता को स्पष्ट करेंगे । विधि में सुधार किया जा सकता है और अधिक नैदानिक तकनीकों के विकास द्वारा लागू किया है कि नस भ्रष्टाचार के लिए वैक्टर के percutaneous वितरण की अनुमति है, जिससे दूसरी सर्जरी से परहेज । इन तकनीकों कैथेटर आधारित हो सकता है३६,३७, या वे विशेष रूप से तैयार वैक्टर कि एक परिधीय नस में इंजेक्शन और फिर नस भ्रष्टाचार की दीवार को लक्षित कर रहे हैं, उदाहरण के लिए चुंबकीय क्षेत्र३८द्वारा शामिल कर सकते हैं । विधि भी lentiviral और AAV वैक्टर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर वायरल वैक्टर सहित नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी, के लिए HDAd के अलावा अंय वैक्टर के परीक्षण की अनुमति होगी । ३९ , ४० , ४१ , ४२

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposables
3mL syringe with 24G needle Becton Dickinson 309571 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needle Becton Dickinson 309623 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needle Becton Dickinson 305187 Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lock Nipro Medical Corp JD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4” Terumo Medical Products SROX2419V
21G needle Becton Dickinson 305165 Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4” Dynarex 3242 ~10-15 per surgery
3-0 silk suture Covidien Ltd. S-244
5-0 silk suture Covidien Ltd. S-182
7-0 polypropylene suture CP Medical 8703P Vein graft surgery
7-0 polypropylene suture CP Medical 8648P Gene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid suture CP Medical 421A
3-0 polyglycolic acid suture CP Medical 398A
Alcohol swabs Covidien Ltd. 6818 For the placement of I.V. line
Catheter plug Vetoquinol 411498
Ketamine HCl, 100 mg/mL Vedco Inc. 5098916106
Xylazine, 100 mg/mL Akorn Inc. 4821
Lidocaine, 20 mg/mL Pfizer 409427702
Marcaine 0.5% Pfizer 409161050
Beuthanasia D-Special Intervet Inc. NDC 00061047305 Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL Patterson Veterinary 12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride Baxter 2B1309
Heparin  (5000 U/mL) APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml) American Reagent Inc. NDC 0517-4002-25 Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/h Apotex Corp. NDC 60505-7006-2
Isoflurane Multiple vendors Catalog number not available
 Viral vector Gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight Roboz RS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt Roboz RS-6828
Needle holder /w suture scissors Miltex 8-14-IMC
Castroviejo scissors Roboz RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock Roboz RS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt Roboz RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs Roboz RS-6514 2x
Backhaus towel clamp 3.5" Roboz 4x
Micro clip setting forceps 4.75" Roboz RS-6496
Micro vascular clips, 11 mm Roboz
Surg-I-Loop Scanlan International 1001-81M 5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width Roboz RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm Roboz RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip Roboz RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tips Roboz RS-7110 2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips Roboz RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips Roboz RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips Roboz RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width Roboz RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width Fine Science Tools 11092-12 2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight Fine Science Tools 11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode MACAN Manufacturing HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump Multiple vendors Catalog number not available
Bair hugger warming unit 3M Model 505
IV infusion pump Heska Vet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavenger Multiple vendors Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor Surgivet Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit MACAN Manufacturing MV-9
Surgical microscope D.F. Vasconcellos M900 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
  2. Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
  3. Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
  4. de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
  5. Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
  6. Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
  7. Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
  8. Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
  9. Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
  10. Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
  11. Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
  12. Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
  13. Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
  14. Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
  15. Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
  16. Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
  17. Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
  18. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
  19. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
  20. Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
  21. Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
  22. Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
  23. Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
  24. Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
  25. George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
  26. Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
  27. Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
  28. Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
  29. Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
  30. Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
  31. Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
  32. Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
  33. Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
  34. Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
  35. Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
  36. Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
  37. Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
  38. Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
  39. Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
  40. Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
  41. Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
  42. Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).

Tags

चिकित्सा अंक १३९ मानव रोग के पशु मॉडल atherosclerosis जीन थेरेपी शोधों की पढ़ाई खरगोश बाहरी jugular नस आम मन्या धमनी परस्पर नस भ्रष्टाचार संवहनी रोग एडीनोवायरस हेल्पर-आश्रित एडीनोवायरस.
आम मन्या धमनी के लिए Jugular नस में टिकाऊ Transgene अभिव्यक्ति का एक खरगोश मॉडल भ्रष्टाचार
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bi, L., Wacker, B. K., Dichek, D. A. … More

Bi, L., Wacker, B. K., Dichek, D. A. A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts. J. Vis. Exp. (139), e57231, doi:10.3791/57231 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter