Summary
Deze methode beschrijft de plaatsing van de spreekbeurt ader enten bij konijnen, de transductie van de transplantaties en de verwezenlijking van duurzaam transgenic expressie. Hierdoor kan het onderzoek van fysiologische en pathologische rollen van transgenen en hun eiwitproducten in geënte aderen, en het testen van gentherapieën voor ader graft ziekte.
Abstract
Ader graft bypassoperatie is een gemeenschappelijke behandeling voor occlusieve arterieel vaatlijden; succes op lange termijn wordt echter beperkt door het transplantaat niet als gevolg van trombose, intima hyperplasie en atherosclerose. Het doel van dit artikel is om aan te tonen van een methode voor bilaterale veneuze spreekbeurt protheses te plaatsen in een konijn, dan transducing de transplantaten met een gen overdracht vector die duurzaam transgenic expressie behaalt. De methode kan het onderzoek van de biologische functies van genen en hun eiwitproducten in normale ader graft homeostase. Hierdoor ook het testen van transgenen voor de activiteiten die ader graft failure, bv voorkomen kunnen., of de uitdrukking van een transgenic voorkomt de groei van de neointimal, vermindert de vasculaire ontsteking of vermindert atherosclerose bij konijnen gevoed met een hoog-vet dieet. Tijdens een eerste overleving chirurgie, zijn de segmenten van de rechter en linker halsslagader externe weggesneden en bilateraal als omgekeerde end-to-side gemeenschappelijke halsslagader spreekbeurt transplantaten geplaatst. Tijdens een tweede overleving operatie, uitgevoerd 28 dagen later, elk van de protheses is geïsoleerd van het verkeer met vasculaire clips en de lumen (via een arteriotomy) zijn gevuld met een oplossing die een helper-afhankelijke adenovirale (HDAd) vector. Na een incubatie 20-min is de oplossing van de vector aanzuiging, de arteriotomy is hersteld, en stroom is hersteld. De aderen worden geoogst op tijdstippen die zijn ingegeven door individuele experimentele protocollen. De 28-daagse vertraging tussen de plaatsing van de prothese en de signaaltransductie is noodzakelijk om de aanpassing van de ader prothese aan de arteriële circulatie. Deze aanpassing voorkomt snelle verlies van transgenic expressie dat zich in de ader transplantaten getransduceerde vóór of onmiddellijk na het enten voordoet. De methode is uniek in zijn vermogen om duurzame en stabiele transgenic expressie in geënte aderen. Vergeleken met andere grote dieren ader graft modellen, hebben konijnen voordelen van lage kosten en gemakkelijk behandeling. Vergeleken met knaagdier ader graft modellen, hebben konijnen groter en gemakkelijker te manipuleren bloedvaten waarmee overvloedige weefsel voor analyse.
Introduction
Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte, waarin lipide accumulatie en ontsteking in de wand van het bloedvat leiden tot vernauwing van het vaartuig lumen, hartaanvallen, beroertes en verlies van ledematen1,2. Percutane interventies (bv., angioplasty en stenting) en medische therapie (bv., statines en antiplatelet agentia) zijn nuttig behandelingen voor atherosclerose; Nochtans, zijn zij vaak ineffectief bij de behandeling van ernstige obstructieve ziekte, zowel bij de coronaire en perifere circulatie. Rondweg enten, met behulp van autogene ader segmenten, blijft een gemeenschappelijke procedure voor de behandeling van patiënten met ernstige, diffuse coronaire en perifere vaatziekten3,4. Echter ader transplantaties in zowel de coronaire geplaatst en perifere circulaties hebben slechte langetermijnrente bij. In de coronaire circulatie, zijn ongeveer 10-20% van de ader transplantaties zijn geroteerd op 1 jaar en 50% geroteerd door 10 jaar5,6. In de perifere circulatie zijn ader graft uitval 30-50% op 5 jaar7.
Gentherapie is een aantrekkelijke aanpak voor de preventie van veneuze graft falen omdat het een therapeutisch gen product precies op de plaats van de ziekte kan leveren. Dienovereenkomstig, talrijke Preklinische studies hebben getest ader graft gene therapie8,9. Echter hebben in wezen alle van deze studies onderzocht de werkzaamheid bij vroege tijd punten (2-12 weken)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. Wij weten geen bewijs dat gentherapie interventies duurzaam kunnen bieden (jaar) bescherming tegen eind ader graft storing, die meestal het gevolg van neointimal hyperplasie en atherosclerose4. Ontwikkelden we een methode die kunt duurzaam transgenic expressie in geënte aderen en waardoor het testen van gentherapie interventies op late evenals vroege tijd punten. Om te bereiken duurzaam transgenic expressie, bevat de methode HDAd vectoren en een vertraagde transductie strategie. HDAd vectoren bieden langdurige transgenic expressie wegens hun gebrek aan virale genen, voorkomen van de erkenning (en de afwijzing) van getransduceerde cellen van het immuunsysteem18,19,20, 21. vertraagde transductie (uitgevoerd 28 dagen na de plaatsing van de prothese) voorkomt het verlies van getransduceerde cellen tijdens het arterialization proces dat vroeg na de praktijk22 plaatsvindt.
Andere methoden die therapeutische transgenic expressie in de ader graft muur bereiken afhankelijk van de transductie van de prothese ader op het moment van het transplantaat plaatsing10,11,12,15,16 ,17. Wanneer gemeten serieel, daalt transgenic expressie met behulp van deze aanpak snel na de signaaltransductie22,2-3. Dienovereenkomstig, studies met deze aanpak niet onderzocht de werkzaamheid buiten 12 weken na de ader enten, met de meeste niet beoordeling van de werkzaamheid buiten 4 weken. Daarentegen onze methode behaalt ader graft transgenic expressie die stabiel gedurende ten minste 24 weken en-op basis van vergelijkbare studies uitgevoerd blijft slagaders waarschijnlijk blijft veel langer22,24. We kennen geen andere ader graft gene therapie interventie die stabiele transgenic uitdrukking van deze duur bereikt.
We gebruikten een konijn model onze methode te ontwikkelen. Anderen hebben knaagdieren, konijnen, gebruikt of grotere dieren voor het testen van de ader graft gene therapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Ten opzichte van knaagdier modellen, konijnen zijn duurder en strengere voorschriften gelden. Echter, vergeleken met grotere dieren (bv., varkens en honden), konijnen zijn veel minder duur om te kopen en huis en veel gemakkelijker te hanteren. Bovendien lijken konijn vaartuigen op menselijke schepen fysiologisch27, ze zijn groot genoeg dat ze kunnen worden gebruikt voor het testen van percutane interventies28,29, en ze voldoende weefsel dat bieden meerdere eindpunten (bv., histologie, eiwitten, RNA) kan worden onderzocht met behulp van een enkele bloedvat specimen22,30. Bovendien, wanneer de konijnen met ader transplantaties zijn gevoed met een hoog-vet dieet, ontwikkelen ze ader graft atherosclerose31,32, die is een veelvoorkomende oorzaak van coronaire bypass ader graft failure4,5 . Deze atherosclerotische konijn ader protheses kunnen dienen als substraat voor het testen van gentherapie interventies geleverd met deze methode. Het meegeleverde protocol kunt onderzoekers om de technische vaardigheden nodig zijn om duurzame transgenic expressie in konijn ader transplantaten meester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke protocollen en studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Washington Office van het welzijn van dieren.
1. pre operatie (voor alle operaties)
- Anesthetize het konijn met 30 mg/kg ketamine en 1,5 mg/kg xylazine door intramusculaire injectie (IM) in de paraspinous spieren.
Opmerking: Voedsel en water geen beperkende maatregelen gelden voor de operatie. - De tabellen in het bereidingslokaal en operatiekamer (OR) instellen terwijl u wacht voor voldoende diepte van anesthesie.
- Voorbereiding van het bereidingslokaal voor het scheren van de rabbit's nek en de plaatsing van de intraveneuze (IV)-poort in het oor (alleen overleven chirurgie). Plaats de oogheelkundige zalf fentanyl patch (overleving chirurgie), tondeuses, alcohol prep pad, 24-G x ¾" katheter, injectie-poort en chirurgische tape op de tafel van de voorbereiding.
- In de OR, instellen van de bewakingsapparatuur en bijbehorende sondes (elektrocardiogram (EKG), oxymetrie (SpO2) van de pols en temperatuur). Voorbereiden van de IV-pomp met 100 mL zoutoplossing IV en cadeauzakje met een 18-G of 19-G naald en stel het debiet als 10 mL/h/kg (alleen overleven chirurgie). Instellen van de zuurstof en Isofluraan apparatuur met een neuskegel (ader enten of oogst chirurgie).
- Om te helpen veilig de neuskegel aan het konijn, lus een gaas-strook rond de buis van Eustachius gas aan de neuskegel levert. Deze lus moet omringen de buis waar hij aan de neuskegel hecht. De vrije uiteinden van de strook gaas moeten beide ongeveer 45 cm lang worden. Plaats de neuskegel (met bijgevoegde gaas) op het hoofd einde van de tabel.
- Inschakelen van het circulerende water en/of gedwongen lucht opwarming van de aarde deken op de tafel van de OR. Op de opwarming van de aarde deken, plaatst u een opgerolde handdoek als een ondersteuning van de nek en de elektrocauterisatie dispersief elektrode plaat plaatsen.
- Als een lokale pijnstillende, combineren in een injectiespuit 1 mL 2% lidocaïne HCl en 1 mL 0,5% bupivacaine HCl. Verdun het virus aan de gewenste concentratie (hier, het gebruik van 2 x 1011 virale deeltjes/mL voor HDAd) in steriele DMEM en blijven op het ijs (alleen gene overdracht chirurgie).
- Nadat een voldoende verdoving diepte is bereikt, voorbereiden op het konijn chirurgie.
Opmerking: Test voor het ontbreken van een pedaal terugtrekking reflex om voldoende verdoving diepte. Blijven volgen van de pedaal reflex gedurende de operatie.- Ophthalmic zalf toepassen door de ogen van het konijn.
- Als u wilt toestaan voor de plaatsing van een rectale temperatuursonde, druk op met gehandschoende vingers net boven het rectum en bewegen van de vingers naar de anus te verwijderen stooling van het konijn in de endeldarm.
- Scheren het konijn uit de sternale inkeping aan de rand van de onderkaak. Het scheren van één oor voor de plaatsing van de IV en het tegengestelde oor voor fentanyl patch beheer (alleen overleven chirurgie). Scheren van de linker achterzijde middelste tenen voor de plaatsing van de SpO2 sonde.
- Intubate voor vector infusie chirurgie, het konijn. Gebruik een 4 mm O.D./3 mm endotracheale buis I.D. stam, schroefdraad over een arthroscope. Plaats van het konijn in sternale lighouding en hyper-uitbreiding van de nek. De rabbit's mond wijd open te houden en de arthroscope kunt visualiseren de glottis en laryngeal plooien. Tijdens de inspiratie, zachtjes invoegen de endotracheale buis in het strottenhoofd en de luchtpijp.
- Voor de operaties van de overleving, plaatsen en het beveiligen van een 24-G IV-katheter in de rabbit's linker oor ader en het kapje met een injectie-poort. Een 25 µg/h fentanyl patch toepassen op het rechteroor van het konijn.
Opmerking: Het protocol is voor een chirurg gepositioneerd aan de rechterkant van het konijn. Als de chirurg aan de linkerzijde van het konijn worden zal, keren de zijkanten in deze stap de draden en IV tegenover van de chirurg te houden. Switch de kanten in toekomstige stappen zo nodig. - Voor de ader beheren enten en oogst chirurgie, algemene anesthesie met een neuskegel; beheren voor de vector infusie chirurgie, algemene verdoving via een endotracheale buis.
Opmerking: Intubatie kan worden gebruikt voor alle operaties. In onze ervaring, echter het risico op complicaties van de trachea en laryngeal trauma's tijdens intubatie kunnen opwegen tegen de voordelen van intubatie. De operatie waarin genoverdracht op een prothese (met name in cholesterol-gevoed konijnen) is de enige operatie in welke intubatie lijkt te bieden een netto uitkering. - Het voeren van het konijn in de UPR's. Plaats het konijn in een liggende positie op de operatietafel met de nek ondersteuning handdoek geplaatst net onder de rabbit's hoofd. Zachtjes uitbreiden van het konijn nek tot het rechte en ongeveer horizontaal.
- Plaats de neuskegel naar het konijn (ader enten en oogst chirurgie) of Verbind de Endotracheale tube (vector infusie chirurgie) met O2 in 1 L/min, en begin van Isofluraan. Als met behulp van een neuskegel, beveiligt u het door de uiteinden van de bijgevoegde gaas strips rond de rabbit's nek ondersteuning handdoek wikkelen. Pas de Isofluraan concentratie zo nodig (meestal 1-2%) te handhaven een chirurgische anesthesie.
- Hiermee centreert u de elektrocauterisatie dispersief elektrode plaat onder de rug van het konijn. Invoegen van de rectale temperatuursonde en gelden de SpO2 sonde en EKG leidt voor het konijn.
- De zoute IV-lijn aansluit op de poort van de katheter in de rabbit's linker oor en beginnen de IV-infusiepomp bij 10 mL/h/kg. Na 1 uur, de zoute infusiesnelheid te verminderen tot 5 mL/h/kg.
- Losjes de voorste poten van het konijn op de operatietafel te binden als een beperking.
Opmerking: Eventueel een kleine kunststof tafel kan worden geplaatst over het konijn om te voorkomen dat de chirurg te drukken op de rabbit's borst/buik, en potentieel veroorzaken gastro-oesofageale reflux en aspiratie. - Lidocaïne/bupivacaine (2 mL, 50/50 mix, stap 1.2.4) subcutaan injecteren (SQ) in de nek langs de lijn van de geplande incisie, voor plaatselijke verdoving.
- De Office-assistent desinfecteren de chirurgische site met 3 afwisselend scrubs van chloorhexidine gluconaat en isopropanol en spuiten van de site met Povidon-jodium. Heb de chirurg scrub, jurk en handschoen, aseptische beginselen na.
- Uitvoeren van overleving operaties onder aseptische condities. De Office-assistent niet-steriele artikelen, verwerken en doorgeven aseptisch steriele materialen aan de chirurg of aseptisch plaats ze op de tafel gedrapeerd instrument hebben.
- Heb de chirurg gebruik steriele handdoeken om te manipuleren aseptisch ongesteriliseerd apparatuur zoals de Microscoop. Heb de chirurg 2 x chirurgische loupes dragen tijdens het uitvoeren van de eerste helft van de operatie.
2. ader prothese chirurgie (overleving)
- De instrumenten en steriele veld voorbereiden.
- Hebben de Office-assistent openen van steriele packs (een tabel draperen, een papier-draperen en 6 handdoeken) en de inhoud aseptisch overbrengen naar de chirurg.
- Drape de instrument-tabel. Plaats het papier draperen en steriele handdoeken op de tafel gedrapeerd instrument. Draperen met 4 handdoeken, het konijn, alleen de chirurgische site verlaten op de hals blootgesteld. Leg het papier draperen over het konijn. Een handdoek zal later gebruikt worden, en de laatste is een back-up.
- Hebben de Office-assistent openen de gesteriliseerde instrumentenpak en aseptisch passeren de instrument lade naar de chirurg. Schik de instrumenten op de tafel van het instrument.
- De Office-assistent openen de volgende apparatuur en aseptisch doorgeven aan de chirurg of plaats het op het instrument tafel: een 1 mL spuit, een 3-mL spuit, een 20-mL spuit, één 21 G naald, 3-0 polyglycolic zuur (PGA) hechtdraad, 5-0 PGA hechtdraad , 7-0 polypropyleen hechtdraad en één 24 G IV-katheter.
- Beveilig de elektrocauterisatie-kabel aan op de draperen die betrekking hebben op het konijn, met behulp van een 7,25" Kantrowitz pincet. Drop het stekker uiteinde van de kabel over de rand van de operatietafel te worden aangesloten op de unit voor elektrochirurgie ingeschakeld door de Office-assistent.
- Vul een 20 mL spuit met steriele zoutoplossing van een zoutoplossing zak of flacon gehouden door de Office-assistent. Gebruik deze zoutoplossing zo nodig om de uitdroging van blootgestelde weefsel tijdens de operatie te voorkomen.
- 5 mL EDTA fysiologische zoutoplossing bereiden door toevoeging van 0,1 mL van heparine 5000 IU/mL tot 5 mL zoutoplossing, dwz., 100 IU heparine/mL, in een kleine chirurgische kom. Gebruik deze oplossing te spoelen van de carotis slagader en ader prothese regelmatig tijdens de procedure in de praktijk.
- Een gat in de papier-draperen over de chirurgische site op de rabbit's nek. Gebruik handdoek klemmen aan de hoeken van het gat om de onderliggende handdoeken klem.
- Vasculaire dissectie
Opmerking: Gebruik 2 x chirurgische loupes om hulp met dit deel van de operatie.- De huid met elektrocauterisatie langs de middellijn tussen de sternale Inkeping en de onderkaak (ongeveer 7-9 cm in lengte) knippen en klem van het konijn nekvel aan de handdoeken met de handdoek klemmen. Maak een korte laterale knippen door de fascia met elektrocauterisatie caudal eind heeft. Bot ontleden onder de fascia langs de gehele middellijn met behulp van grote schaar. De ontleed fasciaal laag langs de middellijn met elektrocauterisatie doorsnijden.
- Begin aan de rechterkant. Ontleden tussen de sternohyoid spier bevolkingsspreiding in de luchtpijp en de V-vormige sternocephalic spier, om de gemeenschappelijke halsslagader bloot te stellen.
- Een 4-5 cm-segment van de gemeenschappelijke halsslagader zorgvuldig te ontleden en zijn grotere takken (meestal 1-2 per zijde) vrij van de omringende weefsels. De dissectie van de basis van nek proximally met de overschrijding van de faryngaal zenuw distally uitbreiden. Gebruik chirurgische silicon lussen om te helpen bij de intrekking van de halsslagader tijdens de dissectie. De grotere takken van de gemeenschappelijke halsslagader met 5-0 zijde hechtingen afbinden vóór elke tak distally snijden.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te verstoren de vagus-zenuw die loopt parallel aan de gemeenschappelijke halsslagader, of de kleinere zenuwen die de oversteek van de slagader. - Herhaal de dissectie aan de linker kant (stap 2.2.3).
- Gebruik weefsel-bedrijf pincet tijdelijk sluiten de subcutane weefsel laag. Ontleden de oppervlakkige fascia uit de huid aan de rechterkant totdat de externe halsslagader wordt blootgesteld. Ontleden van een 4-5 cm-segment van externe halsslagader en gratis zijn takken van het omringende weefsel, kleine takken met 5-0 zijde hechtingen ligating voor het snijden van de tak.
- Herhaal de dissectie aan de linker kant (stap 2.2.5).
- Injecteren van heparine (150 IU/kg) in de IV-katheter en spoelen met 10 mL zoutoplossing.
- Meten van een segment 3 cm van externe halsslagader aan de rechterkant en afbinden caudal ultimo het segment met 5-0 zijde hechtdraad. Toestaan dat de ader te vullen met bloed, dan het afbinden van de craniale uiteinden van het segment van de ader. Verdelen van de craniale einde van de externe halsslagader segment, het vaartuig met EDTA normale zout (100 U/mL) met een 3-mL injectiespuit gekoppeld aan een 24-G IV-katheter zorgvuldig te spoelen. Verdeel de ader segment aan haar caudal einde. Plaats de ader segment in een gestandaardiseerde standpunt, waarin de caudal en craniale uiteinden ondubbelzinnig identificeerbaar zijn.
- Ader enten
- Laat de assistent de chirurgische loupes verwijderen uit de chirurg en de chirurgische Microscoop (25 X) positie zetten.
Opmerking: De chirurg moet een steriele handdoek draperen over de Microscoop. Hierdoor kan de chirurg om te manipuleren van de microscoop met behoud van de steriliteit. - Klem de juiste gemeenschappelijke halsslagader aan elk uiteinde van het geïsoleerde segment met mini-klemmen, plaatsen van de craniale klem eerst te voorzien van slagader vullen, dan plaatsen de caudal klem.
- Knip een 1 × 2 cm stukje stijf papier (verkrijgbaar bij steriel hechtdraad verpakking) en plaats deze onder de gemeenschappelijke halsslagader, ter verbetering van de blootstelling.
- Het uitvoeren van een arteriotomy gewoon cranial aan de caudal klem (de caudal arteriotomy). De arteriotomy lengte moet gelijk zijn aan de diameter van de craniale uiteinden van het segment van de ader. Plaats de injectiespuit met de IV-katheter via de caudal arteriotomy en spoelen de halsslagader lumen met normale zout EDTA.
- Suture de craniale einde van de ader aan de caudal arteriotomy, 7-0 polypropyleen hechtdraad met enkele steken (Figuur 1).
- Plaats de eerste steek om suture caudal ultimo het caudal arteriotomy tot het Cranio einde van het segment van de ader. Plaats de tweede steek 180° uit de eerste steek, aan de suture van de craniale einde van de caudal arteriotomy tot het Cranio einde van het segment van de ader.
- Plaats de derde steek op een punt uit de eerste twee steken, aan de laterale kant van de anastomose equidistante. Plaats de vierde steek aan de mediale zijde van de anastomose, equidistante uit de eerste twee steken en tegenover de derde steek. Plaats 4 extra steken (steken 5-8) tussen de verschillende steken 1-4.
- De cranial arteriotomy uitvoeren op de caudal kant van de craniale clip. De afstand tussen de craniale einde van de craniale arteriotomy en het caudal einde van de caudal arteriotomy moet hetzelfde zijn als de lengte van het segment van de ader. De lengte van de craniale arteriotomy is gelijk aan de diameter van de caudal uiteinden van het segment van de ader.
- Cranially de ader van de anastomose, tot het op de top van de halsslagader, zonder enige wendingen verlengen. Spoel de halsslagader en ader met normale zout via de craniale arteriotomy EDTA. De saline zullen vloeien via de slagader, in de ader via de caudal anastomose en verlaat het einde van het vrije en unsutured van de ader. Flushing de ader ook voorkomt het verdraaien.
- Suture het caudal einde van de ader aan de craniale arteriotomy (Figuur 1).
- Plaats een eerste steek om te suture het caudal einde van de craniale arteriotomy naar het caudal einde van het segment van de ader. Plaats een tweede steek om de suture van de craniale einde van de craniale arteriotomy naar het caudal einde van het segment van de ader. Voltooi de anastomose zoals beschreven in stap 2.3.5.2. Net voordat het laatste knooppunt is gekoppeld op de craniale anastomose, kort open de klem op de craniale einde van de ontleed gemeenschappelijke halsslagader segment, dat terug-bloeden dat wast uit de lucht in de halsslagader en de geënte ader. Draai vervolgens het laatste knooppunt.
- Laat de cranial clamp toestaan ader graft vullen met bloed en laat u vervolgens de caudal klem. Stevige pulsaties moeten worden gezien in de ader prothese. Zachte druk met droog gaas om te stoppen met elke bloeden op de anastomoses van toepassing.
- Beide uiteinden van de gemeenschappelijke halsslagader segment dat de anastomoses met een 3-0 zijde hechtdraad verbindt afbinden en verdeel de halsslagader halverwege tussen de ligaturen (Figuur 1). Enkele druppels papaverine (3,5 mg/mL) van toepassing op de halsslagader grenzend aan elke anastomose.
- Injecteren van heparine (75 IU/kg) in het oor IV-katheter en spoelen met 10 mL zoutoplossing. Op dit moment, injecteren buprenorfine (SQ, 0,02 mg/kg) voor postoperatieve analgesie totdat de fentanyl patch pijnstillende plasma niveaus van fentanyl heeft verstrekt.
Opmerking: Een extra buprenorfine injectie (SQ, 0,02 mg/kg) mogelijk nodig 6 uur na de eerste injectie te handhaven analgesie totdat plasma fentanyl een therapeutische concentratie bereikt. - Herhaal enten aan de linker kant (stappen 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Sluit het subcutane weefsel met 5-0 PGA hechtdraad met behulp van een doorlopend patroon. Sluit de huid met 3-0 PGA hechtdraad met behulp van een intradermale patroon. Begraven de knopen aan beide uiteinden.
- Laat de assistent de chirurgische loupes verwijderen uit de chirurg en de chirurgische Microscoop (25 X) positie zetten.
- Post-operatieve herstel, Schijfopruiming en zorg
Opmerking: Laat het konijn om te herstellen van verdoving in een kalme, rustige omgeving. Volgen het konijn voortdurend voor goede oxygenatie en lichaamstemperatuur totdat het volledig is hersteld.- Schakel Isofluraan en zuurstof en de verdoving machine verbreken het konijn. De IV vloeistof buis verbreken het konijn, maar laat de IV-poort in de ader van de oor voor opkomende toegang.
- Vervoer van het konijn naar een herstel kooi en plaats deze op zijn kant. Thermische ondersteunen met een warmwater deken (of gedwongen-lucht opwarming van de aarde). O2 door neuskegel geven totdat SpO2 stabiel is.
- Totdat het konijn kan gaan zitten en in haar kooi ambulate, spiegelen het konijn naar de andere kant elke 15 min. Verwijder de canule oor IV vervolgens en het konijn terug naar haar kooi. Terug het konijn naar het gezelschap van andere dieren pas nadat het volledig is hersteld van de verdoving.
- Beschikken over geen afval volgende passende protocollen voor biohazard en slijpsel afvalverwijdering.
- Postoperatief, Controleer het konijn van gezondheid en chirurgische wond elke dag. Beheren van buprenorfine als nodig voor de pijn niet wordt beheerd door de fentanyl patch. Verwijder de patch fentanyl op postoperatieve dag 3.
3. transkutane echografie
- Om te beoordelen graft bij, uitvoeren echografie examen op niet-verdoofd konijn 5-7 dagen na de ader-prothese chirurgie en genenoverdracht chirurgie.
- Wikkel het konijn niet-verdoofd veilig in een deken en plaats het konijn liggende in een veterinaire V-dal met zijn nek uitgebreid. Scheren van de nek, of Verwijder zo nodig de haren met een ontharende agent. Ultrageluid-gel van toepassing op de nek en het uitvoeren van een echografie-examen.
Opmerking: Een echografie-examen wordt ook uitgevoerd op narcose konijnen op het moment van zowel de gene overdracht chirurgie en de terminal graft oogst chirurgie te onderzoeken graft bij en voor het meten van de diameter van de lumen van de prothese. Het examen gebeurt net voor het schrobben van de nek en wordt uitgevoerd op een soortgelijke wijze als voor de konijnen niet-verdoofd.
- Wikkel het konijn niet-verdoofd veilig in een deken en plaats het konijn liggende in een veterinaire V-dal met zijn nek uitgebreid. Scheren van de nek, of Verwijder zo nodig de haren met een ontharende agent. Ultrageluid-gel van toepassing op de nek en het uitvoeren van een echografie-examen.
4. de genenoverdracht chirurgie uitgevoerd ~ 28 dagen na de plaatsing van de prothese (Survival chirurgie)
- De instrumenten en de steriele veld voorbereiden.
- Volg stappen 2.1.1-2.1.3. in de ader prothese chirurgie.
- De Office-assistent openen de volgende apparatuur en ofwel aseptisch laat doorgeven aan de chirurg of plaats het op de tafel instrument: zes 1 mL spuiten (met naald), een 3-mL spuit, een 20-mL spuit, één 21 G naald, een 19-G naald, 3-0 PGA hechtdraad , 5-0 PGA hechtdraad, 7-0 polypropyleen hechtdraad, twee 24 G IV katheters en een steriele bloed stroom sonde.
- Volg stappen 2.1.5-2.1.6. in de ader prothese chirurgie.
- Bereiden van een spuit van 1 mL met 1 mL DMEM voor het wassen van de slagader en ader prothese en twee 1-mL-spuiten met virus oplossing te bereiden (~ 0,5-0,7 mL virus oplossing/ader graft). Laat de assistent ontdooien van het virus en Verdun het in DMEM. Voorbereiden van een 3-mL spuit met 0,5 mL van lidocaïne/bupivacaine (50/50 mix, stap 1.2.4).
- Volg stap 2.1.8 in de ader prothese chirurgie.
- Isolatie van ader transplantaties en aangrenzende halsslagaderen
Opmerking: 2 x chirurgische loupes moet worden gebruikt voor dit deel.- De huid met elektrocauterisatie langs de middellijn tussen de sternale Inkeping en de onderkaak (ongeveer 7-9 cm in lengte) knippen en de huid open klem met handdoek klemmen. 0,5 mL van lidocaïne/bupivacaine (50/50 mix, stap 1.2.4) toepassen in het onderhuidse weefsel.
- Maak een korte laterale knippen door de fascia met elektrocauterisatie caudal eind heeft. Bot ontleden onder de fascia langs de gehele middellijn. Met elektrocauterisatie, doorsnijden de ontleed fascia langs de middellijn.
- Begin aan de rechterkant. Tussen de sternohyoid spier bedekken de luchtpijp en de V-vormige sternocephalic spier, bloot de ader prothese te ontleden. Zorgvuldig isoleren de ader graft en 1,5-2,0 cm van de halsslagader grenzend aan de prothese aan de craniale en caudal weerszijden.
- Herhaal de dissectie aan de linkerzijde na stap 4.2.3.
- Het meten van de bloedstroom in de ader transplantaties.
- Vul de holte van de chirurgische wond aan de rechterkant met normale zout om de overdracht van geluidsgolven. Een 2-mm gerelateerde stroom sonde (aangesloten op een volume-flowmeter) in het zout in de wond holte onderdompelen en het debiet op nul gezet.
- De sonde van de stroming rond de halsslagader caudal of Cranio aan de ader prothese plaatsen. Registratie van de gegevens van de sonde van de stroom met een elektronische data-acquisitiesysteem.
- Herhaal de Stroommeting aan de linkerzijde na stap 4.3.2.
- Bereken de pulsatility op basis van de piek systolische debiet, minimale diastolische debiet en gemiddelde stroomsnelheid. Ook berekenen laminaire schuifspanning, gebaseerd op het debiet en lumen diameter (gemeten met transkutane echografie).
- Vector oplossing inblazen in de ader transplantaten
Opmerking: Een chirurgische Microscoop (16 X) wordt gebruikt als nodig is voor het prikken, infuus en reparatie van de halsslagader.- Hebben de Office-assistent verwijdert de chirurg de chirurgische loupes en de chirurgische Microscoop positie zetten. Heb de chirurg een steriele handdoek draperen over de Microscoop. De steriele handdoek kan de chirurg om te manipuleren van de microscoop met behoud van de steriliteit.
- De assistent injecteren heparine (150 IU/kg) in de IV-katheter en spoelen met zout.
- Het stuurprogramma van een grote naald gebruikt om te buigen van de naald 21 G tot ongeveer 80° net boven de schuine rand (niet knikken de schuine kant; Figuur 2A).
- Klem de gemeenschappelijke halsslagader aan elk uiteinde van de ader prothese met mini-klemmen, plaatsen van de craniale klem eerst te voorzien van slagader vullen, dan plaatsen de caudal clip. Plaats de caudal clip ongeveer 10 mm caudal aan de anastomose, om voldoende ruimte voor de arteriotomy.
- Twee zijden dassen rond de slagader gewoon caudal aan de prothese en binden van een enkele bovenhands knoop op elk - zonder aanscherping van hen.
- Het doorprikken van de halsslagader caudal aan de prothese met de gebogen 21 G naald gewoon craniale van de caudal vasculaire clip. Wees voorzichtig om niet doorprikken de achterkant of zijkant muren. Vooraf de naald in het lumen heen-en-weer tweemaal om ervoor te zorgen dat de lumen duidelijk is, en vervolgens zorgvuldig trekken de naald.
Opmerkingen: Gemeenschappelijke carotis punctie kan worden geholpen door de arteriële adventitia grijpen met een fijne Tang en voorzichtig het opheffen van de voorwand terwijl het opnemen van het puntje van de naald gewoon caudal tot het punt van de lift(Figuur 2). Dit vermindert het risico van het raken van de achterste muur met de naald. - Met verschillende ongevouwen gaas pads, maken een nest om te plaatsen de spuit gebruikt voor infusies. Plaats dit gaas nest caudal naar de chirurgische site.
- Een 24 G IV-katheter zetten de injectiespuit met dit is een alleen-DMEM en draai de katheter op de spuit net genoeg om te voorkomen lekkage (de spuit wordt later in deze operatie verwijderd) en buig de katheter ~ 4 mm van het uiteinde zodat de bocht op ongeveer 75° houdt nadat deze is uitgebracht.
- De IV-katheter in de gemeenschappelijke carotis arteriotomy tot het buigpunt invoegen en wassen van de ader graft lumen tweemaal met 0,5 mL DMEM. Voor elke herhaling, door de ader prothese te vullen met DMEM. Verwijder de DMEM uit de prothese door licht te drukken met een gehandschoende vinger craniale eind van de prothese. Schuif voorzichtig de vinger tegen het caudal einde van de prothese te spoelen de luminal inhoud via de arteriotomy.
- Verwijder de DMEM spuit uit de katheter, waardoor de katheter in het schip. Sluit de spuit met de oplossing van virus, ervoor te zorgen dat geen lucht de katheter treedt. Verplaats dat de losjes geknoopte zijde banden beneden de slagader totdat ze rond het uiteinde van de katheter, maar doen geen draai hen.
- Infundeer 0,03 mL van oplossing van het virus te duwen van de resterende DMEM uit de katheter. Verwijder alle vloeistof uit de ader graft lumen met een vinger, dringt er op zachtjes uit craniale caudal.
- Draai de twee banden rond de slagader en katheter tip te verzegelen de lumen. Infundeer de virus oplossing totdat de ader is opgezwollen. Voorzichtig vast de spuit op het nest van gaas.
Opmerking: Het is essentieel dat de ader prothese breidt uit naar haar pre transductie kaliber en opgeblazen tijdens de infusie van virus blijft. Als dat niet het geval is, het bedrag van genenoverdracht aanzienlijk wordt verlaagd. - Laat de oplossing virus-bevattende in de ader graft lumen gedurende 20 minuten en dan het vervangen van de virus-bevattende spuit gekoppeld aan de katheter met een lege spuit. Zachtjes gecombineerd de virus-bevattende oplossing van de prothese totdat het schip wordt samengevouwen. Verwijder de injectiespuit, verlaten van de katheter op zijn plaats. Ontkoppelen van de zijde hechtingen te knippen en de katheter trekken van het vaartuig. Het verwijderen van de katheter uit de halsslagader zorgvuldig om te voorkomen beschadiging van het endotheel.
- Met de hulp van de chirurgische Microscoop, sluit u de arteriotomy met 7-0 polypropyleen Sutuur (geologie) met behulp van een X-patroon (Figuur 2B).
- Begrijpen van de hechtdraad met een naald-houder, voer het schip op de onderst-juiste van de arteriotomy en verlaten het schip in de linkerbenedenhoek. Kruis de opening buiten het schip en maak de tweede pass van rechtsboven naar linksboven.
- Vóór de aanscherping van de hechtdraad, vrij kort de craniale vasculaire clip lucht en resterende virus leeggemaakt van de graft ader en slagader. Bloed zal vloeien uit de arteriotomy wanneer de klem wordt vrijgegeven.
- Dicht de arteriotomy door zachtjes te trekken van de hechtdraad eindigt en binden hen samen met 2 square knopen.
Nota: Trekken van de hechtdraad te krap zal veroorzaken opeenhoping van het weefsel die zal verstoren van de stroom, verhogen risico op trombose en potentieel introduceren ongecontroleerde variabelen.
- Laat de craniale vasculaire clip, dan de caudal clip. Stoppen met elke bloeden met behulp van gaas lichte druk uitoefenen.
- Rond deze tijd, injecteren buprenorfine (SQ, 0,02 mg/kg) voor postoperatieve analgesie totdat de fentanyl patch heeft verstrekt pijnstillende fentanyl plasma niveaus.
Opmerking: Een extra buprenorfine injectie (SQ, 0,02 mg/kg) mogelijk nodig 6 uur na de eerste injectie te handhaven analgesie totdat plasma fentanyl een therapeutische concentratie bereikt. - Herhaal het virus infusie protocol aan de linkerzijde, de volgende stappen 4.4.5-4.4.15.
- Sluiting van de wond
- Sluit het subcutane weefsel met 5-0 PGA hechtdraad, met behulp van een doorlopend patroon. Sluit de huid met 3-0 PGA hechtdraad met behulp van een intradermale patroon. Begraven de knopen aan beide uiteinden.
- Post-operatieve herstel, Schijfopruiming en zorg
- Volg stap 2.4.
5. oogst chirurgie (Terminal)
- De instrumenten en de chirurgische site voorbereiden.
- Volg stappen 2.1.1-2.1.3 in de ader prothese chirurgie.
- Laat de Office-assistent openen en aseptisch plaats op de tafel instrument (of doorgeven aan de chirurg): een 20 mL spuit, één 21G naald 3-0 zijde hechtdraad en een steriele bloed stroom sonde.
- Voer de stappen uit 2.1.5-2.1.6 en 2.1.8 ader prothese chirurgie.
- Isolatie van gemeenschappelijke halsslagaderen en ader transplantaten
- De huid met elektrocauterisatie langs de middellijn tussen de sternale Inkeping en de onderkaak (ongeveer 7-9 cm in lengte) knippen en klem van het konijn nekvel aan de handdoeken met handdoek klemmen.
- Maak een korte laterale knippen door de fascia met elektrocauterisatie caudal eind heeft. Bot ontleden onder de fascia langs de gehele middellijn. De ontleed fascia langs de middellijn met elektrocauterisatie doorsnijden.
- Begin aan de rechterkant. Tussen de sternohyoid spier bevolkingsspreiding in de luchtpijp en de spieren van de V-vormige sternocephalic bloot van de gemeenschappelijke halsslagader en ader prothese te ontleden.
- Ontleden de juiste ader graft en de gemeenschappelijke halsslagader vrij van de omringende weefsels. Chirurgische silicon lussen voor de intrekking van de slagader en de ader prothese tijdens de dissectie gebruiken.
- Herhaal de dissectie aan de linkerzijde na stappen 5.2.3-5.2.4.
- Meet stroom maten na stappen 4.3.1-4.3.3 gene overdracht chirurgie.
- Oogst van de ader transplantaten
- Afbinden met 3-0 zijde hechtdraad, de right admin halsslagader cranial aan de prothese. Vervolgens het afbinden van de halsslagader caudal aan de prothese.
- De juiste ader prothese door het verdelen van de aangrenzende halsslagader tussen elk van de ligations en de aangrenzende wapendrager accijnzen. Verwijderen van de prothese ader van het konijn en de lumen met zoutoplossing te spoelen.
- Trim de halsslagader en anastomoses aan beide kanten van de ader prothese. Trim weg overtollige adventitial weefsel van de ader prothese en snijd de prothese in segmenten zo nodig voor andere eindpunt analyses.
- Oogst de linker ader prothese door herhalende stappen 5.4.1-5.4.3.
- 1 mL van fenytoïne/pentobarbital IV te euthanaseren van het konijn te injecteren.
- Beschikken over geen afval volgende passende protocollen voor biohazard en slijpsel afvalverwijdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De technische vaardigheid van een nieuwe exploitant moet worden gevalideerd voordat de exploitant deze methode gebruikt kan voor het genereren van experimentele gegevens. De eerste mijlpaal die een nieuwe operator moet bereiken is consistent ader graft bij na de eerste operatie van de ader-enten en de daaropvolgende vertraging-transductie chirurgie. Meer dan 90% bij na elk van de ingrepen wenselijk en haalbaar is. De bij kan worden beoordeeld, niet-gebeurt met behulp van transkutane ultrasound, die we doorgaans op postoperatieve dag 5-7 uitvoeren. Bij de konijnen met patent aderen, zal de echografie examen onthullen een groot bloedvat met stevige caudal-naar-Cranio bloedstroom aan beide zijden van de voorste hals (Figuur 3A). Als een van de ader protheses is geroteerd, zal er geen detecteerbare caudal-naar-Cranio bloedstroom op de zijkant(en) met de afsluiting van de prothese. Cranio-naar-caudal bloedstroom zal echter nog worden gedetecteerd in de interne halsslagader (Figuur 3B).
De tweede mijlpaal die een nieuwe operator moet bereiken is efficiënte transductie van ader-graft endotheliale cellen. Hier, wordt een adenovirale vector die β-galactosidase uitdrukt gebruikt ter beoordeling van de efficiëntie van endothelial genenoverdracht. Een nieuwe operator in ons lab getransduceerde ader transplantaties met een adenovirus uiting van β-galactosidase (AdnLacZ) met behulp van de beschreven methoden. De transplantaten werden gekapt 3 dagen na de transductie en snijd in segmenten. Sommige segmenten waren gekleurd met 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). Nl gezicht beeldvorming van de luminal oppervlakken toonde ader transplantaties met efficiënte transductie (Figuur 4A) en slechte transductie (Figuur 4B). Voor verdere evaluatie van de vaardigheid van een nieuwe exploitant, wordt β-galactosidase mRNA in de extracten van de getransduceerde ader prothese ook gemeten met behulp van kwantitatieve PCR van het reverse-transcriptase-gemedieerde en normaliseren van het signaal naar het niveau van glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase (GAPDH) mRNA gemeten in de zelfde ader transplantaties.
De niveaus van β-galactosidase mRNA in ader transplantaten getransduceerde door de operator new waren niet significant verschillend van de niveaus van β-galactosidase mRNA in ader transplantaten getransduceerde door een ervaren operator (Figuur 5). Als mRNA monsters uit de ader transplantaten getransduceerde door een ervaren operator niet beschikbaar voor vergelijking zijn, explantaten negatieve controle ader graft die mRNA kan worden gegenereerd door het transducing van de ader met een niet-uiting controle vector (AdNull). We hebben geconstateerd dat de gemiddelde niveaus van β-galactosidase mRNA in ader transplantaten getransduceerde door een ervaren operator ongeveer 1,000-fold hoger is dan het signaal van de PCR achtergrond voor β-galactosidase mRNA gemeten in AdNull-getransduceerde transplantaties (Figuur 5 zijn) .
Figuur 1 . De plaatsing van een omgekeerde recht externe halsslagader-naar-rechts gemeenschappelijke halsslagader entt u met end-to-side anastomoses. De ader prothese (blauw) is ingehecht aan de gemeenschappelijke halsslagader (rood) op twee anastomoses. Bij elke anastomose, steken (witte x) worden genummerd in de volgorde waarin ze zijn geplaatst. Voor beide de anastomoses, steek 1 hechtingen het caudal einde van de arteriotomy naar de externe halsslagader. Steek 2 hechtingen de craniale einde van de arteriotomy naar de externe halsslagader. Steek 3 is geplaatst aan de laterale kant van de anastomose op een gelijke afstand van de eerste twee steken. Steek 4 is geplaatst aan de mediale zijde van de anastomose, equidistante uit de eerste twee steken en tegenover steek 3. Vier extra steken (steken 5-8), halverwege tussen de vier bestaande hechtingen worden geplaatst. Het segment van de halsslagader tussen de anastomoses is afgebonden aan beide uiteinden met 3-0 zijde hechtingen (pijlen) en verdeeld (gestippelde lijn) halverwege tussen de ligaturen. Linkerpagina transplantaties worden uitgevoerd op een vergelijkbare manier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . De oprichting en sluiting van een carotis arteriotomy. (A) de gemeenschappelijke halsslagader adventitia is begrepen in de buurt van de ader prothese met een fijne Tang en opwaartse tractie wordt toegepast op de wand van de slagader. Dit creëert een verticaal oppervlak, waardoor de gebogen naald 21 G te voegen ongeveer parallel aan het vaartuig lumen, verminderen van het risico van prikken de achterste muur van de slagader. (B) de arteriotomy is ingehecht 7-0 polypropyleen met een X-patroon. De eerste hechtdraad pass komt de lumen van de slagader in de rechteronderhoek van de arteriotomy (site 1) en verlaat de lumen links onderaan (plaats 2). De hechtdraad kruist vervolgens de arteriotomy. De volgende pas opnieuw komt de lumen in de rechterbovenhoek (site 3), en verlaat de lumen in de linkerbovenhoek (site 4). Zachte tractie op de uiteinden van de hechtdraad (de uiteinden verlaten site 1 en site 4) Sluit de arteriotomy. De uiteinden van de hechtdraad zijn gebonden met 2 square knopen. De gevulde blauwe cirkels geeft u de locatie waar de hechtdraad de arteriële muur doordringt. De ononderbroken blauwe lijnen geven aan waar de hechtdraad loopt buiten de arteriële muur; gestippelde blauwe lijnen geven aan dat de hechtdraad zich in het lumen bevindt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Transcutane echografie beelden van konijn nek, evaluatie van vein graft bij 5-7 dagen na het enten. (A) Patent ader graft (rood) met bloedstroom in caudal-naar-craniale richting is aangegeven (pijl). (B) Occluded vein graft. Geen caudal-naar-Cranio doorbloeding (die zou verschijnen rode) wordt gedetecteerd. De interne halsslagader (blauw) met de bloedstroom in Cranio-naar-caudal richting wordt aangegeven (sterretje). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Beta-galactosidase transgenic expressie in de ader transplantaten. 28 dagen na het enten, konijn ader transplantaten werden getransduceerde door een 20-min-incubatie van adenovirale vectoren uiting van β-galactosidase binnen de lumen van chirurgisch geïsoleerde ader transplantaties. Ader transplantaties werden gekapt 3 dagen na transductie en gekleurd met 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) nl afbeelding van het luminal oppervlak van een segment van de ader waaruit blijkt efficiënte transductie. (B) nl afbeelding van het luminal oppervlak van een segment van de ader waaruit arme transductie. Schaal bar = 1,0 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Expressie van beta-galactosidase (β-gal) transgenic mRNA in ader graft segmenten. 28 dagen na de plaatsing van de halsslagader spreekbeurt transplantaties in konijn carotids, de transplantaten waren getransduceerde met een adenovirale vector uiting van beta-galactosidase (AdnLacZ) of een besturingselement adenovirale vector die niet een transgenic (AdNull uitdrukken doet ). Chirurgische ingrepen werden voltooid door een ervaren operator (chirurg 1) of een nieuwe operator (chirurg 2). Ader transplantaten getransduceerde met AdnLacZ werden alle geoogste 3 dagen na transductie. RNA transplantaten getransduceerde met AdNull en geoogst van 14 dagen na de signaaltransductie werd ook geanalyseerd, als een negatieve controle is onttrokken. De uitdrukking van mRNA van beta-galactosidase werd gekwantificeerd door kwantitatieve reverse-transcriptase-gemedieerde PCR, met waarden genormaliseerd naar glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase mRNA in dezelfde extracten gemeten en uitgedrukt als willekeurige eenheden (AU). Staven geven gemiddelden; p -waarden zijn rang-som proeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in dit protocol omvatten het beheer van de verdoving, anticoagulation, chirurgische manipulatie van de ader slagader/geënt en hemodynamische metingen van de geënte ader. Goed beheer van de verdoving is kritisch in deze overleving chirurgie model met meerdere waarin twee relatief lange bewerkingen (meestal 3-3,5 h voor bilaterale ader enten en 1,5 tot 2,5 h voor bilaterale graft transductie). We hebben toegediend verdoving zowel via een neuskegel Endotracheale intubatie en vond dat de intubatie verbeterd het voortbestaan na de prothese transductie operatie, mogelijk omdat overdruk ventilatie de atelectase voorkomt en aanverwante respiratoir falen. Konijnen zijn uitdagend om te intubate, en intubatie-gerelateerde airway trauma kan leiden tot post-operatieve stridor. De uitdagingen en de complicaties van de intubatie zijn echter een kleine prijs om te betalen ten behoeve van het elimineren van allermeest naar de perioperatieve morbiditeit en de mortaliteit die is gekoppeld aan de praktijk chirurgie van de ader.
Antistolling is essentieel om te voorkomen dat de trombose van geënte aders, die na een van de overleving operaties optreden kan. De trombose blijkt te zijn van een vroege postoperatieve gebeurtenis, omdat de ader protheses die octrooi op transkutane echografie onderzoek 5-7 dagen postoperatief zijn zijn bijna altijd octrooi bij de oogst. Om te voorkomen dat de trombose na de eerste operatie (dwz., ader enten), IV heparine wordt toegediend vóór de eerste externe halsslagader oogsten. Op basis van de plasma halfwaardetijd van heparine bij konijnen (1-2 h), wordt een extra halve dosis van IV heparine toegediend vóór de contralaterale externe halsslagader oogsten. Daarnaast, totdat beide Arterioveneuze anastomoses van een individuele ader prothese voltooid zijn, spoelen we het lumen van de halsslagader en de ader prothese ongeveer elke 8 min met normale zout EDTA. Om te voorkomen de prothese trombose, moet worden gewaakt om niet te beschadigen de ader graft-met name het endotheel-tijdens het oogsten en enten. Het gaat hierbij om zachte behandeling van de ader met chirurgische instrumenten en het verlaten van een dun laagje adventitial adipeus weefsel gehecht aan de ader. Wij beheren ook een enkelvoudige dosis van actuele papaverine aan de geënte halsslagader, om te voorkomen dat of een omgekeerde vasospasm, die tot trombose bijdragen kan.
Nauwgezette aandacht voor de chirurgische techniek is vereist tijdens de ader enten chirurgie. Om te voorkomen bloeden op de anastomoses, graft trombose en de introductie van ongecontroleerde hemodynamische variabelen, moeten de twee arteriotomies van de juiste lengte. Als een arteriotomy te kort is, zullen de ader graft ostial muur redundante op de site van de anastomose, maken van gaten waarmee bloeden. Als de arteriotomy te lang is, het oprekken van de ader ter dekking van de arteriotomy brengt de ader graft muren in de nabijheid, waardoor het moeilijk voor de chirurg te vermijden wordt de tegengestelde ader graft muren samen (in wezen garanderen postoperatieve trombose). Bovendien, als de ader graft lumen wordt verkleind omdat de ader was uitgerekt ter dekking van een buitensporig lange arteriotomy, een stenose ontstaat die shear stress verhoogt, predisposes tot en met trombose33, en potentieel aanpast resultaat variabelen zoals neointimal groei en vasculaire remodelleert34,35. Daarnaast is het belangrijk te voorkomen dat de invoering van de wendingen in de ader prothese, die in lumen vernauwing of abnormale stroom resulteren kan. Om te voorkomen met het verdraaien van de prothese, we altijd uitlijnen van de ader-segment langs het ventrale oppervlak van de gemeenschappelijke halsslagader en zorg dat er geen wendingen in de ader. Vanwege de variabele chirurgische techniek te wijzigen ader graft hemodynamica en omdat veranderde hemodynamica kan invloed hebben op de uitkomst variabelen onafhankelijk van behandeling, meten we regelmatig bloed stroom en graft diameter vóór vector infusie en op het tijdstip van de oogst. We gebruiken deze waarden voor het berekenen van shear stress en pulsatility. Ader transplantaties met hemodynamische metingen buiten vooraf bepaalde reeksen kunnen objectief worden uitgesloten van verdere analyse, dalende experimentele variabiliteit en statistische macht vergrootte.
Als we deze methode ontwikkeld, maakte we verschillende wijzigingen. Aanvankelijk hebben we geprobeerd ader graft genenoverdracht tijdens het praktijk. Onder deze omstandigheden was transgenic expressie echter bijna volledig verloren door 3 dagen na gene transfer22. Transgenic expressie was snel verloren of de ader-segment was getransduceerde in situ en vervolgens geënt of of de ader was eerst geënt, en vervolgens getransduceerde. Alleen door het uitstellen van signaaltransductie tot na de ader prothese had aangepast aan de arteriële circulatie (we wachtten tot 28 dagen na het enten standaardinteracties genenoverdracht, hoewel een kortere vertraging mogelijk), was het snelle verlies van transgenic expressie vermeden22 . Wij ook omgezet van anesthesie neuskegel-geleverd Endotracheale tube-geleverd verdoving voor de operatie (genenoverdracht) tweede na het ervaren van intraoperatieve en postoperatieve sterfte. Bovendien, na het ontmoeten van schijnbare aspiratie pneumonie in een postoperatieve konijn, begonnen we te plaatsen van een kleine kunststof tafel over de rabbit's buik (onder de steriele gordijnen). De tabel werd geplaatst om te voorkomen dat de chirurg per ongeluk leunend op de rabbit's buik, gastro-oesofageale reflux en aspiratie potentieel te stimuleren. We hadden geen meer aspiratie gebeurtenissen na de plaatsing van de tabel. Echter, omdat deze plaatsing viel met de verschuiving naar Endotracheale intubatie samen, we niet worden zeker welke interventie is verantwoordelijk voor het elimineren van aspiratie gebeurtenissen.
Deze methode kent ook beperkingen. In de Verenigde Staten vereist het gebruik van konijnen in plaats van knaagdieren naleving van de eisen van de Laboratory Animal Welfare Act van 1966. Dienovereenkomstig, onderzoekers met behulp van konijnen (of andere dieren die onder deze wet vallen) moeten goed uitgeruste operatiezalen en deskundige anesthesiologists en een hoog niveau van postoperatieve bewaking en zorg te bieden. De tweede beperking is dat 2 operaties nodig met het oog op de aanhoudende transgenic expressie22zijn. De tweede operatie verhoogt de kosten van experimenten en elk konijn aan een extra set van potentieel operatieve en perioperatieve complicaties blootstelt. Wij zijn echter niet bewust zijn van een andere gene transfer aanpak die duurzaam transgenic expressie in de ader transplantaten behaalt. De derde beperking van deze methode is dat het vereist expertise in de bouw van HDAd vectoren en voorbereiding van high-titer HDAd voorraden. Veel laboratoria hebben expertise met eerste generatie adenovirale, lentivirale en adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren, maar relatief weinig groepen hebben ervaring met HDAd en zou meestal nodig om een samenwerking om op te halen van deze expertise. De klinische toepasbaarheid van de methode kan ook worden beperkt. Voor de mens, zou een tweede operatie zowel kosten als complicatie risico verhogen. Bovendien, hebben vergeleken met de menselijke saphenous aderen (gebruikt voor coronaire en perifere bypassoperaties), konijn externe jugular veins zeer dunne wanden. Het is mogelijk dat de muur verdikking en remodeling die optreedt na het enten van een konijn externe halsslagader in de arteriële circulatie zou worden verzwakt als de ader prothese al een dikkere wand heeft. Ten slotte, in experimenten in dit model gedurende maximaal 6 maanden, geen van de geënte aderen ontwikkelde een stenose22. Deze methode lijkt dus niet te model alle biologische processen die bijdragen tot de ader graft failure.
Kortom, de methode gebruikt een robuuste diermodel van menselijke vasculaire ziekten (konijnen) voor het genereren van geënte aders waarin transgenen stabiel worden uitgedrukt voor langdurig van tijd (ten minste 6 maanden)22. Stabiele uitdrukking van transgenen in de ader transplantaten zal onthullen hun rollen in normale ader graft homeostase en hun potentieel voor ader graft gentherapie zal verduidelijken. De methode kan worden verbeterd en meer klinisch toepasselijk gemaakt door de ontwikkeling van technieken waarmee percutane levering van vectoren aan de ader prothese, aldus voorkomen dat de tweede operatie. Deze technieken mogelijk katheter gebaseerde36,37, of ze konden opnemen speciaal geprepareerde vectoren die geïnjecteerd in een perifere veneuze en dan gericht op de muur van de ader graft, bijvoorbeeld door magnetische velden38. De methode zou ook testen van vectoren dan HDAd voor ader graft gentherapie, met inbegrip van lentivirale en AAV vectoren evenals niet-virale vectoren. 39 , 40 , 41 , 42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W.
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
