Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

דגם ארנב של ביטוי Transgene עמיד ומוחלף כדי שתלי Interposition נפוצים של העורק הראשי

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/57231
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Medicine, University of Washington School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

שיטה זו מתארת את המיקום של שתלי העורק interposition בארנבים, את התמרה חושית של השתלים, ההישג של הביטוי transgene עמיד. דבר זה מאפשר החקירה של תפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים של transgenes ומוצרים שלהם חלבון בורידים המושתל, ובדיקות של ג'ין טיפולים למחלות שתל הווריד.

Abstract

ניתוח מעקפים שתל הווריד הוא טיפול נפוץ מחלת עורקים ריטלין; עם זאת, הצלחה לטווח ארוך הוא מוגבל על ידי שתל כשל פקקת, היפרפלזיה intimal וכתוצאה טרשת עורקים. מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה עבור הצבת interposition ורידים דו-צדדית שתלי ארנב, ואז transducing את השתלים עם וקטור העברת גנים שמקבל ביטוי transgene עמיד. השיטה מאפשרת החקירה של התפקיד הביולוגי של הגנים שלהם מוצרי חלבון הומאוסטזיס שתל הווריד נורמלי. זה גם מאפשר בדיקה של transgenes על הפעילות שעלולים למנוע כשל שתל הווריד, למשל., אם הביטוי של transgene ומונע גידול neointimal, מפחית דלקת כלי הדם או מפחית טרשת עורקים בארנבים האכיל עם דיאטה עתירת שומן. במהלך ניתוח הישרדות הראשונית, פילוחי ימינה ושמאלה חיצוני ומוחלף טוחנות, להציב מבקיעים כמו הפוכה הקצה לצד נפוצות העורק interposition שתלים. במהלך ניתוח הישרדות נוסף, ביצע 28 ימים לאחר מכן, כל אחד השתלים הוא מבודד זרימת הדם עם תפסים, לומן (דרך arteriotomy) מלאים פתרון שמכיל וקטור (HDAd) adenoviral תלויי-עוזר. לאחר דגירה 20-מין, הפתרון וקטור הוא aspirated arteriotomy יתוקן, זרימה משוחזר. הורידים נקצרים בנקודות זמן מוכתב על ידי בודדים בפרוטוקולים ניסיוניים. העיכוב 28 יום בין הצבת שתל את התמרה חושית יש צורך להבטיח את העיבוד של השתל וריד אל הדם העורקי. הסתגלות זו מונע אובדן מהיר של הביטוי transgene המתרחשת אצל שתלי העורק transduced לפני או מיד לאחר הרכבה. השיטה היא ייחודית ביכולתה כדי להשיג את הביטוי transgene עמיד, יציב בורידים המושתל. לעומת דגמים אחרים של שתל הווריד חיה גדולה, ארנבים יש יתרונות הטיפול זולה וקלה. לעומת מודלים שתל הווריד מכרסמים, ארנבונים יש כלי דם גדולים יותר, קל יותר לתמרן, המספקים שפע רקמות לצורך ניתוח.

Introduction

טרשת העורקים היא מחלה דלקתית כרונית שבה הצטברות שומנים בדם ודלקת בדופן כלי הדם להוביל היצרות של כלי השיט לומן, התקפי לב, שבץ, אובדן גפיים1,2. התערבויות מלעורית (למשל., אנגיופלסטיקה ולא סטנט) וטיפול רפואי (למשל., סטטינים antiplatelet סוכנים) טיפולים שימושי עבור טרשת עורקים; עם זאת, לעתים קרובות הם יעילים בטיפול חמור מחלה חסימתית שני ב circulations כלילית ואת היקפי. מעקף השתלת עור, באמצעות מקטעים וריד autogenous, נשאר הליך נפוץ לטיפול בחולים עם חמור, מפוזר כלילית והיקפי מחלת כלי דם3,4. עם זאת, הווריד שתלי להציב שני עוצר ויש circulations היקפי המסכן המחירים patency לטווח ארוך. במחזור כלילית, כ- 10-20% של וריד שתלי הם occluded-1 שנה ו- 50% הם occluded 10 שנים5,6. במחזור היקפיים, וריד שתל כשל תעריפי 30-50%-5 שנים7.

ריפוי גנטי היא גישה אטרקטיבית למניעת כשל שתל הווריד. כי זה יכול לספק מוצר גנים טיפוליים בדיוק באתר של המחלה. בהתאם לכך, מחקרים פרה רבים בדקו וריד שתל ג'ין טיפול8,9. עם זאת, בעיקרו של דבר כל מחקרים אלו בחנו את היעילות בגיל מוקדם זמן נקודות (2-12 שבועות)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. אנו מודעים אין ראיות כי התערבויות ריפוי גנטי יכול לספק עמיד (שנים) הגנה מפני המנוח כשל שתל הווריד הנובעת בדרך כלל היפרפלזיה של טרשת עורקים neointimal4. פיתחנו שיטה מאפשרת ביטוי transgene עמיד בורידים המושתל, ובכך מאפשר בדיקה של ריפוי גנטי התערבויות בנקודות זמן מאוחר, כמו גם מוקדם. כדי להשיג את הביטוי transgene עמיד, השיטה משלבת HDAd וקטורים אסטרטגיה התמרה חושית מושהית. וקטורים HDAd לספק ביטוי transgene ממושך בשל העדר גנים ויראלי, מניעת זיהוי (ולא דחייה) של תאים transduced על ידי המערכת החיסונית18,19,20, 21. מושהית התמרה חושית (שבוצעו 28 ימים לאחר הצבת שתל) מונע איבוד תאים transduced במהלך תהליך arterialization המתרחש מוקדם לאחר grafting22.

שיטות אחרות להשיג transgene טיפולית ביטוי בקיר שתל הווריד להסתמך על התמרה חושית של השתל וריד בזמנו של שתל השמה10,11,12,15,16 ,17. כאשר נמדד באופן סדרתי, transgene הביטוי תוך שימוש בגישה זו יורדים במהירות לאחר התמרה חושית22,23. בהתאם לכך, מחקרים באמצעות גישה זו לא בחנו את היעילות מעבר 12 שבועות לאחר וריד משתילים, עם ביותר לא הערכת יעילותם מעבר 4 שבועות. לעומת זאת, השיטה שלנו משיגה שתל הווריד ביטוי transgene stably נמשך לפחות 24 שבועות מבוסס על מחקרים דומים שבוצעו בסביר-העורקים ממשיך22,יותר24. אנחנו מודעים ללא אחרים וריד שתל ג'ין טיפול התערבות שמקבל ביטוי transgene יציבה משך זמן זה.

השתמשנו דגם ארנב לפתח את השיטה שלנו. אחרים השתמשו מכרסמים, ארנבות, או חיות גדולות כדי לבדוק את הווריד להשתיל ג'ין טיפול10,11,12,15,16,17,25, 26. לעומת מודלים מכרסמים, ארנבונים יקרים יותר, והם כפופים דרישות רגולטוריות מחמירים יותר. עם זאת, בהשוואה חיות גדולות (למשל., חזירים, כלבים), ארנבים הם הרבה פחות יקרים לרכוש בית הרבה יותר קל להתמודד. יתר על כן, הארנב כלי דומה כלי האנושי מבחינה פיזיולוגית27, הם מספיק גדולים כי הם יכולים לשמש לבדיקת התערבויות מלעורית28,29, הם מספקים מספיק רקמה את זה נקודות קצה מרובות (למשל., היסטולוגיה, חלבון, RNA) יכולים להיבדק באמצעות כלי דם בודדת הדגימה22,30. בנוסף, כאשר הארנבים עם שתלי העורק ניזונים מדיאטה עתירת שומן, הם מפתחים וריד שתל טרשת עורקים31,32, אשר היא גורם שכיח של עורקים מעקף לווריד שתל כשל4,5 . אלה שתלי העורק ארנב טרשת עורקים יכול לשמש מצע לבדיקת טיפול גנטי התערבויות נמסרות בשיטה זו. פרוטוקול שסופקו יכול לעזור חוקרים לשלוט טכנית הכישורים הדרושים כדי להשיג transgene עמיד ביטוי שתלי העורק ארנב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים ולימודי אושרו על ידי אוניברסיטת וושינגטון למשרד של צער.

1. מבצע קדם (עבור כל ניתוחים)

  1. עזים ומתנגד הארנבת עם 30 מ"ג/ק"ג קטמין ו 1.5 mg/kg חריגות השירותים הווטרינריים בזריקה תוך שרירית (IM) בשרירים paraspinous.
    הערה: מזון ומים הם לא מוגבל לפני הניתוח.
  2. בזמן שחיכינו מספיק לעומק של הרדמה, להגדיר את טבלאות חדר ההכנה ובחדר ההפעלה (או אר).
    1. להכין את החדר הכנה גילוח הצוואר של הארנב, והנחת הנמל (IV) תוך ורידי באוזן (ניתוח הישרדות בלבד). מקם את המשחה אופטלמולוגיות, תחבושות של פנטניל (ניתוח הישרדות), קוצץ שיער, משטח ההכנה אלכוהול, 24-G x ¾" קטטר, הזרקת port והדבקה על השולחן הכנה.
    2. בחדר הניתוח, להגדיר את ציוד ניטור ומקושרת רגשים (רל (ג), אוקסימטר (SpO2) וטמפרטורה). להכין את המשאבה הרביעי עם שקית IV saline 100 מ עם המחט ג'י 18 או 19-G, להגדיר קצב הזרימה h 10 מ"ל/ק"ג (ניתוח הישרדות בלבד). להגדיר את ציוד חמצן, איזופלוריין עם nosecone (וריד הרכבה או קציר-ניתוחים).
      1. כדי לאבטח את nosecone הארנב, לולאה רצועה גזה סביב הצינור אספקת גז nosecone. הלופ הזה צריך להקיף את הצינור שבו היא מייחסת nosecone. הפנויות של רצועת גזה צריך שניהם אתעכב כ 45 ס מ. מניחים את nosecone (עם גזה המצורפת) על הקצה של הראש של טבלה.
    3. להפעיל את המים במחזור ו/או דחסת אוויר חימום שמיכה על השולחן או. השמיכה התחממות כדור הארץ, מקמו מגבת מגולגלת כמו תמיכה לצוואר ומניחים על צלחת אלקטרודה ואנליזת electrocautery.
    4. כמו משכך כאבים מקומי, לשלב בתוך מזרק 1 מ"ל של לידוקאין 2% HCl ו 1 מ"ל של 0.5% נמשך HCl. לדלל את הוירוס לריכוז הרצוי (הנה, תשתמש עונה 2 פרק 1011 ויראלי חלקיקים/mL עבור HDAd) ב DMEM סטרילי ולשמור על קרח (ניתוח העברת גנים בלבד).
    5. לאחר עומק הרדמה נאותה מתמלאת, להכין את הארנב לניתוח.
      הערה: הבדיקה על חוסר רפלקס הנסיגה פדלים כדי להבטיח עומק הרדמה נאותה. נמשיך לעקוב את רפלקס לדווש לאורך כל הניתוח.
      1. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים של הארנב.
      2. כדי לאפשר המיקום של בדיקה רקטלית טמפרטורה, לחץ עם האצבעות בכפפה מעל הרקטום ארוכה להזיז אצבעות לכיוון פי הטבעת כדי להסיר stooling של פי הטבעת של הארנב.
      3. לגלח את הארנב של החריץ בחזה ובצלעות לקצה של הלסת התחתונה. לגלח אוזן אחת עבור מיקום הרביעי ואת האוזן הנגדית עבור ניהול תיקון פנטניל (ניתוח הישרדות בלבד). לגלח את האצבעות האמצעיות האחורי השמאלי את המיקום של המכשיר2 SpO.
    6. לניתוח אינפוזיה וקטור, להנשים את הארנב. השתמש של 4 מ מ O.D./3 מ מ תעודת זהות אני אאזוק אנדוטרכאליות שפופרת, מושחל על אטרוסקופ. הצב את הארנב recumbency בחזה ובצלעות, hyper-להאריך את הצוואר. החזק הפה של הארנב לרווחה ולהשתמש את arthroscope כדי להמחיש את הקפלים glottis, בגרון. ההשראה, במהלך הכנס בעדינות את הצינור אנדוטרכאליות דרך הגרון לתוך קנה הנשימה.
    7. עבור הניתוחים הישרדות, המקום מאובטח צנתר הרביעי 24-G לתוך הווריד אוזן שמאל של הארנב, מכסה אותה עם יציאת הזרקה. להחיל תיקון 25 µg/h פנטניל לאוזן ימין של הארנב.
      הערה: הפרוטוקול היא מנתח ממוקם בצד ימין של הארנב. אם המנתח יהיה בצד שמאל של הארנב, להפוך את הצדדים בשלב זה כדי לשמור את החוטים ועל הרביעי מול של המנתח. מעבר בין הצדדים בשלבים עתידיים לפי הצורך.
    8. עבור הווריד ניתוחים הרכבה ו הקציר, להזריק הרדמה כללית עם nosecone; . לניתוח אינפוזיה וקטור, לנהל הרדמה כללית באמצעות צינור אנדוטרכאליות.
      הערה: צנרור יכול לשמש עבור כל הניתוחים.  מניסיוננו, לעומת זאת, הסיכוי לסיבוכים מטראומה והכו אותי ואת בגרון במהלך צנרור יכול גוברים על היתרונות של צנרור.  הניתוח הכולל העברה גנטית כדי השתלה (במיוחד אצל ארנבונים כולסטרול-fed) הוא הניתוח היחיד אשר צנרור נראה למתן טובת הנאה נטו.
    9. לשאת את הארנב לחדר הניתוח. הצב את הארנב במצב פרקדן על שולחן הניתוחים עם המגבת תמיכה לצוואר ממוקם מתחת לראש של הארנב. בעדינות הארך הצוואר של הארנב ישר ואופקי בקירוב.
    10. מניחים את nosecone על הארנב (וריד הרכבה ו הקציר-ניתוחים) או לחבר את הצינור אנדוטרכאליות (וקטור אינפוזיה ניתוח) עם O2 ב 1 ליטר/דקה, להתחיל איזופלוריין. אם משתמש של nosecone, לאבטח על ידי ליפוף קצות רצועות גזה מצורף סביב מגבת תמיכה לצוואר של הארנב. התאם את הריכוז איזופלוריין לפי הצורך (בדרך כלל 1-2%) כדי לשמור על רמת הניתוח של הרדמה.
    11. מרכז צלחת אלקטרודה ואנליזת electrocautery תחת הגב של הארנב. את הגשוש טמפרטורה רקטלית ולהחיל SpO2 בדיקה ומוביל אק ג על הארנב.
    12. להתחבר לקו IV saline יציאת הצנתר באוזן השמאלית של הארנב ולהתחיל את משאבת אינפוזיה הרביעי ב h 10 מ"ל/ק"ג. לאחר 1 h, להקטין את קצב העירוי מלוחים ש מ ל/ק ג.
    13. לקשור באופן רופף הרגליים הקדמיות של הארנב לשולחן הניתוחים כמו מעצורים.
      הערה: לחלופין, שולחן פלסטיק קטן ניתן להניח מעל הארנב כדי למנוע את המנתח של לחיצה על החזה/הבטן הארנב, ובכך לגרום ריפלוקס ושאיפה.
    14. להזריק לידוקאין/נמשך (2 מ"ל, מערבבים 50/50, שלב 1.2.4) subcutaneously (SQ) בצוואר לאורך קו החתך המתוכנן, על הרדמה מקומית.
    15. להורות למסייע לחטא את ניתוח באתר עם 3 לסירוגין קרצוף chlorhexidine gluconate, אלכוהול איזופרופיל, ואז לרסס את האתר עם povidone יוד. יש את המנתח לשפשף, חלוק, הכפפות, העקרונות אספטי.
      1. לבצע ניתוחים ההישרדות בתנאים אספטי. יש המסייע להתמודד עם כל הפריטים שאינו סטרילי, גילוח ורחיצה כירורגית להעביר חומרים סטרילי המנתח או גילוח ורחיצה כירורגית למקם אותם על השולחן כלי הצרה.
      2. יש את המנתח להשתמש מגבות סטרילי גילוח ורחיצה כירורגית לתפעל ציוד שאינו סטרילי כגון המיקרוסקופ. יש לי את המנתח ללבוש 2 x זכוכיות מגדלת כירורגית בעת ביצוע במחצית הראשונה של הניתוח.

2. ניתוח שתל וריד (הישרדות)

  1. להכין את הכלים ואת שדה סטרילי.
    1. יש העוזר לפתוח סטרילי חבילות (תלוי השולחן, תלוי נייר ומגבות 6) ולהעביר את התוכן גילוח ורחיצה כירורגית למנתח הפלסטי.
    2. לעטוף את הטבלה כלי. מניחים נייר בד ומגבות סטרילי על השולחן כלי הצרה. 4 מגבות, לעטוף את הארנב, עוזב רק באתר כירורגית על הצוואר חשוף. להניח את הכיסוי ותאבטחי נייר על הארנב. מגבת אחת ישמש אחר כך, האחרון הוא גיבוי.
    3. יש העוזר לפתוח חבילת כלי סטיריליים ולהעביר את המגש מכשיר גילוח ורחיצה כירורגית למנתח הפלסטי. לארגן את המכשירים על השולחן כלי נגינה.
    4. להורות למסייע לפתוח את הציוד הבא: גילוח ורחיצה כירורגית להעביר אותו המנתח או להניחו על השולחן כלי: מזרק 1-mL אחד, מזרק 3-mL אחד, אחד 20-mL מזרק, המחט 21 גרם אחד, תפר (PGA) חומצה polyglycolic 3-0, 5-0 PGA תפר , 7-0 בתפר פוליפרופילן, צנתר הרביעי 24 גרם אחד.
    5. אבטח את הכבל electrocautery כדי לעטוף המכסה את הארנב, שימוש של 7.25" Kantrowitz מלקחיים. ירידה בסוף הכנס הכבל מעל קצה שולחן הניתוחים כדי להיות מחובר ליחידת במכשיר צריבה עם ראש ומופעל על-ידי המסייע.
    6. ממלאים מזרק 20-mL מלח סטרילית התיק מלוחים או בקבוקון שהוחזקו על-ידי המסייע. להשתמש זו תמיסת מלח לפי הצורך כדי למנוע את התייבשות של רקמות חשופות במהלך המבצע.
    7. להכין 5 מ ל תמיסת heparinized הפיזיולוגיות על-ידי הוספת 0.1 מ"ל של 5,000 IU/mL הפארין 5 מ של תמיסת מלח, כלומר., הפרין 100 IU/mL, כירורגי בקערה קטנה. השתמש פתרון זה לשטוף את השתל עורק, וריד לעורק הצוואר באופן קבוע במהלך ההליך grafting.
    8. חותכים חור הכיסוי ותאבטחי נייר מעל האתר כירורגית על הצוואר של הארנב. שימוש מלחציים מגבת כדי לצבוט את הפינות של החור במקום המגבות המשמש כבסיס.
  2. ניתוח כלי דם
    הערה: השתמש x 2 זכוכיות מגדלת כירורגית כדי לסייע עם החלק הזה של הניתוח.
    1. לחתוך את העור electrocautery לאורך הקו האמצעי בין החריץ בחזה ובצלעות הלסת התחתונה (כ 7-9 ס מ אורך), תהדק את העור בצוואר של הארנב המגבות עם המלחצות מגבת. בסוף סימטרית, לבצע חתך לרוחב קצר דרך fascia עם electrocautery. בלשון בוטה לנתח תחת fascia לאורך הקו האמצעי כולו באמצעות מספריים גדולים. לחתוך דרך השכבה fascial גזור לאורך הקו האמצעי עם electrocautery.
    2. להתחיל בצד ימין. לנתח בין השריר sternocephalic בצורת V, כדי לחשוף את עורק תרדמני לשריר sternohyoid המכסים את קנה הנשימה.
    3. בזהירות לנתח קטע 4-5 ס מ עורק תרדמני, סניפים גדולים יותר (בדרך כלל 1-2 בכל צד) ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. להרחיב את הקרע מבסיס הצוואר הציר הקרוב למעבר של עצב לועי יש. השתמש הסיליקון כירורגי לולאות כדי לסייע הכחשה של העורק הראשי בזמן. מאתרים ומפסיקים את ענפי עורק תרדמני בתפרים משי 5-0 גדול לפני גזירת כל סניף רחוק.
      הערה: יש להיזהר לא להפריע העצב התועה מקבילה של עורק תרדמני או העצבים קטנים יותר לחצות העורק.
    4. חזור על הקרע בצד שמאל (שלב 2.2.3).
    5. להשתמש מלקחיים להחזיק רקמות לסגור זמנית את השכבה התת-עורית. לנתח fascia שטחית בעור בצד ימין עד עורק הצוואר חשוף. לנתח קטע 4-5 ס מ של עורק הצוואר וגישה חופשית שלה ענפים מן הרקמה שמסביב, נבדק ענפים קטנים בתפרים משי 5-0 לפני גזירת הענף.
    6. חזור על הקרע בצד שמאל (שלב 2.2.5).
    7. להזריק הפרין (150 IU/ק ג) הקטטר IV ויש לשטוף עם 10 מ"ל של תמיסת מלח.
    8. קטע 3-ס"מ חיצוני ומוחלף בצד ימין וכולן מאתרים ומפסיקים בסוף סימטרית קטע 5-0 בתפר משי. לאפשר את הווריד למלא עם דם, ואז מאתרים ומפסיקים סוף הגולגולת קטע וריד. לחלק סוף הגולגולת קטע עורק הצוואר, לשטוף היטב את הכלי עם heparinized תמיסת מלח (100 U/mL) בעזרת מזרק 3-mL מחובר צנתר הרביעי 24-G. לחלק על קטע וריד בקצה סימטרית. מניחים על קטע וריד בעמדה מתוקננת, שבו הקצוות סימטרית, הגולגולת ניתנים לזיהוי חד משמעית.
  3. וריד הרכבה
    1. תן המסייע להסיר את זכוכיות מגדלת כירורגי של המנתח ולעבור מיקרוסקופ כירורגי (25 X) למקומן.
      הערה: המנתח צריך לעטוף מגבת נקיה על המיקרוסקופ. דבר זה מאפשר למנתח לתמרן המיקרוסקופ תוך שמירה על עקרות.
    2. תהדק את. עורק תרדמני בסוף כל מקטע מבודד עם מיני-מלחציים, הצבת את המלחציים הגולגולת הראשונה כדי לאפשר את העורק מילוי, ולאחר מכן ממקם את המלחציים סימטרית.
    3. חותכים 1 × 2 ס מ פיסת נייר נוקשה (הזמינים באמצעות אריזה סטרילי תפר) והצב אותה מתחת עורק תרדמני, כדי לשפר את החשיפה.
    4. ביצוע של arteriotomy רק הגולגולת המלחציים סימטרית (arteriotomy סימטרית). אורך arteriotomy צריך להיות שווה לקוטר של סוף הגולגולת קטע וריד. הוסף את המזרק עם הצנתר IV דרך arteriotomy סימטרית ותורידי לומן העורק עם תמיסת מלח heparinized.
    5. תפר סוף הגולגולת הווריד כדי arteriotomy סימטרית, באמצעות 7-0 בתפר פוליפרופילן עם תפרים יחיד (איור 1).
      1. המקום הראשון תפר את האצבעות סוף arteriotomy סימטרית לסוף הגולגולת קטע וריד סימטרית. מקם את התפר השני 180° מ תפר הראשון, לתפור בסוף arteriotomy סימטרית לסוף הגולגולת קטע וריד הגולגולת.
      2. המקום תפר השלישי בנקודה במרחר שווה שני הראשונים תפרים, על הצד הלטראלי של ההשקה. במקום הרביעי תפר על הצד המדיאלי של ההשקה, קו מקביל של התפרים הראשון שני ומול תפר השלישי. מקום 4 תפרים נוספים (תפרים 5-8) בין כל התפרים 1-4.
      3. לבצע את arteriotomy הגולגולת בצד סימטרית של הסרטון הגולגולת. המרחק בין סוף הגולגולת arteriotomy הגולגולת ואת סוף arteriotomy סימטרית סימטרית צריך להיות זהה אורך קטע וריד. אורך arteriotomy הגולגולת שווה לקוטר של סוף קטע וריד סימטרית.
    6. להאריך את הווריד cranially מן ההשקה, שוכב זה בעורק, ללא היכרות עם כל הפיתולים. לשטוף את העורק הראשי, הווריד עם תמיסת heparinized ויה arteriotomy הגולגולת. מלוחים יזרמו דרך העורק, לווריד ויה ההשקה סימטרית, תיסגר בסוף בחינם, unsutured הווריד. פלאשינג הווריד גם מונעת זה פיתול.
    7. תפר סימטרית סוף הווריד כדי arteriotomy הגולגולת (איור 1).
      1. למקם תפר הראשון לתפור בסוף arteriotomy הגולגולת לסוף סימטרית קטע וריד סימטרית. למקם תפר השני לתפור בסוף arteriotomy הגולגולת לסוף סימטרית קטע וריד הגולגולת. להשלים את ההשקה כפי שמתואר בשלב 2.3.5.2. בדיוק לפני הקשר האחרון קשורה על ההשקה הגולגולת, בקצרה פתח את המלחציים בקצה הגולגולת ביתור נפוצות העורק הראשי קטע, כדי לאפשר חזרה-דימום שוטף את האוויר העורק הראשי, וריד המושתל. לאחר מכן, להדק את הקשר האחרון.
    8. לשחרר את המלחציים הגולגולת מאפשרים שתל הווריד מתמלא דם ולאחר מכן שחרר את התפס סימטרית הפעימות בריסק צריך לראות את שתל הווריד. הפעילו לחץ עדין עם גזה יבשה כדי לעצור דימום-חיבור.
    9. מאתרים ומפסיקים את שני הקצוות של המקטע העורק משותפת שמחברת את חיבור בתפר משי 3-0 ולחלק בעורק באמצע הדרך בין ליגטורות (איור 1). מספר טיפות של papaverine (3.5 מ"ג/מ"ל) חלות על העורק הראשי סמוך לכל השקה.
    10. להזריק הפרין (75 IU/ק ג) לתוך הצנתר האוזן IV ויש לשטוף עם 10 מ"ל של תמיסת מלח. בשלב זה, להזריק הבופרנורפין (SQ, 0.02 נקודות מ"ג/ק"ג) כדי לספק שיכוך כאבים לאחר הניתוח עד התיקון פנטניל סיפקה כאבים פלזמה רמות של פנטניל.
      הערה: זריקה הבופרנורפין נוספים (SQ, 0.02 נקודות מ"ג/ק"ג) עשוי להיות נחוץ 6 שעות לאחר הזריקה הראשונה כדי לשמור על שיכוך כאבים עד פנטניל פלזמה מגיע ריכוז טיפולית.
    11. חזור על הרכבה בצד שמאל (שלבים 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
    12. סגור את הרקמה התת עורית 5-0 בתפר PGA באמצעות תבנית רציפה. סגור את העור 3-0 בתפר PGA באמצעות תבנית intradermal. לקבור את הקשרים בשני הקצוות.
  4. ההחלמה לאחר הניתוח, ניקוי, טיפול
    הערה: לאפשר את הארנב להתאושש מן ההרדמה בסביבה רגועה, שקטה. נטר את הארנב ברציפות על טמפרטורת הגוף, חמצון נאות עד זה הוא החלים לחלוטין.
    1. כבה איזופלוריין וחמצן וחבר נתק מכונת ההרדמה של הארנב. נתק את הצנרור נוזלים IV של הארנב, אבל להשאיר הנמל הרביעי בווריד האוזן לגישה מתהווה.
    2. להעביר את הארנב לכלוב שחזור ומניחים אותו על צדו. מספקים תמיכה תרמי עם מים חמים שמיכה (או התחממות בכפייה-אייר). תן O2 מאת nosecone עד SpO2 תהיה יציבה.
    3. עד הארנב יכול לשבת ambulate בכלוב שלו, להעיף את הארנב שלה בצד השני כל 15 דקות. לאחר מכן להסיר את הצינורית הרביעי של האוזן, להחזיר את הארנב לכלוב שלו. להחזיר את הארנב מחברתם של חיות אחרות רק אחרי זה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
    4. תשליך בפרוטוקולים הבאים פסולת כלשהי המתאימה עבור סילוק פסולת חומרים מסוכנים, שרפ.
    5. במשככי, בדוק פעירת ובריאות של הארנב בכל יום. לנהל הבופרנורפין כפי הצורך כאב לא מנוהל על ידי התיקון פנטניל. הסר את התיקון פנטניל ביום שלאחר הניתוח השלישי.

3. אולטרסאונד transcutaneous

  1. כדי להעריך את שתל patency, מבצע בחינה אולטרסאונד ארנב שאינם מרדימים 5-7 ימים אחרי ניתוח שתל הווריד ניתוח העברה גנטית.
    1. לעטוף את הארנב שאינם מרדימים היטב בשמיכה, למקם את הארנב פרקדן V-פלס וטרינרי עם הצוואר המורחבת. לגלח את הצוואר, או אם יש צורך, להסיר את השיער עם סוכן depilatory. חלות ג'ל אולטרסאונד הצוואר ולבצע בחינה אולטרסאונד.
      הערה: בחינה אולטרסאונד גם מתבצע על ארנבים ומורדמת בזמנו של הניתוח העברת הגן והן הניתוח הקציר שתל מסוף לבחון שתל patency וכדי למדוד את קוטר לומן שתל. הבחינה נעשית רק לפני הצוואר קרצוף ומתבצעת באופן דומה לגבי הארנבים שאינם מרדימים.

4. לבצע ניתוח העברה גנטית ~ 28 ימים לאחר מיקום השתל (ניתוח הישרדות)

  1. להכין את כלי הנגינה ואת השדה סטרילי.
    1. בצע את השלבים הבאים 2.1.1-2.1.3. בניתוח שתל הווריד.
    2. תן המסייע לפתוח את הציוד הבא גם גילוח ורחיצה כירורגית לעבור אותו ל המנתח או להניחו על השולחן כלי: שישה מזרקים 1-mL (עם מחט), מזרק 3-mL אחד, אחד 20-mL מזרק, מחט 21 G אחת, מחט אחת 19-G, תפר PGA 3-0 , תפר PGA 5-0, 7-0 בתפר פוליפרופילן, שני צנתרים הרביעי 24 G ולאחר בדיקה זרימת דם סטרילי.
    3. בצע את השלבים הבאים 2.1.5-2.1.6. בניתוח שתל הווריד.
    4. להכין מזרק 1-mL אחד עם 1 מ"ל DMEM לניקוי השתל עורק, וריד ולהכין שני 1-mL-מזרקים עם וירוס פתרון (~ 0.5-0.7 מ ל וירוס פתרון/וריד שתל). תן המסייע להפשיר את הווירוס, למהול אותו ב- DMEM. להכין מזרק 3-mL אחד עם 0.5 מ של לידוקאין/נמשך (לערבב 50/50, שלב 1.2.4).
    5. בצע את שלב 2.1.8 תגובה-על ניתוח שתל הווריד.
  2. בידוד של שתלי העורק, בעורקים הסמוכים
    הערה: 2 x זכוכיות מגדלת כירורגי אמור לשמש עבור חלק זה.
    1. לחתוך את העור electrocautery לאורך הקו האמצעי בין החריץ בחזה ובצלעות הלסת התחתונה (כ 7-9 ס מ אורך), תהדק את העור חשוף עם מגבת מלחציים. 0.5 מ של לידוקאין/נמשך (לערבב 50/50, שלב 1.2.4) חלות על הרקמה התת עורית.
    2. בסוף סימטרית, לבצע חתך לרוחב קצר דרך fascia עם electrocautery. בלשון בוטה לנתח תחת fascia לאורך הקו האמצעי כולו. עם electrocautery, לחתוך דרך fascia גזור לאורך הקו האמצעי.
    3. להתחיל בצד ימין. לנתח בין השריר sternohyoid בשכבת-על קנה הנשימה לשריר sternocephalic בצורת V, כדי לחשוף את שתל הווריד. בזהירות לבודד את שתל הווריד של 1.5-2.0 ס מ של העורק הראשי הסמוך שהשתל על שני הצדדים הגולגולת ואת סימטרית.
    4. חזור על הקרע בצד שמאל בעקבות צעד 4.2.3.
  3. למדוד את זרימת הדם ב השתלים וריד.
    1. למלא את חלל פעירת בצד ימין עם תמיסת מלח כדי לאפשר את השידור של גלי קול. לטבול 2-מ מ perivascular זרימה בדיקה (מחובר מד נפח זרימה) בתמיסת המלח החלל הפצע ולהגדיר את קצב זרימת אפס.
    2. למקם את החללית זרימה סביב העורק הראשי סימטרית או הגולגולת שתל הווריד. נתוני הרשומה של החללית זרימה עם מערכת רכישת מידע אלקטרוני.
    3. חזור על המדידה זרימה בצד שמאל בעקבות צעד 4.3.2.
    4. לחשב את pulsatility המבוססת על קצב הזרימה סיסטולי שיא, קצב הזרימה הדיאסטולי מינימלי, קצב הזרימה מרושע. גם לחשב למינריות מאמץ גזירה, מבוסס על קצב זרימת קוטר לומן (נמדד עם אולטרסאונד transcutaneous).
  4. להשרות וקטור פתרון לתוך וריד את השתלים
    הערה: מיקרוסקופ כירורגי (16 X) משמש לצורך ניקב, אינפוזיה, והתיקון של העורק הראשי.
    1. יש עוזר להסיר זכוכיות מגדלת כירורגי של המנתח, יושינו, מיקרוסקופ כירורגי. יש לי את המנתח לעטוף מגבת נקיה על המיקרוסקופ. המגבת סטרילי מאפשר למנתח לתמרן המיקרוסקופ תוך שמירה על עקרות.
    2. יש המסייע הזרקת הפרין (150 IU/ק ג) הקטטר הרביעי, לשטוף עם מי מלח.
    3. השתמש נהג מחט גדולה כדי לכופף את המחט 21 G כ 80 ° מעל השיקוע (לא לכופף את השיקוע; איור 2A).
    4. תהדק את עורק תרדמני בקצה אחד של השתל וריד עם מיני-מלחציים, הצבת את המלחציים הגולגולת הראשונה כדי לאפשר את העורק מילוי, ולאחר מכן ממקם את הקליפ סימטרית. במקום הסרטון סימטרית כ 10 מ מ סימטרית כדי ההשקה, להשאיר קצת מקום arteriotomy.
    5. לשים שני קשרים משי סביב העורק סימטרית רק השתל, לקשור קשר עם יד אחת על כל אחד - ללא הידוק אותם.
    6. לנקב בעורק סימטרית כדי השתל עם מחט 21 G כפוף רק הגולגולת של הסרטון וסקולרית סימטרית. יש להיזהר לא לנקב את הקירות אחורי או צדדי. תוחבים את המחט לתוך לומן בחזרה וושוב פעמיים כדי להבטיח כי לומן הוא ברור, אז בזהירות לשלוף את המחט.
      הערות: ניקוב לעורק הצוואר נפוץ יכול להיות שנעזר לתפוס את adventitia עורקי עם מלקחיים בסדר ו בעדינות הרמת קיר חזית בעת הכנסת את קצה המחט סימטרית רק עד לנקודה מעלית (איור 2א). זה מפחית את הסיכון לפגיעה הקיר האחורי עם המחט.
    7. עם כמה תחבושות גזה פרש, ליצור קן כדי למקם את המזרק משמש חליטות. המקום הזה הקן גזה סימטרית באתר כירורגית.
    8. לשים 24 G הרביעי-צנתר על המזרק עם DMEM בלבד, והדק את הצנתר על המזרק מספיק כדי למנוע דליפה (המזרק יוסר מאוחר יותר בניתוח זה) לכופף את הצנתר ~ 4 מ מ מהקצה כך העיקול מחזיק כ 75° לאחר הפצתו.
    9. להכניס את צנתר הרביעי arteriotomy תרדמני נפוץ עד לנקודה בנד ולשטוף לומן שתל הווריד פעמיים עם 0.5 מ של DMEM. עבור כל חזרה, למלא את שתל הווריד DMEM. ואז להסיר את DMEM של השתל בלחיצה קלות עם האצבע בכפפה בקצה הגולגולת של השתל. החלק בזהירות את האצבע לקראת סוף השתל לחשוף את תוכן luminal ויה arteriotomy סימטרית.
    10. הסר את המזרק DMEM הקטטר, עוזב את הצנתר בתוך הכלי. לחבר את המזרק המכיל את הפתרון וירוס, מוודאים כי אין אוויר מזין את הקטטר. הזז שהמשי באופן רופף אניע קושר את העורק עד הם סביב קצה הקטטר, אך אין לחזק אותם.
    11. להשרות 0.03 נקודות מ של וירוס פתרון כדי לדחוף את DMEM שנותרו מחוץ הצנתר. הסר כל נוזל לומן שתל הווריד עם האצבע, הקשה בעדינות מתוך הגולגולת סימטרית.
    12. הדק את שני קשרים סביב קצה עורק, קטטר לאטום לומן. להשרות את הפתרון וירוס עד הווריד נפוחה. הנח בעדינות את המזרק על הקן של גזה.
      הערה: היא חיונית, כי שתל הווריד מתרחבת לקליבר קדם התמרה חושית שלו ונשאר מופרז במהלך החדרת וירוס. אם לא, כמות העברה גנטית תופחת באופן משמעותי.
    13. להשאיר את הפתרון המכיל וירוס לומן שתל הווריד במשך 20 דקות ולאחר מכן להחליף את המזרק המכיל וירוס המצורפת הקטטר עם מזרק ריק. בעדינות מחוק לגמרי הפתרון המכיל וירוס של השתל עד מכווץ כלי הקיבול. הסר את המזרק, עוזב את הצנתר במקום. לחתוך ולא להתיר התפרים משי ולסגת הקטטר מכלי הקיבול. הסר את הצנתר העורק הראשי בקפידה כדי למנוע נזק של אנדותל.
    14. בעזרת מיקרוסקופ כירורגי, סגור את arteriotomy 7-0 בתפר פוליפרופילן באמצעות תבנית X (איור 2B).
      1. לתפוס את התפר עם בעל מחט, הזן את כלי הקיבול בפינה הימנית התחתונה של arteriotomy ולצאת את כלי הקיבול בפינה השמאלית התחתונה. לחצות את הפתיחה מחוץ הספינה ולהפוך מעבר־ההרים השני מקצה עליון ימני ל השמאלית העליונה.
      2. לפני הידוק את התפר, בקצרה לשחרר את הקליפ וסקולרית הגולגולת ריקון אויר ווירוסים שיורית שתל הווריד, העורק. דם יזרום החוצה arteriotomy המלחציים ישוחרר.
      3. סגור arteriotomy על ידי משיכה עדינה את התפר מסתיים, לקשור אותם יחד עם 2 קשרים כיכר.
        הערה: מושך את התפר חזק מדי יגרום אגידה של הרקמה אשר להפריע את זרימת, להגביר את הסיכון פקקת, שעלולים להציג משתנים בלתי מבוקרת.
    15. שחרר את הקליפ כלי הדם לגולגולת, ולאחר מכן את הקליפ סימטרית. לעצור כל הדימום באמצעות גזה כדי להחיל לחץ קל
    16. באמת להזריק הבופרנורפין (SQ, 0.02 נקודות מ"ג/ק"ג) כדי לספק שיכוך כאבים לאחר הניתוח עד התיקון פנטניל סיפקה פנטניל כאבים פלזמה רמות.
      הערה: זריקה הבופרנורפין נוספים (SQ, 0.02 נקודות מ"ג/ק"ג) עשוי להיות נחוץ 6 שעות לאחר הזריקה הראשונה כדי לשמור על שיכוך כאבים עד פנטניל פלזמה מגיע ריכוז טיפולית.
    17. חזור על פרוטוקול אינפוזיה וירוס בצד שמאל, 4.4.5-4.4.15 השלבים הבאים.
  5. סגירת הפצע
    1. סגור את רקמת השומן התת עורית בתפר PGA 5-0, באמצעות תבנית רציפה. סגור את העור 3-0 בתפר PGA באמצעות תבנית intradermal. לקבור את הקשרים בשני הקצוות.
  6. ההחלמה לאחר הניתוח, ניקוי, טיפול
    1. בצע את שלב 2.4.

5. הקציר ניתוח (Terminal)

  1. להכין כלי הנגינה באתר כירורגית.
    1. בצע את השלבים 2.1.1-2.1.3 בניתוח שתל הווריד.
    2. תן המסייע פתיחת, גילוח ורחיצה כירורגית מקום על השולחן כלי (או תעביר את המנתח): אחד מ 20-ל מזרק אחד 21G, תפר משי 3-0, ומחט בדיקה זרימת דם סטרילי.
    3. בצע שלבים 2.1.5-2.1.6, 2.1.8 תגובה על הווריד שתל.
  2. בידוד נפוצים עורק, וריד שתלי
    1. לחתוך את העור electrocautery לאורך הקו האמצעי בין החריץ בחזה ובצלעות הלסת התחתונה (כ 7-9 ס מ אורך), תהדק את העור בצוואר של הארנב המגבות עם מגבת מלחציים.
    2. בסוף סימטרית, לבצע חתך לרוחב קצר דרך fascia עם electrocautery. בלשון בוטה לנתח תחת fascia לאורך הקו האמצעי כולו. לחתוך fascia גזור לאורך הקו האמצעי עם electrocautery.
    3. להתחיל בצד ימין. לנתח בין השריר sternohyoid המכסים את קנה הנשימה והשרירים בצורת V sternocephalic לחשוף את השתל הנפוץ עורק הצוואר ואת הווריד.
    4. לנתח את שתל הווריד הנכון ואת עורק תרדמני חינם מן הרקמות הסובבות. השתמש הסיליקון כירורגי לולאות עבור משיכת את העורק הראשי, של שתל הווריד בזמן.
    5. חזור על הקרע בצד שמאל בעקבות צעדים 5.2.3-5.2.4.
  3. לבצע מדידות הזרימה בעקבות צעדים 4.3.1-4.3.3 בניתוח העברת גנים.
  4. קציר שתלי הווריד
    1. בתפר משי 3-0, מאתרים ומפסיקים את. עורק תרדמני הגולגולת אל השתל. ואז מאתרים ומפסיקים בעורק סימטרית כדי השתל.
    2. לסלק את שתל הווריד הנכון על-ידי חלוקת את העורק הראשי הסמוך כל אחד ligations בין ההשקה סמוכים. הסר את שתל הווריד את הארנב ותורידי לומן עם תמיסת מלח.
    3. לחתוך את העורק הראשי ואת חיבור משני קצוות שתל הווריד. לקצץ משם רקמת adventitial עודף שתל הווריד וחותכים השתל למקטעים לפי הצורך עבור ניתוחים endpoint שונה.
    4. לקצור את שתל הווריד השמאלי חוזרת שלבים 5.4.1-5.4.3.
  5. להזריק 1 מ"ל של פניטואין/פנטוברביטל הרביעי להרדים את הארנב.
  6. תשליך בפרוטוקולים הבאים פסולת כלשהי המתאימה עבור סילוק פסולת חומרים מסוכנים, שרפ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יש לאמת את מיומנות טכנית של מפעיל חדש לפני האופרטור באפשרותך להשתמש בשיטה זו כדי ליצור נתוני הניסוי. אבן הדרך הראשונה זה מפעיל חדש חייב להשיג הוא patency שתל הווריד עקבי אחרי הניתוח הראשוני הרכבה וריד והן את הניתוח מושהית-התמרה חושית עוקבות. Patency מעל 90% לאחר כל אחד הניתוחים רצויות ואפשריות. Patency יכול להיות מוערך לא-פולשנית באמצעות אולטרסאונד transcutaneous, אשר אנו בדרך כלל מופיעים עם 5-7 יום לאחר הניתוח. ב הארנבים עם ורידים פטנטים, הבחינה אולטרסאונד יחשפו לכלי דם גדולים עם זרימת הדם בריסק סימטרית-כדי-גולגולתי משני צידי הצוואר הקדמי (איור 3א). אם באחת השתלים הווריד הוא occluded, יהיה אין זרימת דם סימטרית-כדי-גולגולתי לזיהוי על side(s) עם השתל occluded. עם זאת, זרימת הדם הגולגולת-כדי-סימטרית עדיין יזוהו בווריד הצוואר הפנימי (איור 3ב).

אבן הדרך השנייה זה מפעיל חדש חייב להשיג היא התמרה חושית יעילה של תאי אנדותל שתל הווריד. . הנה, וקטור adenoviral המבטאת β-galactosidase משמש כדי להעריך את היעילות של העברה גנטית אנדותל. מפעיל חדש במעבדה שלנו transduced שתלי העורק עם אדנו המבטאת β-galactosidase (AdnLacZ) בשיטות המתוארות. השתלים היו שנקטפו 3 ימים לאחר התמרה חושית ולחתוך לחלקים. כמה קטעים היו מוכתמים 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל). פנים en הדמיה של משטחים luminal הראה שתלי העורק עם התמרה חושית יעילה (איור 4א), התמרה חושית המסכן (איור 4B). להעריך עוד יותר את מיומנות של מפעיל חדש, β-galactosidase mRNA של תמציות של השתל וריד transduced גם נמדדת באמצעות PCR כמותי בתיווך רוורס טרנסקריפטאז, נורמליזציה האות לרמה של גליצראלדהיד פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) mRNA למדוד השתלים באותו וריד.

הרמות של β-galactosidase mRNA של שתלי העורק transduced על ידי מפעיל חדש לא היו שונים באופן משמעותי רמות ה-β-galactosidase mRNA של שתלי העורק transduced על ידי מפעיל מנוסה (איור 5). אם ה-mRNA דגימות השתלים וריד transduced על ידי אופרטור מנוסים אינם זמינים עבור השוואה, שתלים שתל הווריד שליטה שלילי ש-mrna יכול להיווצר על-ידי transducing וריד עם וקטור שליטה שאינו מביע (AdNull). אנחנו מצאו כי רמות β-galactosidase mRNA כלומר תקחי את שתלי transduced על ידי מפעיל מנוסה גבוהים כ 1,000-fold האות ה-PCR רקע עבור β-galactosidase mRNA נמדד שתלי AdNull-transduced (איור 5) .

Figure 1
איור 1 . הצבת הפוכה נכון חיצוני ומוחלף לימין נפוצות העורק השתלה עם חיבור הקצה לצד. שתל הווריד (כחול) מאוחה ל עורק תרדמני (אדום)-חיבור שני. ב כל ההשקה, תפרים (לבן האיקסים) ממוספרים לפי הסדר שבו הם ממוקמים. שני הצדדים של. חיבור תפר התפרים 1 בסוף arteriotomy על עורק הצוואר סימטרית. לתפור 2 תפרים סוף הגולגולת arteriotomy על עורק הצוואר. תפר 3 מושם על הצד הלטראלי של ההשקה בנקודה במרחר שווה התפרים שני הראשונים. בהידוק 4 ימוקם בצד המדיאלי של ההשקה, קו מקביל של התפרים הראשון שני ומול תפר 3. ארבעה נוספים תפרים (תפרים 5-8) ממוקמים באמצע הדרך בין התפרים קיימים ארבעה. המקטע העורק הראשי בין חיבור זה מאתרים בשני קצותיו בתפרים משי 3-0 (חיצים) וחילקו (קו מקווקו) באמצע הדרך בין ליגטורות. צד שמאל שתלים מבוצעים באופן דומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . היצירה ואת סגירת העורק arteriotomy. (א) adventitia נפוצות העורק הראשי הוא אחז ליד שתל הווריד עם מלקחיים בסדר, גרירה כלפי מעלה מוחל על הקיר העורק. זה יוצר משטח אנכי, ומאפשר את המחט 21 G כפופות שיוכנס כ מקביל לומן כלי השיט, הפחתת הסיכון של תקר הקיר האחורי של העורק. (B) arteriotomy מאוחה באמצעות פוליפרופילן 7-0 ב- X-דוגמת מילוי. המעבר תפר הראשון נכנס לומן עורק בתחתית נכון arteriotomy (אתר 1) ויוצא לומן בפינה השמאלית התחתונה (אתר 2). התפר מכן חוצה את arteriotomy. המסירה מחדש נכנס לומן בפינה הימנית העליונה (אתר 3), ויוצא לומן בפינה השמאלית העליונה (אתר 4). המתיחה בעדינות את קצה התפר (הקצוות לצאת מן האתר 1 והאתר 4) סוגר את arteriotomy. הקצוות תפר קשורות עם 2 קשרים כיכר. העיגולים הכחולים מוצק מציינים את המיקומים איפה התפר חודר הקיר עורקי. הקווים הכחולים מוצק מציינים היכן עובר התפר מחוץ לקיר העורקים; קווים כחולים מנוקדים מציינים כי התפר ממוקם בתוך לומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . תמונות אולטרסאונד transcutaneous של הארנב הצוואר, הערכת הווריד שתל patency 5-7 ימים לאחר הרכבה. (א) פטנט שתל הווריד (אדום) עם זרימת דם בכיוון סימטרית-כדי-גולגולתי היא המצוין (חץ). (B) מתעכבת הווריד שתל. אין זרימת דם סימטרית-כדי-גולגולתי (אשר להופיע האדומים) מזוהה. הפנימי, ווריד הצוואר (כחול) עם זרימת דם בכיוון הגולגולת-כדי-סימטרית מסומן (כוכבית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . בטא-galactosidase transgene ביטוי שתלי העורק. 28 ימים לאחר השתלת עור, ארנב וריד שתלי היו transduced על ידי הדגירה 20-מין של וקטורים adenoviral לבטא β-galactosidase בתוך לומן שתלי וריד בניתוח מבודד. שתלי העורק שנקטפו 3 ימים לאחר התמרה חושית, מוכתם 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (א) פנים En תמונה של פני השטח luminal של קטע וריד מציג התמרה חושית יעילה. (B) פנים En תמונה של פני השטח luminal של קטע וריד מציג התמרה חושית המסכן. סרגל קנה מידה = 1.0 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . ביטוי של בטא-galactosidase (β-גל) transgene ה-mRNA בקטעים שתל הווריד. 28 ימים לאחר הצבת ומוחלף שתלי interposition ב הארנב לעורק הראש השתלים היו transduced עם וקטור adenoviral לבטא בטא-galactosidase (AdnLacZ) או עם וקטור adenoviral שליטה המבטאים לא של transgene (AdNull ). ניתוחים הושלמו על ידי מפעיל מנוסה (מנתח 1) או מפעיל חדש (2 המנתח). שתלי העורק transduced עם AdnLacZ היו כל 3 ימים שנקטפו לאחר התמרה חושית. RNA מופק שתלי transduced עם AdNull וקצרו 14 ימים לאחר התמרה חושית נותחו גם, כפקד שלילי. הביטוי של בטא-galactosidase mRNA הייתה לכמת באמצעות PCR בתיווך רוורס טרנסקריפטאז כמותית, עם ערכי מנורמל ל גליצראלדהיד פוספט דהידרוגנאז mRNA נמדד תמציות אותו, המבוטא ביחידות שרירותי (AU). ברים לציין ערכי רשע; p ערכים הם מבדיקות סכום-דרגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את הניהול של הרדמה, נוגד קרישה, ניתוח מניפולציה של הווריד של עורק/הושתל, בגרימת מדידות של הווריד של המושתל. ניהול נכון של הרדמה היא קריטית במודל זה מרובים הישרדות ניתוח הכולל שתי פעולות ארוכות יחסית (בדרך כלל 3-3.5 h על הווריד הדו-צדדיים הרכבה ו- 1.5-2.5 h עבור שתל הדו-צדדיים התמרה חושית). יש מנוהל הרדמה ויה nosecone והן על ידי צנרור אנדוטרכאליות ואנו נמצא כי צנרור שיפור ההישרדות לאחר הניתוח התמרה חושית שתל, ואולי כי ללחוץ אוורור מונע את תמט הריאות, הקשורים . כשל נשימתי ארנבים הם מאתגרים לצנרר, דרכי הנשימה הקשורות צנרור טראומה יכול לגרום סטרידור שלאחר הניתוח. עם זאת, האתגרים ואת הסיבוכים של צנרור הם מחיר קטן לשלם לטובת סילוק רוב perioperative התחלואה והתמותה הקשורים לניתוח grafting וריד.

בדיקות דם הוא חיוני כדי למנוע את פקקת של הורידים המושתל, אשר יכול להתרחש לאחר שגם של הניתוחים הישרדות. פקקת נראה אירוע לאחר הניתוח מוקדם, כי השתלים וריד כי הם פטנטים על בדיקה אולטרסאונד transcutaneous 5-7 ימים במשככי כמעט תמיד פטנטים-קציר. כדי למנוע את טרומבוזה לאחר הניתוח הראשון (כלומר., הווריד הרכבה), הפארין הרביעי הוא מנוהל לפני הקציר ומוחלף חיצוני על הראשונה. בהתבסס על פלזמה half-life של הפארין בארנבים (1-2 h), חצי מנה נוספת של הפארין הרביעי ניתנת לפני הקציר ומוחלף חיצוני על contralateral. בנוסף, עד שני. חיבור עורקית של שתל הווריד בודדים הושלמו, מזרימים לומן של העורק הראשי, של שתל הווריד כ כל 8 דקות עם תמיסת מלח heparinized. למניעת פקקת שתל, כדאי לשים לב שלא יגרמו נזק את הווריד שתל-במיוחד אנדותל-במהלך הקטיף, הרכבה. זה כולל טיפול הווריד של כלי ניתוח עדין ומשאיר שכבה דקה של רקמת שומן adventitial מצורף לוריד. גם מחלקים מנה אחת של papaverine אקטואלי העורק המושתל, למניעת או vasospasm הפוכה, אשר יכול לתרום פקקת.

הקפדה על טכניקה כירורגית נדרש במהלך הווריד הרכבה ניתוח. כדי למנוע דימום ב. חיבור של שתל פקקת, כניסתה של משתני והמודינמיקה בלתי מבוקרת, arteriotomies שני חייב להיות באורך המתאים. אם arteriotomy קצר מדי, החומה וריד שתל ostial יהיה מיותר באתר של ההשקה, יצירת פערים לאפשר דימום. אם arteriotomy זה יותר מידי, מותח את הווריד כדי לכסות את arteriotomy יביא הווריד שתל קירות בסמיכות, ומקשה על המנתח להימנע תפירת הווריד מנוגדות של שתל קירות ביחד (בעיקרו של דבר המבטיח לאחר הניתוח פקקת). יתר על כן, אם לומן שתל הווריד הוא הצטמצם בגלל הווריד היה נמתח כדי לכסות על arteriotomy ארוכים מדי, היצרות ייווצר זה מגביר גזירה predisposes פקקת33, פוטנציאל הפיצולים התוצאה משתנים כגון 34,שיפוץ כלי הדם35וצמיחה של neointimal. בנוסף, חשוב להימנע ידביקו פיתולים שתל הווריד, אשר יכול לגרום לומן היצרות או זרימה לא נורמלי. כדי לסייע למנוע פיתול של השתל, אנחנו תמיד ליישר על קטע וריד על פני הגחון עורק תרדמני ולהבטיח ללא פיתולים בווריד. בשל הסיכון משתנה טכניקה כירורגית לשנות הווריד שתל ספיקת הדם, כי שינו ספיקת הדם יכול להשפיע על התוצאה משתנים ללא תלות הטיפול, אנו מודדים באופן שגרתי דם קוטר זרימה, שתל לפני וקטור אינפוזיה, ב זמן הקציר. אנו משתמשים בערכים אלה כדי לחשב גזירה ו- pulsatility. וריד שתלים עם מדידות והמודינמיקה מחוץ טווחים מראש יכול לא ייכללו באופן אובייקטיבי ניתוח נוסף, להקטין את השתנות ניסיוני, הגברת עוצמה סטטיסטית.

כפי פיתחנו שיטה זו, עשינו מספר שינויים. בתחילה, לנו ניסיון העברה גנטית שתל הווריד במהלך פעולת grafting. עם זאת, בנסיבות אלה, transgene ביטוי אבד כמעט לחלוטין על ידי 3 ימים לאחר העברת גנים22. הביטוי Transgene אבד במהירות היה transduced בחיי עיר ואם אז הושתל קטע וריד או אם הווריד היה הושתל לראשונה ולאחר מכן transduced. רק על ידי עיכוב התמרה חושית עד לאחר שתל הווריד היה מותאם הדם העורקי (חיכינו עד 28 ימים לאחר הרכבה לבצע העברה גנטית, למרות עיכוב קצר יכול להיות אפשרי), היה אובדן מהיר של הביטוי transgene להימנע22 . אנחנו גם המרה מן ההרדמה המועבר nosecone אנדוטרכאליות המועבר צינור ההרדמה לניתוח (העברה גנטית) השני לאחר שנוכחו מקרי מוות פוסט ניתוחית, לאחר הניתוח. בנוסף, לאחר היתקלות לדלקת ריאות השאיפה לכאורה בארנב לאחר הניתוח, התחלנו להציב שולחן פלסטיק קטן מעל הבטן של הארנב (תחת הווילונות סטרילי). השולחן היה בעמדה כדי למנוע המנתח בשוגג נשען על הבטן של הארנב, פוטנציאל גירוי ריפלוקס ושאיפה. היו לנו אירועים שאיפה יותר אחרי המיקום של הטבלה. עם זאת, בגלל המיקום הזה בד בבד עם המעבר צנרור אנדוטרכאליות, איננו יכולים להיות בטוחים התערבות אשר אחראי על חיסול השאיפה אירועים.

בשיטה זו יש גם מגבלות. בארצות הברית, השימוש של ארנבים במקום מכרסמים מחייבת עמידה בדרישות חוק רווחת בעלי חיים מעבדה משנת 1966. בהתאם לכך, חוקרים באמצעות ארנבים (או חיות אחרות מכוסה על ידי מעשה זה) חייב יש חדרים מצוידים היטב, הפעלה, מרדימים מומחים, לספק רמה גבוהה של פיקוח לאחר הניתוח וטיפול. המגבלה השנייה היא כי 2 ניתוחים נדרשים כדי להבטיח את הביטוי עיקש transgene22. הניתוח השני מגבירה את העלות של ניסויים וחושף כל ארנב כדי ערכה נוספת של פוטנציאל פעיל וסיבוכים perioperative. עם זאת, איננו מודעים כל אחרים גישה העברת גנים משיג transgene עמיד ביטוי שתלי העורק. המגבלה השלישית של שיטה זו הוא כי הוא דורש מומחיות הבנייה של וקטורים HDAd והכנה של מניות HDAd כייל גבוה. מעבדות רבות יש מומחיות עם הדור הראשון adenoviral, lentiviral, adeno-הקשורים וקטורים (AAV) ויראלי, אבל מעטים יחסית יש ניסיון עם HDAd וקבוצות בדרך כלל צריך להקים בשיתוף פעולה להשגת מומחיות זו. תחולתה הקלינית של השיטה גם עלולה להיות מוגבלת. על בני אדם, ניתוח נוסף להעלות את הסיכון הן את העלות והן את הסיבוך. בנוסף, לעומת האדם הורידים saphenous גדולות (המשמש לניתוח מעקפים כלילית והיקפי), ארנב חיצוני וריד הצוואר וורידים יש קירות דקים מאוד. זה אפשרי כי הקיר עיבוי ו שיפוץ זה מתרחש לאחר הרכבה של הארנב חיצוני ומוחלף למחזור הדם העורקי להיות attenuated אם שתל הווריד כבר יש קיר עבה יותר. לבסוף, בניסויים במודל זה, שנמשך עד 6 חודשים, אף אחד הורידים המושתל פיתח היצרות22. לכן שיטה זו אינה מופיעה לדגמן את כל התהליכים הביולוגיים שתורמים הווריד כישלון השתל.

לסיכום, שיטת משתמשת מודל בעלי חיים חזקים של מחלת כלי דם אנושי (שפנים) כדי ליצור ורידים המושתל בו transgenes מבוטא stably לתקופות ממושכות של זמן (לפחות 6 חודשים)22. ביטוי יציב של transgenes בתוך הווריד שתלי תחשוף תפקידיהם וריד נורמלי להשתיל הומאוסטזיס, נבאר שלהם פוטנציאל ריפוי גנטי שתל הווריד. השיטה יכול להיות שיפור ועשה יותר קליניות החלים על ידי הפיתוח של טכניקות המאפשרות מלעורית מסירת וקטורים שתל הווריד, ובכך למנוע את הניתוח השני. טכניקות אלה ייתכן ספירליים36,37, או שהם יכולים לשלב וקטורים שהוכן במיוחד מוזרק לווריד היקפיים, ממוקד מכן לקיר שתל הווריד, לדוגמה על ידי שדות מגנטיים38. השיטה תאפשר גם בדיקה של וקטורים חוץ HDAd עבור שתל הווריד טיפול גנטי, כולל lentiviral ו AAV וקטורים, כמו גם נגיפי וקטורים. 39 , 40 , 41 , 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposables
3mL syringe with 24G needle Becton Dickinson 309571 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needle Becton Dickinson 309623 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needle Becton Dickinson 305187 Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lock Nipro Medical Corp JD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4” Terumo Medical Products SROX2419V
21G needle Becton Dickinson 305165 Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4” Dynarex 3242 ~10-15 per surgery
3-0 silk suture Covidien Ltd. S-244
5-0 silk suture Covidien Ltd. S-182
7-0 polypropylene suture CP Medical 8703P Vein graft surgery
7-0 polypropylene suture CP Medical 8648P Gene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid suture CP Medical 421A
3-0 polyglycolic acid suture CP Medical 398A
Alcohol swabs Covidien Ltd. 6818 For the placement of I.V. line
Catheter plug Vetoquinol 411498
Ketamine HCl, 100 mg/mL Vedco Inc. 5098916106
Xylazine, 100 mg/mL Akorn Inc. 4821
Lidocaine, 20 mg/mL Pfizer 409427702
Marcaine 0.5% Pfizer 409161050
Beuthanasia D-Special Intervet Inc. NDC 00061047305 Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL Patterson Veterinary 12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride Baxter 2B1309
Heparin  (5000 U/mL) APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml) American Reagent Inc. NDC 0517-4002-25 Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/h Apotex Corp. NDC 60505-7006-2
Isoflurane Multiple vendors Catalog number not available
 Viral vector Gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight Roboz RS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt Roboz RS-6828
Needle holder /w suture scissors Miltex 8-14-IMC
Castroviejo scissors Roboz RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock Roboz RS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt Roboz RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs Roboz RS-6514 2x
Backhaus towel clamp 3.5" Roboz 4x
Micro clip setting forceps 4.75" Roboz RS-6496
Micro vascular clips, 11 mm Roboz
Surg-I-Loop Scanlan International 1001-81M 5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width Roboz RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm Roboz RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip Roboz RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tips Roboz RS-7110 2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips Roboz RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips Roboz RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips Roboz RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width Roboz RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width Fine Science Tools 11092-12 2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight Fine Science Tools 11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode MACAN Manufacturing HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump Multiple vendors Catalog number not available
Bair hugger warming unit 3M Model 505
IV infusion pump Heska Vet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavenger Multiple vendors Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor Surgivet Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit MACAN Manufacturing MV-9
Surgical microscope D.F. Vasconcellos M900 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
  2. Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
  3. Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
  4. de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
  5. Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
  6. Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
  7. Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
  8. Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
  9. Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
  10. Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
  11. Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
  12. Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
  13. Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
  14. Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
  15. Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
  16. Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
  17. Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
  18. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
  19. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
  20. Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
  21. Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
  22. Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
  23. Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
  24. Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
  25. George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
  26. Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
  27. Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
  28. Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
  29. Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
  30. Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
  31. Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
  32. Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
  33. Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
  34. Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
  35. Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
  36. Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
  37. Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
  38. Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
  39. Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
  40. Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
  41. Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
  42. Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).

Tags

רפואה גיליון 139 מודלים חייתיים של מחלות אנושיות טרשת עורקים ריפוי גנטי מחקרים translational ארנב עורק הצוואר עורק תרדמני interposition הווריד שתל מחלת כלי דם אדנו אדנו תלויי-עוזר.
דגם ארנב של ביטוי Transgene עמיד ומוחלף כדי שתלי Interposition נפוצים של העורק הראשי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bi, L., Wacker, B. K., Dichek, D. A. … More

Bi, L., Wacker, B. K., Dichek, D. A. A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts. J. Vis. Exp. (139), e57231, doi:10.3791/57231 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter