Summary
Denne metoden beskriver plasseringen av interposition blodåre graftene i kaniner, signaltransduksjon av graftene og oppnåelse av slitesterk transgene uttrykk. Dette gjør at etterforskningen av fysiologiske og patologiske roller effekter av transgener og deres protein produkter i podet årer og testing av gen-terapi for blodåre pode sykdom.
Abstract
Vene pode bypasskirurgi er en felles behandling for occlusive arterial sykdom; men er langsiktig suksess begrenset av pode dårlig på grunn av tromboser intimal hyperplasia og åreforkalkning. Målet med denne artikkelen er å demonstrere en metode for å plassere bilaterale venøs interposition graftene i en kanin, så transducing graftene med en genet overføring vektor som oppnår holdbar transgene uttrykk. Metoden gjør etterforskningen av biologiske rollene gener og deres protein produkter i normal blodåre pode homeostase. Det kan også testing av effekter av transgener for aktiviteter som kan hindre blodåre pode feil, f.eks., om uttrykk for en transgene hindrer neointimal vekst, reduserer vaskulær betennelse eller reduserer aterosklerose i kaniner matet med en høy-fett diett. Under en innledende overleve kirurgi, er delene av høyre og venstre ytre vena jugularis forbrukeravgift og plassert bilateralt som motsatt ende-til-side felles arteria carotis interposition grafts. Under en andre overleve kirurgi, utført 28 dager senere graftene er isolert fra sirkulasjonen med vaskulær klipp og lumen er fylt (via en arteriotomy) med en løsning som inneholder en hjelper-avhengige adenoviral (HDAd) vektor. Etter en 20 minutters inkubering, vektor løsningen er pustende, arteriotomy er reparert, og strømmen er gjenopprettet. Venene høstes ved tidspunkt diktert av personlige eksperimentelle protokoller. Den 28-dagers forsinkelsen mellom pode plasseringen og signaltransduksjon er nødvendig for å sikre tilpasning av blodåre graftet til arterial sirkulasjon. Denne tilpasningen unngår rask tap av transgene uttrykk som forekommer i blodåre grafts transduced før eller umiddelbart etter pode. Metoden er unik i sin evne til å oppnå varig, stabil transgene uttrykk i podet årer. Sammenlignet med andre store dyr blodåre pode modeller, har kanin fordelene med lave kostnader og enkel håndtering. Sammenlignet med gnager blodåre pode modeller, har kanin større og lettere å manipulere blodårene som gir rikelig vev for analyse.
Introduction
Atherosclerosis er en kronisk inflammatorisk sykdom som lipid akkumulering og betennelser i blod fartøyet veggen føre til innsnevring av fartøyet lumen, hjerteinfarkt, slag og tap av lemmer1,2. PCI tiltak (f.eks., angioplasty og stenting) og medisinsk behandling (f.eks., statiner og antiplatelet) er nyttig behandlinger for aterosklerose; de er imidlertid ofte ineffektive i behandle alvorlig obstruktiv sykdom både i koronar og eksterne rundskriv. Omkjøringsvei pode, bruker gjestfrihet blodåre segmenter, er en vanlig prosedyre for å behandle pasienter med alvorlig, diffus koronar og perifer vaskulær sykdom3,4. Imidlertid vene graftene i både koronar og eksterne rundskriv har dårlige langsiktige patency priser. I koronar sirkulasjon, er ca 10-20% av blodåre grafts er okkludert ved 1 år og 50% okkludert av 10 år5,6. I perifere blodsirkulasjonen er vene pode feilrater 30-50% på 5 år7.
Genterapi er en attraktiv tilnærming for forebygging av blodåre pode feil fordi det kan levere en terapeutisk gene produktet nettopp på stedet av sykdommen. Følgelig har mange prekliniske studier testet blodåre pode gene terapi8,9. Men har egentlig alle disse studiene undersøkt effekten tidlig tid poeng (2-12 uker)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. vi kjenner til ingen bevis for at genterapi intervensjoner kan gi holdbar (år) beskyttelse mot slutten blodåre pode svikt som vanligvis resultatene fra neointimal hyperplasia og aterosklerose4. Vi utviklet en metode som gjør holdbar transgene uttrykk i podet årer, og dermed gjør testing av genterapi intervensjoner på slutten, samt tidlig tidspunkt. For å oppnå varig transgene uttrykk, omfatter metoden HDAd vektorer og en forsinket signaltransduksjon strategi. HDAd vektorer gir langvarig transgene uttrykket fordi de mangler viral gener, hindrer de anerkjennelse (og avvisning) av transduced celler av immunsystemet18,19,20, 21. forsinket signaltransduksjon (utført 28 dager etter pode plassering) hindrer tap av transduced celler under av arterialization som oppstår tidlig etter at pode22.
Andre metoder som oppnå terapeutiske transgene uttrykk i vene pode veggen stole på Albin på blodåre graftet ved pode plassering10,11,12,15,16 ,17. Når målte serielt, avtar transgene uttrykk bruker denne tilnærmingen raskt etter signaltransduksjon22,23. Følgelig har studier med denne tilnærmingen ikke undersøkt effekten utover 12 uker etter venen pode, med mest ikke vurdere effekten utover 4 uker. Derimot vår metoden oppnår blodåre pode transgene uttrykk som vedvarer stabilt i minst 24 uker og-basert på lignende studier utført i arteriene sannsynlig fortsetter langt lengre22,24. Vi kjenner ingen andre blodåre pode gene terapi intervensjon som oppnår stabil transgene uttrykk for denne varigheten.
Vi brukte en kanin modell for å utvikle vår metode. Andre har brukt gnagere, kaniner, eller større dyrene å teste blodåre pode gene terapi10,11,12,15,16,17,25, 26. Sammenlignet med gnager modeller, kaniner er dyrere og er underlagt strengere krav. Men sammenlignet med større dyr (f.eks., griser og hunder), kanin er langt billigere å kjøpe og huset og mye lettere å håndtere. Videre kanin fartøy ligner menneskelige fartøy fysiologisk27, de er store nok at de kan brukes til testing PCI intervensjoner28,29, og de gir tilstrekkelig vev som flere endepunkt (f.eks., histology, protein, RNA) kan undersøkes ved hjelp av en enkelt blodkar prøven22,30. I tillegg når kaninene med blodåre grafts fôres med en høy-fett diett, utvikler de blodåre pode aterosklerose31,32, som er en vanlig årsak til Koronar bypass blodåre pode feil4,5 . Disse aterosklerotisk kanin blodåre grafts kan tjene som et medium for å teste genterapi intervensjoner leveres med denne metoden. Den angitte protokollen kan hjelpe etterforskerne å mestre de tekniske ferdighetene som kreves for å oppnå varig transgene uttrykk i kanin blodåre grafts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller og studier ble godkjent av University of Washington Office of Animal Welfare.
1. før operasjon (for alle operasjoner)
- Bedøve kaninen med 30 mg/kg ketamin og 1.5 mg/kg xylazine ved intramuskulær injeksjon (IM) i paraspinous muskler.
Merk: Mat og vann er ikke begrenset før operasjonen. - Mens du venter tilstrekkelig dybde av anestesi, definere tabellene i forberedelse rommet og operasjonsstuen (OR).
- Forberede forberedelse rommet for barbering kaninens hals og plassering av intravenøs (IV) porten i øret (bare overleve kirurgi). Plass ophthalmica salve, fentanyl oppdateringen (overleve kirurgi), hårklippere, alkohol prep pad, 24-G x ¾" kateter, injeksjon port og kirurgisk tape i tabellen forberedelse.
- I OR, definere overvåking utstyr og tilhørende sonder (elektrokardiogram (EKG), puls oximetry (SpO2) og temperatur). Forberede IV pumpen med en 100 mL saltvann IV pose med en 18-G eller 19-G nål og sette infusjonshastigheten som 10 mL/t/kg (bare overleve kirurgi). Konfigurer utstyret du oksygen og isoflurane med en nosecone (blodåre pode eller høsting operasjoner).
- For å sikre nosecone til kaninen, gjentas en gasbind stripe rundt røret som leverer gass til nosecone. Denne løkken skal omgi røret der den festes til nosecone. De ledige endene på gasbind stripen bør være ca 45 cm lang. Plass nosecone (med tilknyttede gasbind) på hodet slutten av tabellen.
- Slå på sirkulerende vann og/eller tvunget luft oppvarming teppe i tabellen OR. På oppvarming teppet, plassere en rullet håndkle halsen støtte og plassere electrocautery dispersiv elektrode platen.
- Som en lokal smertestillende, kombinere en sprøyte 1 mL av 2% lidocaine HCl og 1 mL av 0,5% bupivacaine HCl. fortynne viruset til ønsket konsentrasjonen (her bruker 2 x 1011 virus partikler/mL for HDAd) i sterilt DMEM og holde på is (bare genet overføring kirurgi).
- Når en tilstrekkelig bedøvende dybde er nådd, forberede kaninen kirurgi.
Merk: Prøv for mangelen på en pedal uttak refleks å sikre tilstrekkelig bedøvende dybde. Fortsette å overvåke den pedal refleks hele operasjonen.- Bruke ophthalmica salve kaninens sidevern.
- For å tillate for plassering av en endetarms temperatur probe, trykk med hansker fingre rett over endetarmen og beveger fingrene mot anus fjerne stooling fra kaninens endetarmen.
- Barbere kaninen fra sternal hakk til kanten av kjeven. Barbere ett øre for IV plassering og motsatt øret fentanyl oppdateringen administrasjon (bare overleve kirurgi). Barbere venstre bakre midten tærne for plassering av SpO2 sonden.
- For vektor infusjon kirurgi, intubate kaninen. Bruk en 4 mm O.D./3 mm ID uncuffed endotracheal tube, gjenger over en arthroscope. Sett kaninen i sternal recumbency og hyper-forlenge halsen. Hold kaninens munnen åpen og bruk arthroscope å visualisere glottis og strupe folder. Under inspirasjon, forsiktig inn endotracheal røret gjennom strupehodet og luftrøret.
- For de overlevelse operasjoner, plassere og sikre et 24-G IV kateter i kaninens venstre øre venen og cap det en injeksjon-port. Bruke en 25 µg/t fentanyl patch kaninens høyre øre.
Merk: Protokollen er en kirurg som plasseres kaninens høyre. Hvis kirurgen kaninens venstre, snu sidene i dette trinnet å holde ledninger og IV motsatt av kirurgen. Bytte sidene i fremtidige trinnene etter behov. - For venen administrere pode og høsting operasjoner, narkose med en nosecone; for vektor infusjon kirurgi, administrere narkose via en endotracheal tube.
Merk: Intubasjon kan brukes for alle operasjoner. I vår erfaring, men kan risikoen for komplikasjoner fra tracheal og recurrens traumer under intubasjon oppveier fordelene ved intubasjon. Operasjonen som inkluderer genoverføring til en pode (spesielt i kolesterol-matet kaniner) er den eneste kirurgi i hvilke intubasjon synes å gi en netto nytte. - Bære kaninen i OR. Sett kaninen i supine posisjon i drifts tabellen med halsen støtte håndkle plassert rett under det kanin hode. Forsiktig utvide kaninens hals før det er rett og ca vannrett.
- Plasser nosecone til kaninen (blodåre pode og høsting operasjoner) eller koble til endotracheal tube] (vektor infusjon kirurgi) med O2 til 1 L/min, og starte isoflurane. Hvis bruker en nosecone, kan du sikre den av emballasjen endene av tilknyttede gasbind strimler rundt kaninens halsen støtte håndkle. Justere isoflurane konsentrasjonen som nødvendig (vanligvis 1-2%) for å opprettholde en kirurgisk anestesi.
- Center electrocautery dispersiv elektrode platen under kaninens tilbake. Sett inn endetarms temperatur probe og bruke SpO2 sonde og EKG fører til kaninen.
- Koble saltvann IV linjen kateter porten i kaninens venstre øre og starte IV infusjon pumpen på 10 mL/t/kg. Etter 1 h, redusere saltvann infusjonshastigheten 5 mL/t/kg.
- Løst tie kaninens forside ben i drifts tabellen som en selvbeherskelse.
Merk: Hvis en liten plast bord kan plasseres over kaninen å forhindre kirurg fra å trykke på kaninens brystet/underliv, og potensielt forårsake gastroesophageal reflux og aspirasjon. - Injisere lidocaine/bupivacaine (2 mL, 50/50 blanding, trinn 1.2.4) subcutaneously (SQ) i halsen langs planlagt snitt, for lokalbedøvelse.
- Få hjelperen til å desinfisere den kirurgiske området med 3 vekslende scrubs av chlorhexidine gluconate og isopropanol, så spray området med povidon-jod. Har kirurg scrub, kjole og hansken, etter aseptiske prinsipper.
- Utføre overlevelse operasjoner under aseptiske forhold. Få hjelperen til å håndtere ikke-sterilt elementer, og tas aseptisk passere steril materiale til kirurgen eller tas aseptisk plasseres i tabellen drapert instrument.
- Har kirurg bruk sterilt håndklær tas aseptisk manipulere ikke-sterilt utstyr som mikroskop. Har kirurgen ha 2 x kirurgisk forstørrelsesglass ved utføring av første halvdel av operasjonen.
2. blodåre pode kirurgi (overlevelse)
- Forberede instrumenter og sterile feltet.
- Har hjelperen åpne sterilt pakker (en tabell drapere, en papir drapere og 6 håndklær) og tas aseptisk å overføre innholdet til kirurgen.
- Drapere tabellen instrument. Plass papiret drapere og sterile håndklær på tabellen drapert instrument. Med 4 håndklær, drapere kaninen, forlater bare det kirurgiske området på halsen utsatt. Legge papir drapere over kaninen. En håndkle skal brukes senere, og den siste er en sikkerhetskopi.
- Har hjelperen åpne sterilisert instrumentet pack og tas aseptisk pass instrument skuffen til kirurgen. Ordne instrumentene i tabellen instrument.
- Få hjelperen til å åpne følgende utstyr og tas aseptisk sende den til kirurgen eller plassere den på tabellen instrument: en 1-mL sprøyte, en 3-mL sprøyte, en 20 mL sprøyte, en 21 G p, 3-0 polyglycolic syre (PGA) Sutur, 5-0 PGA Sutur , 7-0 polypropylen Sutur og en 24 G IV kateter.
- Sikre electrocautery kabelen til drapere dekker kaninen, bruker en 7.25" Kantrowitz tang. Dra hele plugg kabelen over kanten av drifts tabellen koblet til elektrokirurgi-enhet og slått på hjelperen.
- Fyll en 20 mL sprøyte med bakteriefri saline fra saltvann bag eller hetteglass holdt hjelperen. Bruk denne saline behov for å hindre dehydrering av eksponert vev under operasjonen.
- Forberede 5 mL av heparinized fysiologiske saltvann ved å legge til 0,1 mL av 5000 IU/mL heparin 5 mL av saltvann, dvs., 100 IU heparin/mL, i en liten kirurgisk bolle. Bruk denne løsningen for å spyle carotis arterien og venen graftet regelmessig under pode prosedyren.
- Skjære hull i papir drapere over kirurgiske området på kaninens halsen. Bruk håndkle klemmer å klemme hjørnene av hullet i stedet å underliggende håndklær.
- Vaskulær disseksjon
Merk: Bruk 2 x kirurgisk forstørrelsesglass for å hjelpe med denne delen av operasjonen.- Kutt huden med electrocautery langs midtlinjen mellom sternal hakket og mandible (ca 7-9 cm i lengde) og klemme kaninens halsen huden håndklær med håndkle klemmer. På caudal slutten, gjør en kort lateral klippe gjennom fascia med electrocautery. Rett ut dissekere under fascia langs hele midtlinjen med store saks. Skjære gjennom dissekert fascial laget langs midtlinjen med electrocautery.
- Start på høyre side. Dissekere mellom sternohyoidus muskelen overliggende luftrøret og V-formet sternocephalic muskler, å avsløre carotis.
- Analysere nøye en 4-5 cm segment av carotis og dens større grener (vanligvis 1-2 hver side) gratis fra omkringliggende vev. Utvide dissection fra bunnen av proximally til krysset av pharyngeal nerve distally. Bruk kirurgisk silisium looper til hjelp i tilbakekallingen av arteria carotis under dissection. Ligate større greinene av carotis communis med 5-0 silke suturer før klippe hver gren distally.
Merk: Pass på ikke å forstyrre nervus vagus som paralleller carotis eller mindre nerver som krysser arterien. - Gjenta dissection til venstre (trinn 2.2.3).
- Bruk vev-fange tang midlertidig lukke subkutant vev laget. Dissekere fascia superficialis fra huden på høyre side til eksterne vena jugularis er utsatt. Dissekere en 4-5 cm segment av eksterne vena jugularis interna og gratis dens grener fra de omkringliggende vev, ligating små avdelinger med 5-0 silke suturer før klippe grenen.
- Gjenta dissection til venstre (trinn 2.2.5).
- Injiser heparin (150 IE/kg) i IV kateter og skyll med 10 mL av saltvann.
- Mål et 3 cm segment av eksterne vena jugularis på høyre side og ligate caudal slutten av segmentet med 5-0 silke Sutur. Tillate venen fylles med blod, så ligate cranial slutten av blodåre segmentet. Dele skallen slutten av eksterne vena jugularis segmentet, nøye flush skipet med heparinized normal saline (100 U/mL) bruker en 3-mL sprøyte knyttet til en 24-G IV-kateter. Dele blodåre segmentet på caudal slutten. Plassere blodåre segmentet i en standardisert posisjon, der caudal og kraniale endene er utvetydig identifiserbare.
- Vene pode
- La hjelperen fjerne de kirurgiske forstørrelsesglass av kirurg og flytte kirurgisk mikroskopet (25 X) på plass.
Merk: Kirurgen bør drapere et sterilt håndkle over mikroskopet. Dette gjør at kirurgen å manipulere mikroskopet samtidig sterilitet. - Klemme den høyre arteria carotis communis i hver ende av isolerte segmentet med mini-klemmer, plassere skallen klemmen først å tillate arterien fylle, og deretter plassere caudal klemmen.
- Klipp 1 × 2 cm litt stiv papir (tilgjengelig fra sterilt Sutur emballasje) og plasser den under carotis communis, forbedre eksponeringen.
- Utføre en arteriotomy bare skallen på caudal klemmefestet (den caudal arteriotomy). Arteriotomy lengden skal være lik diameteren på skallen slutten av blodåre segmentet. Sett inn sprøyten med IV kateter gjennom caudal arteriotomy og flush arteria carotis lumen med heparinized normal saline.
- Sutur skallen slutten av venen til caudal arteriotomy, 7-0 polypropylen Sutur med enkelt masker (figur 1).
- Plass den første masken å Sutur caudal slutten av caudal arteriotomy til skallen slutten av blodåre segmentet. Plass den andre masken 180° fra den første masken, å Sutur skallen slutten av caudal arteriotomy til skallen slutten av blodåre segmentet.
- Plassere tredje masken til en equidistant fra første to masker, på den laterale siden av anastomose. Plass den fjerde masken på medial side av anastomose, like langt fra to første maskene og overfor tredje masken. Sett 4 ekstra masker (masker 5-8) mellom hvert sting 1-4.
- Utføre den kraniale arteriotomy på caudal side av skallen klippet. Avstanden mellom skallen slutten av den kraniale arteriotomy og caudal slutten av caudal arteriotomy bør være den samme som lengden på blodåre segmentet. Lengden på den kraniale arteriotomy er lik diameteren på caudal slutten av blodåre segmentet.
- Utvide venen cranially fra anastomose, legge den på carotis, uten introdusere noen vendinger. Rødme arteria carotis og vene med heparinized normal saline via den kraniale arteriotomy. Saltkildene vil strømme gjennom arterien, i venen via caudal anastomose og avsluttes fra gratis og unsutured slutten av venen. Flushing venen hindrer også det vri.
- Sutur caudal slutten av venen til den kraniale arteriotomy (figur 1).
- Plass en første masken å Sutur caudal slutten av den kraniale arteriotomy til caudal slutten av blodåre segmentet. Plass en andre masken å Sutur skallen slutten av den kraniale arteriotomy til caudal slutten av blodåre segmentet. Fullfør anastomose som beskrevet i trinn 2.3.5.2. Like før den siste knuten bundet på den kraniale anastomose, kort åpne klemmen på skallen slutten av dissekert felles arteria carotis segmentet, å tillate tilbake-blødning som vasker ut luften i carotis og podet blodåre. Deretter stram den siste knuten.
- Løsne skallen klemmen for å tillate blodåre pode fyller med blod og slipper caudal klemmen. Rask pulseringer bør sees i blodåre graftet. Bruke lett trykk med tørr gasbind stoppe blødninger på forekomst.
- Ligate begge ender av felles arteria carotis segmentet som forbinder forekomst med en 3-0 silke Sutur og dele carotis halvveis mellom ligaturer (figur 1). Gjelde arteria carotis ved hver anastomose flere dråper papaverine (3,5 mg/mL).
- Injiser heparin (75 IE/kg) i øret IV kateter og skyll med 10 mL av saltvann. På denne tiden, injisere buprenorfin (SQ, 0.02 mg/kg) for å gi postoperativ analgesi til fentanyl oppdateringen har gitt smertestillende Plasmanivåer av fentanyl.
Merk: En ekstra buprenorfin injeksjon (SQ, 0.02 mg/kg) kan være nødvendig 6t etter første injeksjon å opprettholde analgesi til plasma fentanyl når en terapeutisk konsentrasjon. - Gjenta pode til venstre (trinn 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Lukk subkutant vev med 5-0 PGA Sutur kontinuerlig mønster. Lukk huden med 3-0 PGA Sutur ved hjelp av et intradermal mønster. Begrave knuter i begge ender.
- La hjelperen fjerne de kirurgiske forstørrelsesglass av kirurg og flytte kirurgisk mikroskopet (25 X) på plass.
- Postoperativ utvinning, rengjøring og omsorg
Merk: La kaninen til å gjenopprette fra anestesi i et rolig og fredelig miljø. Overvåke kaninen kontinuerlig for riktig oksygenering og kroppstemperatur før det er helt gjenopprettet.- Slå av isoflurane og oksygen og koble anestesi maskinen fra kaninen. Koble IV væske slangen fra kaninen, men forlate IV havnen i øret blodåre emergent tilgang.
- Transportere kaninen til å bli frisk bur og sett den på høykant. Gi termisk støtte med varmt vann teppe (eller tvungen luft oppvarming). Gi O2 ved nosecone til SpO2 er stabil.
- Til kaninen kan sitte opp og ambulate i buret sitt, Vend kaninen til den andre siden hvert 15 min. Deretter fjerne øret IV kanyle og tilbake kaninen til buret sitt. Tilbake kaninen til selskapet av andre dyr etter at det er helt tilbake fra anestesi.
- Kast eventuelle avfall følgende aktuelle protokoller for biohazard og sharps avfallshåndtering.
- Postoperatively, sjekk kaninens helse og kirurgiske såret hver dag. Administrere buprenorfin trenger for smerte ikke administreres av fentanyl. Fjerne fentanyl oppdateringen postoperativ dag 3.
3. transkutan ultralyd
- For å vurdere pode patency, utføre ultralyd eksamen på ikke-anesthetized kanin 5-7 dager etter venen-pode kirurgi og genoverføring kirurgi.
- Vikle kaninen ikke anesthetized trygt i et teppe og plassere kaninen ryggen i en veterinær V-gjennom halsen utvidet. Barbere halsen, eller eventuelt fjerne håret med en depilatory agent. Bruke ultralyd gel på halsen og utføre en ultralyd eksamen.
Merk: En ultralyd eksamen er også utført på bedøvet kaniner ved både genet overføring operasjonen og terminal pode harvest kirurgi å undersøke pode patency og måle pode lumen diameter. Eksamen gjøres bare før halsen scrub og utføres på en lignende måte som for ikke-anesthetized kaniner.
- Vikle kaninen ikke anesthetized trygt i et teppe og plassere kaninen ryggen i en veterinær V-gjennom halsen utvidet. Barbere halsen, eller eventuelt fjerne håret med en depilatory agent. Bruke ultralyd gel på halsen og utføre en ultralyd eksamen.
4. genoverføring kirurgi utført ~ 28 dager etter pode plassering (overleve kirurgi)
- Forbered instrumenter og sterile feltet.
- Følg trinn 2.1.1-2.1.3. i Åre pode kirurgi.
- La hjelperen åpne følgende utstyr og enten tas aseptisk sende den til kirurgen eller plassere den på tabellen instrument: seks 1-mL sprøyter (med nål), en 3-mL sprøyte, en 20 mL sprøyte, en 21 G nål, en 19-G-p, 3-0 PGA Sutur , 5-0 PGA Sutur, 7-0 polypropylen Sutur, to 24 G IV katetre og en steril blodet flyt sonde.
- Følg trinn 2.1.5-2.1.6. i Åre pode kirurgi.
- Forberede en 1-mL sprøyte med 1 mL DMEM for vask arterien og venen graftet og forberede to 1-mL-sprøyter med virus løsning (~ 0,5-0,7 mL virus løsning/blodåre pode). La hjelperen tine viruset og fortynne den i DMEM. Forberede en 3-mL sprøyte med 0,5 mL lidocaine/bupivacaine (50/50 blanding, trinn 1.2.4).
- Følg trinn 2.1.8 i blodåre pode kirurgi.
- Isolasjon blodåre grafts og tilstøtende carotis arteriene
Merk: 2 x kirurgisk forstørrelsesglass bør brukes for denne delen.- Kutt huden med electrocautery langs midtlinjen mellom sternal hakket og mandible (ca 7-9 cm i lengde) og klemme huden åpne håndkle festing. Bruke 0,5 mL lidocaine/bupivacaine (50/50 blanding, trinn 1.2.4) til subkutan vev.
- På caudal slutten, gjør en kort lateral klippe gjennom fascia med electrocautery. Rett ut dissekere under fascia langs hele midtlinjen. Med electrocautery, skjære gjennom dissekert fascia langs midtlinjen.
- Start på høyre side. Dissekere mellom sternohyoidus muskelen overliggende luftrøret og V-formet sternocephalic muskler, å avsløre blodåre graftet. Forsiktig isolere blodåre pode og 1.5-2.0 cm arteria carotis tilstøtende graftet på begge skallen og caudal sidene.
- Gjenta dissection til venstre etter trinn 4.2.3.
- Måle blodstrømmen i blodåre graftene.
- Fyll kirurgisk såret hulrommet til høyre med vanlig saltvann aktivere overføring av lydbølger. Lev en 2 mm perivascular flyt sonde (koblet til en volum-flow meter) i saltvann i såret hulrom og angi flyt til null.
- Plass flyt sonden rundt arteria carotis caudal eller skallen blodåre graftet. Postdataene fra flyt sonde med elektroniske data oppkjøpet system.
- Gjenta målingen på venstre side etter trinn 4.3.2.
- Beregne pulsatility basert på topp systolisk strømningshastighet og minimum diastolisk strømningshastighet betyr flyt. Også beregne laminær skjæring stress, basert på infusjonshastigheten og lumen diameter (målt med transkutan ultralyd).
- Infundere vektor løsning i blodåre graftene
Merk: Et kirurgisk mikroskop (16 X) brukes som trengs for punktering, infusjon, og reparasjon av arteria carotis.- Har hjelperen fjerne kirurgens kirurgisk forstørrelsesglass og flytte kirurgisk mikroskopet på plass. Har kirurgen drapere et sterilt håndkle over mikroskopet. Sterilt håndkle kan kirurgen å manipulere mikroskopet samtidig sterilitet.
- Har hjelperen Injiser heparin (150 IE/kg) i IV kateter og flush med saltvann.
- Bruke en stor nål driver for å bøye 21 G nålen til ca 80° rett over skråkant (gjør ikke bøye skråkant; Figur 2A).
- Klemme carotis communis i hver ende av blodåre graft med mini-klemmer, plassere skallen klemmen først å tillate arterien fylle, og deretter plassere caudal klippet. Plass caudal klippet ca 10 mm caudal til anastomose, å gi noen plass i arteriotomy.
- Sett to silke slips rundt arterien bare caudal graftet og knytte en enkelt halvstikk knuten på hver - uten stramme dem.
- Punktering carotis caudal graftet med bøyde 21 G nålen bare skallen av caudal vaskulær klippet. Pass på å ikke punktere rygg eller side vegger. Fremme nålen i lumen frem og tilbake to ganger for å sikre at lumen er klart, så nøye trekke nålen.
Merknader: Felles carotis punktering kan bli hjulpet ved å gripe den arteriell adventitia med fine tang og løfte forsiktig foran veggen mens sette spissen av nålen bare caudal til heis punktet (figur 2A). Dette reduserer risikoen for å treffe bakveggen med nålen. - Med flere ufalsede gasbind pads, lage et reir å plassere sprøyten brukes for infusjoner. Plass denne gasbind reir caudal til kirurgiske området.
- Sett et 24 G IV-kateter på sprøyten med bare DMEM og stram kateter på sprøyten akkurat nok til å hindre lekkasje (sprøyten fjernes senere i denne operasjonen) og bøy kateter ~ 4 mm fra spissen slik at svingen holder på ca 75° etter utgivelse.
- IV kateter inn den vanlige carotis arteriotomy til bøyepunktet og vask blodåre pode lumen to ganger med 0,5 mL av DMEM. For hver gjentakelse, fylle blodåre graftet med DMEM. Fjern deretter DMEM fra graftet ved å trykke lett med en hansker finger på skallen slutten av graftet. Nøye Skyv fingeren mot caudal slutten skal skylle luminal innholdet ut via arteriotomy.
- Fjern DMEM sprøyten fra kateter, forlater kateter i fartøyet. Koble sprøyten som inneholder det virus løsningen, sørge for at ingen luft inn i kateter. Flytte den løst knyttede silke slips ned arterien til de rundt kateter spissen, men ikke trekk dem.
- Tilfører 0,03 mL virus løsning å presse den gjenværende DMEM av kateter. Fjern alle væske fra blodåre pode lumen med en finger, trykke forsiktig fra skallen til caudal.
- Stram de to båndene rundt arterien og kateter spissen å forsegle lumen. Tilfører det virus løsningen til venen er distended. Forsiktig legge sprøyten ned på reiret med gasbind.
Merk: Det er viktig at blodåre graftet utvides til pre signaltransduksjon caliber og forblir oppblåst under virus infusjonen. Hvis ikke, hvor mye genoverføring reduseres betydelig. - La viruset inneholder løsningen i blodåre pode lumen for 20 min, og så ombytte virus inneholder sprøyten festet til kateter med en tom sprøyte. Forsiktig Sug opp virus inneholder løsningen fra graftet til fartøyet kollapser. Fjerne sprøyten, forlater kateter på plass. Kuttet og løse silke bildet og trekke kateter fra fartøyet. Fjern kateter fra arteria carotis nøye for å unngå skade endotelet.
- Med hjelp av kirurgiske mikroskopet, nær arteriotomy med 7-0 polypropylen Sutur ved hjelp av en X-mønster (figur 2B).
- Forstå suture med en nål-holder, angi fartøyet nederst til høyre i arteriotomy og avslutte fartøyet nederst til venstre. Krysse åpningen utenfor fartøyet og gjøre i andre omgang fra øverst til høyre til øverst venstre.
- Før stramme suture, kort slipp skallen vaskulær utklippet for å spyle luft og gjenværende virus fra blodåre pode og arterien. Blod vil flyte ut av arteriotomy når klemmen frigjøres.
- Lukk arteriotomy ved å trekke forsiktig suture ender og knytte dem sammen med 2 plassen knop.
Merk: Trekke suture strammer føre bunching av vev som vil forstyrre, øke trombose risiko, og potensielt innføre ukontrollert variabler.
- Slipp skallen vaskulær klippet, så caudal klippet. Stopp blødninger med gasbind for å bruke lett trykk.
- Rundt denne tiden, injisere buprenorfin (SQ, 0.02 mg/kg) for å gi postoperativ analgesi til fentanyl oppdateringen har gitt smertestillende fentanyl Plasmanivåer.
Merk: En ekstra buprenorfin injeksjon (SQ, 0.02 mg/kg) kan være nødvendig 6t etter første injeksjon å opprettholde analgesi til plasma fentanyl når en terapeutisk konsentrasjon. - Gjenta virus infusjon protokollen på venstre side, følgende trinn 4.4.5-4.4.15.
- Såret nedleggelse
- Lukk subkutant vev med 5-0 PGA Sutur, kontinuerlig mønster. Lukk huden med 3-0 PGA Sutur ved hjelp av et intradermal mønster. Begrave knuter i begge ender.
- Postoperativ utvinning, rengjøring og omsorg
- Følg trinn 2.4.
5. harvest kirurgi (Terminal)
- Forbered instrumenter og det kirurgiske området.
- Følg trinn 2.1.1-2.1.3 i blodåre pode kirurgi.
- La hjelperen åpne og tas aseptisk plasser på tabellen instrument (eller gå til kirurgen): en 20 mL sprøyte, en 21G p, 3-0 silke Sutur og en steril blodet flyt sonde.
- Fremgangsmåten 2.1.5-2.1.6 og 2.1.8 vene pode kirurgi.
- Isolering av felles carotis arteriene og vene grafts
- Kutt huden med electrocautery langs midtlinjen mellom sternal hakket og mandible (ca 7-9 cm i lengde) og klemme kaninens halsen huden håndklær med håndkle klemmer.
- På caudal slutten, gjør en kort lateral klippe gjennom fascia med electrocautery. Rett ut dissekere under fascia langs hele midtlinjen. Skjære gjennom dissekert fascia langs midtlinjen med electrocautery.
- Start på høyre side. Dissekere mellom sternohyoidus muskelen overliggende luftrøret og V-formet sternocephalic musklene å avdekke felles carotis og venen graftet.
- Dissekere den høyre blodåre pode og arteria carotis communis gratis fra omkringliggende vev. Bruk kirurgisk silisium løkker for tilbakekallingen av arterien og venen pode under dissection.
- Gjenta dissection til venstre etter trinn 5.2.3-5.2.4.
- Gjøre flyten målinger følgende trinn 4.3.1-4.3.3 i genet overføring kirurgi.
- Høsting av blodåre graftene
- Med 3-0 silke Sutur, ligate av høyre arteria carotis communis skallen graftet. Deretter ligate carotis caudal graftet.
- Avgiftsdirektoratet høyre blodåre graftet ved å dele den tilstøtende arteria carotis mellom hver av ligations og de tilstøtende anastomose. Fjerne blodåre graftet fra kaninen og flush lumen med saltvann.
- Trim arteria carotis og forekomst fra begge ender av blodåre graft. Klippe bort overflødig adventitial vev fra blodåre graftet og kuttet graftet i segmenter behov for forskjellige endepunktet analyser.
- Høste venstre blodåre graftet ved å gjenta trinn 5.4.1-5.4.3.
- Injisere 1 mL av fenytoin/pentobarbital IV å avlive kaninen.
- Kast eventuelle avfall følgende aktuelle protokoller for biohazard og sharps avfallshåndtering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Teknisk ferdighet av en ny operatør må valideres før operatøren kan bruke denne metoden til å generere eksperimentelle data. Den første milesteinen som en ny operatør må oppnå er konsekvent blodåre pode patency etter både første vene-pode kirurgi og etterfølgende forsinket signaltransduksjon kirurgi. Over 90% patency etter alle operasjoner er ønskelig og oppnåelig. Patency kan vurderes ikke-invasively ved hjelp av transkutan ultralyd, som vi utfører vanligvis postoperativ dag 5-7. I kaninene med patent årer, vil ultralyd eksamen avdekke en stor blodåre med rask caudal til skallen blodstrøm på begge sider av fremre halsen (Figur 3A). Hvis en av blodåre graftene er okkludert, blir det ingen synlig caudal til skallen blodstrøm på side(s) med okkludert graftet. Skallen til caudal blodstrøm vil imidlertid fortsatt oppdages i vena jugularis (Figur 3B).
Den andre milepælen som en ny operatør må oppnå er effektiv signaltransduksjon av vene-graftet endotelceller. Her brukes en adenoviral vektor som uttrykker β-galactosidase til å evaluere effektiviteten av endothelial genoverføring. En ny operatør i vår lab transduced åre grafts med en adenovirus uttrykke β-galactosidase (AdnLacZ) ved hjelp av metodene beskrevet. Graftene ble høstet 3 dager etter signaltransduksjon og skjær i segmenter. Noen deler var farget med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). En face bildebehandling av luminal overflater viste blodåre graftene med effektiv signaltransduksjon (Figur 4A) og dårlig signaltransduksjon (Figur 4B). For å ytterligere evaluere kan ferdighet av en ny operatør, målt β-galactosidase mRNA i ekstrakter av transduced åre graft også ved hjelp av kvantitative revers transkriptase-mediert PCR og normalisere signalet til nivået av glyceraldehyde fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA målt i samme blodåre graftene.
Nivåene av β-galactosidase mRNA i blodåre grafts transduced av den nye operatoren var ikke signifikant forskjellig fra nivåer av β-galactosidase mRNA i blodåre grafts transduced av en erfaren operatør (figur 5). Hvis mRNA prøver fra blodåre graftene transduced av en erfaren operatør ikke er tilgjengelig for sammenligning, graft negativ kontroll blodåre pode mRNA kan genereres ved transducing vene med en ikke-uttrykke kontroll vektor (AdNull). Vi har funnet at de mener nivåene av β-galactosidase mRNA i blodåre grafts transduced av en erfaren operatør er ca 1000 ganger høyere enn bakgrunn PCR signalet for β-galactosidase mRNA målt i AdNull-transduced grafts (figur 5) .
Figur 1 . Plasseringen av en tilbakeført rett eksterne vena jugularis høyre felles arteria carotis graft med slutten til side forekomst. Vene graftet (blå) Burrows til carotis communis (rød) på to forekomst. På hver anastomose, masker (hvit x) er nummerert i rekkefølgen de er plassert. For begge forekomst, sy 1 suturer caudal slutten av arteriotomy til eksterne vena jugularis. Sy 2 suturer skallen slutten av arteriotomy til eksterne vena jugularis. Sy 3 er plassert på den laterale siden av anastomose til en equidistant fra to første maskene. Sy 4 plasseres på medial side av anastomose, like langt fra to første maskene og midt imot maske 3. Fire ekstra masker (masker 5-8) er plassert midt mellom fire eksisterende masker. Arteria carotis segmentet mellom forekomst er samskrevet i begge ender med 3-0 silke suturer (piler) og delt (stiplet linje) halvveis mellom ligaturer. Venstre-sidig grafts utføres på en lignende måte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Etablering og stenging av en arteria arteriotomy. (A) den felles arteria carotis adventitia er grep nær blodåre graftet med fine tang og oppover trekkraft brukes i blodåreveggen. Dette skaper en loddrett overflate, slik at bøyd 21 G nålen settes omtrent parallell til fartøyet lumen, redusere risiko for punktering bakveggen av arterien. (B) i arteriotomy Burrows bruker 7-0 polypropylen i en X-mønster. Første Sutur pass inn arterien lumen nederst rett i arteriotomy (området 1) og avslutter lumen nederst til venstre (siden 2). Suture krysser deretter i arteriotomy. Neste passet inn lumen øverst til høyre (siden 3), og avslutter lumen øverst til venstre (siden 4). Mild trekkraft på endene av suture (ender avslutte 1 og 4-området) lukker arteriotomy. Sutur endene er knyttet med 2 plassen knop. Solid blå sirkler angi plasseringene der suture trenger arterieveggen. De hele, blå linjene viser hvor suture går utenfor arterieveggen; stiplede blå linjer angir at suture ligger innenfor lumen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Transkutan ultralyd bilder av kanin halsen, evaluere vene pode patency 5-7 dager etter pode. (A) Patent blodåre pode (rød) med blodstrømmen i caudal til skallen retning er angitt (pil). (B) okkludert vene pode. Det registreres ingen caudal til skallen blodstrøm (som synes rød). Vena jugularis (blå) med blodstrømmen i skallen til caudal retning angis (stjerne). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Beta-galactosidase transgene uttrykk i vene grafts. 28 dager etter pode, ble kanin blodåre grafts transduced av en 20-minutters inkubasjonstiden for adenoviral vektorer uttrykke β-galactosidase i lumen av kirurgisk isolert blodåre grafts. Vene grafts ble høstet 3 dager etter signaltransduksjon og farget med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) En bildet av luminal overflaten av en blodåre segment viser effektiv signaltransduksjon. (B) En bildet av luminal overflaten av en blodåre segment viser dårlig signaltransduksjon. Skala bar = 1.0 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Uttrykk for beta-galactosidase (β-gal) transgene mRNA i blodåre pode segmenter. 28 dager etter plassering av vena jugularis interposition graftene i kanin carotis, ble graftene transduced med en adenoviral vektor uttrykke beta-galactosidase (AdnLacZ) eller med en kontroll adenoviral vektor som ikke uttrykker en transgene (AdNull ). Operasjoner ble fullført av en erfaren operatør (kirurg 1) eller en ny operatør (kirurg 2). Vene grafts transduced med AdnLacZ var alle høstet 3 dager etter signaltransduksjon. RNA utvunnet fra grafts transduced med AdNull og høstet 14 dager etter signaltransduksjon var også analysert, som en negativ kontroll. Uttrykk for beta-galactosidase mRNA ble kvantifisert ved kvantitative revers transkriptase-mediert PCR, med verdier normalisert til glyceraldehyde fosfat dehydrogenase mRNA målt i samme ekstrakter og uttrykt som vilkårlig enheter (AU). Stolper angir mener verdier. p -verdier er fra rang-sum tester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avgjørende skritt i denne protokollen inkluderer håndtering av anestesi, anticoagulation, kirurgisk manipulasjon av arterien/podet venen og hemodynamic målinger av podet venen. Riktig håndtering av anestesi er avgjørende i denne flere overleve kirurgi modellen som inkluderer to relativt lang operasjoner (vanligvis 3-3,5 t for bilaterale blodåre pode og 1.5-2.5 h for bilaterale pode signaltransduksjon). Vi har administrert anestesi både via en nosecone og endotracheal intubasjon og fant at intubasjon bedre overlevelse etter pode signaltransduksjon kirurgi, muligens fordi positivt trykk ventilasjon hindrer atelectasis og tilhørende respirasjonssvikt. Kanin er utfordrende for å intubate og intubasjon-relaterte airway trauma kan forårsake postoperativ stridor. Men er utfordringene og komplikasjoner av intubasjon en liten pris å betale til fordel for å eliminere de fleste av perioperative sykelighet og dødelighet forbundet med blodåre pode kirurgi.
Anticoagulation er avgjørende for å unngå blodpropp av podet årer, som kan oppstå etter en av overlevelse operasjoner. Trombose synes å være en tidlig postoperativ hendelse, fordi blodåre graftene som er patent på transkutan ultralyd undersøkelse 5-7 dager postoperatively er nesten alltid patent på harvest. Å unngå blodpropp etter første operasjonen (dvs., vene pode), IV heparin administreres før høsting første eksterne vena jugularis. Basert på plasma halveringstiden av heparin i kaniner (1-2 h), administreres en ekstra halv dose av IV heparin før høsting kontralateral eksterne vena jugularis. I tillegg til begge Arteriovenøs forekomst av en individuell blodåre pode er fullført, vi har flush lumen arteria carotis og vene graftet ca hver 8 min med heparinized normal saline. For å unngå pode blodpropp, bør man være forsiktig ikke å skade venen pode-spesielt endotelet-under høsting og pode. Dette inkluderer skånsom håndtering av venen med Kirurgiske instrumenter og etterlot et tynt lag av adventitial fettvev knyttet til venen. Vi har også administrere en enkelt dose av aktuell papaverine podet carotis communis, å forhindre eller reverse vasospasme, som bidrar til blodpropp.
Grundige kirurgisk teknikk er nødvendig under venen pode kirurgi. For å unngå blødninger på forekomst, pode blodpropp og innføring av ukontrollert hemodynamic variabler, må de to arteriotomies være av riktig lengde. Hvis en arteriotomy er for kort, blir vene pode ostial veggen overflødige på stedet av anastomose, lage hull at blødning. Hvis arteriotomy er for lang, strekke venen å dekke arteriotomy vil bringe venen pode vegger i nærheten, gjør det vanskelig for kirurgen å unngå suturing motstridende venen pode veggene sammen (egentlig garanterer postoperativ blodpropp). Videre, hvis blodåre pode lumen gjøres smalere fordi venen var strukket til å dekke en overdrevet lang arteriotomy, en stenose opprettes som øker skjæring stress, predisponerer til blodpropp33og potensielt endrer utfallet variabler som neointimal vekst og vaskulær remodeling34,35. I tillegg er det viktig å unngå presenterer vendinger i blodåre graftet, som kan føre til lumen begrense eller unormal flyt. For å unngå vridning av graftet, vi alltid justere blodåre segmentet langs ventrale overflaten av carotis og sikre det er ingen vendinger i venen. På grunn av potensialet for variabel kirurgisk teknikk å endre vene pode hemodynamics og fordi endret hemodynamics kan påvirke utfallet variabler uavhengig behandling, måler vi rutinemessig blodet flyt og pode diameter før vektor infusjonen og ved tid for innhøsting. Vi bruker disse verdiene til å beregne skjæring stress og pulsatility. Vene graftene med hemodynamic mål utenfor forhåndsbestemt områder kan ekskluderes objektivt fra ytterligere analyse, redusere eksperimentell variasjoner og øke statistisk.
Som vi utviklet denne metoden, gjorde vi flere endringer. I utgangspunktet forsøkte vi blodåre pode genoverføring under pode operasjonen. Men under disse omstendigheter var transgene uttrykk nesten helt tapt av 3 dager etter genet overføring22. Transgene uttrykket ble raskt mistet om blodåre segmentet var transduced i situ og deretter podet eller om venen ble podet først, og deretter transduced. Bare ved å utsette signaltransduksjon før etter venen graftet hadde tilpasset arteriell sirkulasjon (vi ventet til 28 dager etter pode å utføre genoverføring, selv om en kortere forsinkelse kan være mulig), var rask tap av transgene uttrykk unngått22 . Vi har også konvertert nosecone-levert bedøvelsen til endotracheal tube-levert anestesi for andre (genoverføring) kirurgi etter intraoperativ og postoperativ dødsfall. I tillegg etter tilsynelatende aspirasjon lungebetennelse i postoperativ kanin, begynte vi å plassere en liten plast tabell over kaninens magen (under de sterile gardiner). Tabellen ble plassert for å hindre at kirurgen utilsiktet lener seg på kaninens magen, potensielt stimulere gastroesophageal reflux og aspirasjon. Vi hadde ingen flere aspirasjon hendelser etter plassering av tabellen. Men fordi denne plasseringen falt sammen med overgangen til endotracheal intubasjon, kan vi ikke kontrollere som er ansvarlig for å eliminere aspirasjon hendelser.
Denne metoden har også begrensninger. I USA nødvendiggjør bruk av kaniner i stedet for gnagere overensstemmelse med kravene i laboratoriet dyr velferd gjerning i 1966. Følgelig må etterforskerne bruke kanin (eller andre dyr som omfattes av denne loven) har velutstyrte operasjonssaler og ekspert anesthesiologists og gi høy postoperativ overvåking og omsorg. Andre begrensningen er som 2 operasjoner kreves for å sikre vedvarende transgene uttrykk22. Andre kirurgi øker kostnadene eksperimenter og eksponerer hver kanin til et ekstra sett med potensielle operative og perioperative komplikasjoner. Men er vi ikke klar over andre gene overføring tilnærming som oppnår holdbar transgene uttrykk i vene grafts. Tredje begrensning av denne metoden er at det krever kompetanse innen bygging av HDAd vektorer og utarbeidelse av høy-titer HDAd aksjer. Mange laboratorier har ekspertise med første generasjon adenoviral, lentiviral og adeno-assosiert virus (AAV) vektorer, men relativt få grupper har erfaring med HDAd og vanligvis må etablere et samarbeid for å få denne ekspertisen. Klinisk anvendelse av metoden kan også begrenses. For mennesker, vil en andre kirurgi øke både kostnader og komplikasjoner. I tillegg har sammenlignet med menneskelige saphenous årer (brukes for koronar og eksterne bypass kirurgi), kanin eksterne vena årer svært tynne vegger. Det er mulig at veggen jevning og remodeling som oppstår etter at pode en kanin eksterne vena jugularis i arterial sirkulasjonen ville bli svekket hvis blodåre graftet allerede har en tykkere vegg. Til slutt, i eksperimenter i denne modellen varer opptil 6 måneder, ingen av podet utviklet en stenose22. Derfor vises ikke denne metoden å modellere alle biologiske prosesser som bidrar til vene pode feil.
Avslutningsvis bruker metoden en robust dyr modell av menneskelig vaskulær sykdom (kanin) for å generere podet årer som effekter av transgener uttrykkes stabilt lengre tid (minst 6 måneder)22. Stabil uttrykk for effekter av transgener i blodåre grafts vil avsløre sine roller på vanlig måte pode homeostase og vil avklare deres potensial for blodåre pode genterapi. Metoden kan være forbedret og gjort mer klinisk gjeldende av utviklingen av teknikker som tillater PCI levering av vektorer blodåre graftet, og dermed unngå andre kirurgi. Disse teknikkene kan være kateter-baserte36,37, eller de kunne innlemme spesielt forberedt vektorer som injiseres i en ekstern stemning og deretter målrettet til vene pode veggen, for eksempel av magnetfelt38. Metoden vil også tillate testing av vektorer enn HDAd for blodåre pode genterapi, inkludert lentiviral og AAV vektorer samt ikke-viral vektorer. 39 , 40 , 41 , 42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
