Summary
Cette méthode décrit le placement des greffes de veine d’interposition chez le lapin, la transduction des greffons et la réalisation d’expression du transgène durables. Cela permet à l’enquête des rôles physiologiques et pathologiques des transgènes et leurs produits protéiques dans les veines greffées et essais de thérapies géniques pour veine du greffon.
Abstract
Pontage aorto-coronarien greffe veineuse est un traitement pour la maladie artérielle occlusive ; Cependant, les succès à long terme est limitée par échec de greffe à cause de la thrombose, l’hyperplasie intimale et l’athérosclérose. L’objectif de cet article est de démontrer une méthode pour placer greffes d’interposition veineuse bilatérale chez un lapin, puis transduction les greffons avec un vecteur de transfert de gène qui permet d’obtenir l’expression transgénique résistant. La méthode permet à l’enquête sur le rôle biologique des gènes et de leurs produits protéiques dans l’homéostasie greffe veine normale. Il permet également l’essai de transgènes pour les activités qui pourraient empêcher la défaillance d’une greffe veineuse, par exemple., si l’expression d’un transgène empêche la croissance néointimale, réduit l’inflammation vasculaire ou réduit l’athérosclérose chez les lapins nourris avec une alimentation riche en graisses. Au cours d’une chirurgie de survie initiale, les segments de droite et gauche veine jugulaire externe sont excisés et placés sur le plan bilatéral comme bout à l’autre inversé l’artère carotide commune greffes interposition. Au cours d’une deuxième chirurgie survie, 28 jours plus tard, chacun des greffons est isolé de la circulation avec clips vasculaires et les lumières sont remplis (via une artériotomie) avec une solution contenant le vecteur adénoviral (HDAd) dépendant d’assistance. Après une incubation de 20 min, la solution de vecteur est aspirée, l’artériotomie est réparé, et débit est rétabli. Les veines sont récoltés aux moments dictés par des protocoles expérimentaux. Le délai de 28 jours entre le placement de la prothèse et la transduction est nécessaire pour assurer l’adaptation de la prothèse de veine de la circulation artérielle. Cette adaptation permet d’éviter une perte rapide de transgene expression qui se produit dans la veine des greffes transduites avant ou immédiatement après la greffe. La méthode est unique dans sa capacité à atteindre l’expression TRANSGENIQUE durable et stable dans les veines greffées. Par rapport aux autres modèles de prothèse de grande veine animaux, lapins possèdent des avantages de manipulation facile et faible coût. Par rapport aux modèles de greffe de veine rongeurs, lapins ont de plus gros et plus facile-à-manipuler des vaisseaux sanguins qui fournissent des tissus abondante pour l’analyse.
Introduction
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique dans laquelle l’accumulation de lipides et l’inflammation dans la paroi des vaisseaux sanguins conduisent au rétrécissement de la lumière du vaisseau, crises cardiaques, accidents vasculaires cérébraux et perte de membres1,2. Interventions percutanées (e.g., angioplastie et pose d’un stent) et un traitement médical (e.g., agents antiplaquettaires et de statines) est utile comme traitement pour l’athérosclérose ; Cependant, ils sont souvent inefficaces dans le traitement de maladie obstructive sévère dans les circulations coronaires et périphériques. La greffe de pontage, utilisant des segments de veine autogène, reste une procédure commune pour traiter les patients avec maladie vasculaire coronaire et périphérique sévère et diffuse3,4. Cependant, la veine greffons placés dans les deux les coronaires et des circulations périphériques ont de faibles taux de perméabilité à long terme. Dans la circulation coronaire, environ 10 à 20 % de veine greffes sont obstrués à 1 an et 50 % sont obstrués par 10 ans5,6. Dans la circulation périphérique, veine taux d’échec de greffe sont 30 à 50 % à 5 ans7.
La thérapie génique est une approche intéressante pour la prévention de l’échec de greffe veineuse car il peut fournir un produit de gène thérapeutique précisément sur le site de la maladie. En conséquence, de nombreuses études précliniques ont testé veine greffe génique thérapie8,9. Cependant, essentiellement, toutes ces études ont examiné l’efficacité au début temps points (2-12 semaines)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. nous sommes au courant d’aucune preuve que les interventions de la thérapie génique peuvent fournir durable protection (années) contre fin échec de greffe veineuse résultant généralement d’athérosclérose et l’hyperplasie néointimale4. Nous avons développé une méthode qui permet l’expression transgénique résistant dans les veines greffées et permet ainsi l’essai des interventions de la thérapie génique aux moments mais aussi fin qu’au début. Pour atteindre l’expression du transgène durables, la méthode intègre HDAd vecteurs ainsi qu’une stratégie de transduction retardée. HDAd vecteurs fournissent prolongée transgene expression parce qu’ils manquent des gènes viraux, empêchant la reconnaissance (et le rejet) des cellules transduits par le système immunitaire18,19,20, 21. Delayed transduction (effectués 28 jours après la pose de prothèse) empêche la perte de cellules transduits au cours du processus d’arterialization qui se produit tôt après le greffage,22.
Autres méthodes qui atteignent l’expression de transgènes thérapeutiques dans la paroi de la prothèse veine s’appuient sur la transduction de la greffe veineuse au moment de la greffe placement10,11,12,15,16 ,,17. Lorsqu’elle est mesurée en série, transgene expression à l’aide de cette approche diminue rapidement après la transduction22,23. Par conséquent, en utilisant cette approche pas étudié l’efficacité au-delà de 12 semaines après la greffe de veine, plus ne pas évaluer l’efficacité au-delà de 4 semaines. En revanche, notre méthode réalise greffe veineuse continue de transgene expression qui persiste stable pendant au moins 24 semaines et axée sur les études similaires effectuées en artères-probablement beaucoup plus long22,24. Nous sommes au courant d’aucune autre veine greffon gène intervention orthophonique qui réalise l’expression du transgène stable de cette durée.
Nous avons utilisé un modèle de lapin pour développer notre méthode. D’autres ont utilisé des rongeurs, lapins, ou de plus grands animaux à veine d’essai de greffe génique thérapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Par rapport aux modèles de rongeurs, les lapins sont plus chers et sont soumis à des exigences réglementaires plus strictes. Cependant, par rapport aux plus grands animaux (e.g., porcs et chiens), les lapins sont beaucoup moins cher à l’achat et la maison et beaucoup plus facile à gérer. En outre, vaisseaux du lapin ressemblent à des vaisseaux humains physiologiquement27, ils sont suffisamment importants, ils peuvent être utilisés pour l’essai des interventions percutanées28,29, qu’ils fournissent suffisamment tissu qui plusieurs points de terminaison (e.g., histologie, protéine, RNA) peuvent être examinées à l’aide d’un seul vaisseau sanguin spécimen22,30. En outre, lorsque les lapins avec veine greffes sont nourris avec une alimentation riche en graisses, elles développent veine greffon athérosclérose31,32, qui est une cause fréquente d’artères coronaires pontage veine greffon échec4,5 . Ces greffes de veine athéroscléreuse lapin peuvent servir comme un substrat pour l’essai des interventions de thérapie génique livrées avec cette méthode. Le protocole fourni peut aider les enquêteurs à maîtriser les compétences techniques nécessaires à la réalisation durable transgene expression dans les greffons de veine de lapin.
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Protocol
Tous les protocoles de l’animales et les études ont été approuvées par l’Université de Washington Office de bien-être des animaux.
1. avant utilisation (pour toutes les chirurgies)
- Anesthésier le lapin avec 30 mg/kg de xylazine kétamine et 1,5 mg/kg par injection intramusculaire (IM) dans les muscles paraspinous.
Remarque : Les aliments et l’eau sont limitent pas avant la chirurgie. - En attendant une profondeur suffisante de l’anesthésie, mis en place les tables dans la salle de préparation et de la salle d’opération (OR).
- Préparer la salle de préparation pour raser le cou du lapin et du placement du port par voie intraveineuse (IV) dans l’oreille (chirurgie de survie uniquement). Placez la pommade ophtalmique, tondeuses à cheveux, patch de fentanyl (chirurgie de survie), tampon alcoolisé, 24-G x ¾" cathéter, port d’injection et ruban chirurgical sur la table de préparation.
- Dans l’OR, mettre en place les équipements de surveillance et d’associés de sondes (électrocardiogramme (ECG), oxymétrie de pouls (SpO2) et la température). Préparer la pompe IV avec une poche de IV 100 mL solution saline avec une aiguille 18 ou 19-G et de régler le débit que 10 mL/h/kg (chirurgie de survie uniquement). Mettre en place l’équipement d’oxygène et isoflurane avec une ogive (veine greffage ou récolte chirurgies).
- Pour aider à sécuriser l’ogive au lapin, enroulez une bande de gaze autour du tube qui fournit du gaz à la pointe. Cette boucle doit entourer le tube où il se fixe à la pointe. Les extrémités libres de la bande de gaze devraient tous deux être environ 45 cm de long. Placer l’ogive (avec de la gaze ci-joint) sur la tête de ligne du tableau.
- Faire couler l’eau circulante et/ou réchauffement de couverture sur la table d’OR à air pulsé. Sur la couverture de réchauffement de la planète, placez une serviette roulée comme un collier de soutien et placer la plaque électrode de dispersion de bistouri électrique.
- Comme un analgésique local, se combinent dans une seringue de 1 mL de chlorhydrate de lidocaïne 2 % et 1 mL de bupivacaïne 0,5 % HCl. diluer le virus de la concentration désirée (ici, utiliser 2 x 1011 particules virales/mL pour HDAd) à DMEM stérile et tient sur la glace (chirurgie de transfert de gène seulement).
- Après qu’une profondeur anesthésique adéquate est atteint, préparer le lapin pour la chirurgie.
Remarque : Vérifier l’absence d’un réflexe de retrait pédale afin d’assurer une profondeur anesthésique adéquate. Continuer à surveiller le réflexe pédale tout au long de la chirurgie.- Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux du lapin.
- Pour permettre la mise en place d’une sonde de température rectale, presser avec les doigts gantés juste au-dessus du rectum et déplacer les doigts vers l’anus pour enlever stooling de rectum du lapin.
- Raser le lapin du cran sternal jusqu’au bord de la mandibule. Raser une oreille pour le placement de l’IV et l’oreille opposée pour l’administration de patch de fentanyl (chirurgie de survie uniquement). Rasez les orteils milieu arrière gauche pour le placement de la sonde de2 SpO.
- Pour la chirurgie de vecteur de perfusion, intubation le lapin. Utilisez un 4 mm O.D./3 mm I.D. ballonnet sonde endotrachéale, enfilé sur un arthroscope. Placer le lapin en décubitus sternal et hyper extension du cou. Tenez la bouche du lapin grande ouverte et l’arthroscope permet de visualiser les plis de la glotte et le larynx. Au cours de l’inspiration, insérez doucement la sonde endotrachéale dans le larynx et la trachée.
- Pour les chirurgies de la survie, placez et fixez un cathéter IV de 24-G dans la veine d’oreille gauche du lapin et couronner avec un orifice d’injection. Appliquer un patch de 25 µg/h fentanyl à l’oreille droite du lapin.
Remarque : Le protocole est pour un chirurgien positionné sur le côté droit du lapin. Si le chirurgien sera sur le côté gauche du lapin, inverser les côtés dans cette étape de garder les fils et IV en face du chirurgien. Basculer les côtés dans les prochaines étapes si nécessaire. - Pour les chirurgies de greffage et de récolte de veine, administrer une anesthésie générale avec une ogive ; pour la chirurgie de perfusion de vecteur, administrer une anesthésie générale par une sonde endotrachéale.
Remarque : L’Intubation peut être utilisée pour toutes les chirurgies. Dans notre expérience, cependant, les risques de complications de traumatisme trachéal et laryngé pendant l’intubation peuvent emporter sur les avantages de l’intubation. La chirurgie qui comprend le transfert de gènes à un greffon (particulièrement chez les lapins nourris cholestérol) est la seule chirurgie dans lequel intubation semble apporter un bénéfice net. - Porter le lapin dans l’OR. Placer le lapin dans une position couchée sur la table d’opération avec la serviette de soutien cou placée juste sous la tête du lapin. Doucement s’étendent cou du lapin jusqu'à ce qu’elle est droite et horizontale environ.
- Placer l’ogive au lapin (chirurgies de greffage et de récolte de veine) ou connecter la sonde endotrachéale (vecteur perfusion chirurgie) avec O2 à 1 L/min et commencer l’isoflurane. Si vous utilisez une ogive, fixez-le en encapsulant les extrémités des bandes gaze attaché autour de serviette de soutien pour le cou du lapin. Ajuster la concentration de l’isoflurane au besoin (en général 1-2 %) pour maintenir un niveau chirurgical de l’anesthésie.
- Centre de la plaque d’électrode de dispersion de bistouri électrique sous DOS du lapin. Introduire la sonde de température rectale et appliquez le SpO2 sonde et fils d’EKG sur le lapin.
- Connectez la saline intraveineuse au port cathéter dans l’oreille gauche du lapin et démarrer la pompe à perfusion à 10 mL/h/kg. Après 1 h, réduire le taux de perfusion de solution saline à 5 mL/h/kg.
- Attacher lâchement pattes avant du lapin à la table d’opération comme un dispositif de retenue.
Remarque : Éventuellement, une petite table en plastique peut être placée sur le lapin pour prévenir le chirurgien en appuyant sur thorax/abdomen du lapin, et pouvant causer des aspirations et des reflux gastro-oesophagien. - Injecter par voie sous-cutanée de lidocaïne/bupivacaïne (mélange 50/50, 2 mL, étape 1.2.4) (SQ) dans le cou le long de la ligne d’incision prévue, pour l’anesthésie locale.
- Avoir l’assistant désinfecter l’intervention chirurgicale du site avec 3 alternant scrubs de gluconate de chlorhexidine et d’isopropanol, puis vaporiser le site povidone-iode. Avoir le gommage chirurgien, blouse et des gants, suivant les principes aseptiques.
- Effectuer des chirurgies de survie dans des conditions aseptiques. Avoir l’assistant gérer tous les éléments non stériles et passer aseptiquement matériel stérile au chirurgien ou aseptiquement, placez-les sur la table de l’instrument drapé.
- Avoir les chirurgien usage stérile serviettes aseptiquement manipuler de matériel non stérile comme le microscope. Avoir le chirurgien porter 2 x loupes chirurgicales lors de l’exécution de la première moitié de la chirurgie.
2. veine greffe chirurgie (survie)
- Préparer les instruments et le champ stérile.
- Ont l’assistant ouvre sacs stériles (un drap de la table, un drap de papier et 6 serviettes) et transférer stérilement le contenu au chirurgien.
- Drapé de la table de l’instrument. Placez le drap de papier et serviettes stériles sur la table de l’instrument drapé. Avec 4 serviettes, drapez le lapin, laissant seulement le champ opératoire sur le cou exposé. Posez le drap de papier sur le lapin. Une serviette servira plus tard, et le dernier est une sauvegarde.
- Avoir l’assistant ouvrir le pack instrument stérilisé et aseptiquement passer le plateau à instruments au chirurgien. Ranger les instruments sur la table de l’instrument.
- Avoir l’assistant ouvrir l’équipement suivant et aseptiquement passez-le au chirurgien ou placez-la sur la table de l’instrument : une seringue de 3 mL, une seringue de 20 mL, une aiguille 21 G, suture de (PGA) l’acide polyglycolique 3-0, une seringue de 1 mL, suture PGA 5-0 , la suture en polypropylène 7-0 et un cathéter IV de 24 G.
- Fixer le câble de bistouri électrique à drapé couvrant le lapin, en utilisant une pince Kantrowitz 7.25". Déposer l’autre extrémité du câble sur le bord de la table d’opération pour être raccordé à l’appareil d’électrochirurgie et activée par l’assistant.
- Remplissez une seringue de 20 mL avec du sérum physiologique stérile d’une poche de solution saline ou flacon détenues par l’assistant. Utiliser cette solution saline au besoin pour empêcher la déshydratation des tissus exposés lors de l’opération.
- Préparer 5 mL de solution saline physiologique héparinée en ajoutant 0,1 mL d’héparine de 5 000 UI/mL à 5 mL de solution saline, i.e., héparine de 100 UI/mL, dans un petit bol chirurgical. Utilisez cette solution pour rincer la prothèse de l’artère et la veine carotide régulièrement au cours de la procédure de greffe.
- Découper un trou dans le drap de papier sur le site de la chirurgie sur le cou du lapin. Utiliser les pinces de serviette pour fixer les coins du trou en place pour les serviettes sous-jacent.
- Dissection vasculaire
Remarque : Utilisez 2 loupes chirurgicales x pour faciliter cette partie de la chirurgie.- Couper la peau avec le bistouri électrique le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et de la mandibule (environ 7-9 cm de longueur) et serrer la peau du cou du lapin pour les serviettes avec les pinces de la serviette. À l’extrémité caudale, faites une coupe latérale courte à travers le fascia avec bistouri électrique. Carrément disséquer sous le fascia le long de la ligne entière médiane à l’aide de grands ciseaux. Couper à travers la couche aponévrotique disséquée le long de la ligne médiane avec le bistouri électrique.
- Commencer sur le côté droit. Disséquer entre le muscle sternohyoid, recouvrant la trachée et le muscle en forme de V sternocephalic, d’exposer l’artère carotide commune.
- Soigneusement disséquer un segment de 4 à 5 centimètres de l’artère carotide commune et ses grosses branches (généralement 1-2 par côté) contre les tissus environnants. Étendre la dissection de la base du cou dans la partie proximale de la traversée du nerf pharyngien distalement. Utilisation les boucles de silicium chirurgicales pour aider à la rétraction de l’artère carotide au cours de la dissection. Ligaturer les grosses branches de l’artère carotide commune avec sutures soie 5-0 avant de couper chaque branche distale.
Remarque : Veillez à ne pas déranger le nerf vague qui est parallèle à l’artère carotide commune, ou les petits nerfs qui traversent sur l’artère. - Répétez la dissection du côté gauche (étape 2.2.3).
- Pince porte-tissu permet de fermer temporairement la couche de tissu sous-cutané. Disséquer le fascia superficiel de la peau sur le côté droit jusqu'à ce que la veine jugulaire externe est exposée. Disséquer un segment de 4 à 5 centimètres de la veine jugulaire externe et sans ses branches des tissus environnants, ligature des petites branches avec sutures soie 5-0 avant de couper la branche.
- Répétez la dissection du côté gauche (2.2.5 étape).
- Injecter de l’héparine (150 UI/kg) dans le cathéter IV et rincer avec 10 mL de sérum physiologique.
- Mesurer un segment de 3 cm de la veine jugulaire externe sur le côté droit et ligaturer l’extrémité caudale du segment avec suture de soie de 5-0. Laissez la veine remplir de sang, puis ligaturer l’extrémité crânienne du segment veine. Diviser l’extrémité crânienne du segment veine jugulaire externe, rincer soigneusement le bateau avec sérum physiologique hépariné (100 U/mL) à l’aide d’une seringue de 3 mL, attachée à un 24-G IV-cathéter. Diviser le segment de veine à son extrémité caudale. Placer le segment de veine dans une position standard, dans laquelle l’extrémité caudale et crâniennes est clairement identifiables.
- Greffage de veine
- Laissez l’assistant retirer la loupe chirurgicale le chirurgien et déplacez le microscope chirurgical (25 X) en position.
Remarque : Le chirurgien doit pendre une serviette stérile au microscope. Cela permet au chirurgien de manipuler le microscope tout en conservant la stérilité. - Clamper la carotide commune droite à chaque extrémité du segment isolé avec mini serre-joint, en plaçant la pince crânienne tout d’abord pour permettre l’artère de remplissage, puis placer la pince caudale.
- Couper un morceau de cm 1 × 2 de papier rigide (disponible chez emballages stériles pour sutures) et placez-le sous l’artère carotide commune, afin d’améliorer l’exposition.
- Effectuer une artériotomie juste crânienne à la pince caudale (l’artériotomie caudal). La longueur de l’artériotomie doit être égale au diamètre de l’extrémité crânienne du segment veine. Insérer la seringue avec le cathéter IV par le biais de l’artériotomie caudale et rincer la lumière de l’artère carotide avec sérum physiologique hépariné.
- Suture de l’extrémité crânienne de la veine à l’artériotomie caudale, à l’aide de la suture en polypropylène 7-0 avec des points simples (Figure 1).
- Placer le premier point pour l’extrémité caudale de l’artériotomie caudale à l’extrémité crânienne du segment veine de suture. Placer le deuxième point 180° par rapport à la première broderie, à l’extrémité crânienne de l’artériotomie caudale à l’extrémité crânienne du segment veine de suture.
- Place le troisième point en un point équidistant des deux premiers points, sur le côté latéral de l’anastomose. Placer le quatrième point sur le côté médial de l’anastomose, équidistant des deux premières mailles et en face de la troisième maille. Placer 4 points supplémentaires (points 5 à 8) entre chacun des points 1 à 4.
- Effectuer l’artériotomie crânienne du côté caudal de l’attache crânienne. La distance entre l’extrémité crânienne de l’artériotomie crânienne et l’extrémité caudale de l’artériotomie caudale devrait être identique à la longueur du segment de veine. La longueur de l’artériotomie crânienne est égale au diamètre de l’extrémité caudale du segment veine.
- Étendre la veine proche de l’anastomose, il pose sur le dessus de la carotide, sans introduire des rebondissements. Rincer la carotide et la veine avec sérum physiologique hépariné via l’artériotomie crânienne. La solution saline s’écoulera à travers l’artère, dans la veine par l’intermédiaire de l’anastomose caudale et sortira de l’extrémité libre et suture de la veine. Flushing la veine il empêche aussi de tourner.
- Suture de l’extrémité caudale de la veine à l’artériotomie crânienne (Figure 1).
- Placer un premier point pour l’extrémité caudale de l’artériotomie crânienne à l’extrémité caudale du segment veine de suture. Placer un deuxième point pour l’extrémité crânienne de l’artériotomie crânienne à l’extrémité caudale du segment veine de suture. Compléter l’anastomose comme indiqué au point 2.3.5.2. Juste avant le dernier nœud est lié sur l’anastomose crânienne, brièvement ouvrir la pince sur l’extrémité crânienne du segment artère carotide commune disséqués, afin de permettre le dos-un saignement qui délave les airs dans l’artère carotide et la veine greffé. Puis visser le dernier nœud.
- Relâcher la pince crânienne pour permettre de remplissage greffe veineuse avec sang et puis relâcher la pince caudale. Pulsations rapide doivent être considérées dans la greffe de veine. Appliquez une légère pression avec une gaze sèche d’arrêter tout saignement dans les anastomoses.
- Ligaturer les deux extrémités du segment de la carotide commune qui relie les anastomoses avec une suture de soie de 3-0 et diviser la carotide à mi-chemin entre les ligatures (Figure 1). Appliquer plusieurs gouttes de la papavérine (3,5 mg/mL) à l’artère carotide adjacent à chaque anastomose.
- Injecter l’héparine (75 UI/kg) dans le cathéter oreille IV et rincer avec 10 mL de sérum physiologique. A cette époque, injecter la buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) pour fournir l’analgésie postopératoire jusqu'à ce que le patch de fentanyl a fourni analgésique concentration plasmatique de fentanyl.
Remarque : Une injection supplémentaire de buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) peut être nécessaire 6 h après la première injection à maintenir une analgésie jusqu’au fentanyl plasma atteint une concentration thérapeutique. - Répétez le greffage sur le côté gauche (étapes 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Fermer le tissu sous-cutané avec suture de PGA de 5-0 à l’aide d’un motif continu. Fermer la peau avec suture de PGA 3-0 à l’aide d’un modèle intradermique. Enterrer les nœuds aux deux extrémités.
- Laissez l’assistant retirer la loupe chirurgicale le chirurgien et déplacez le microscope chirurgical (25 X) en position.
- Entretien, nettoyage et récupération post-opératoire
Remarque : Laissez le lapin récupérer de l’anesthésie dans un environnement calme et tranquille. Surveiller le lapin en permanence pour bonne oxygénation et la température corporelle jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré.- Désactiver l’isoflurane et oxygène et débrancher la machine d’anesthésie du lapin. Débranchez la tubulure de liquide IV du lapin, mais laisser le port IV dans la veine de l’oreille pour accès émergente.
- Transporter le lapin à une cage de récupération et placez-le sur le côté. Fournir un soutien thermique avec une eau chaude couverture (ou chauffage à air pulsé). Donner O2 en ogive jusqu'à ce que le SpO2 est stable.
- Jusqu'à ce que le lapin peut s’asseoir et se déplacer dans sa cage, mettez le lapin à son autre côté toutes les 15 min. Puis retirer la canule IV d’oreille et revenir le lapin de sa cage. Rendre le lapin à la compagnie d’autres animaux qu’après qu’il est complètement remis de l’anesthésie.
- Jeter tous déchets suivant les protocoles appropriés pour biohazard et élimination des déchets tranchants.
- Après l’opération, vérifier la santé du lapin et la plaie opératoire chaque jour. Administrer la buprénorphine comme nécessaire pour la douleur non gérée par le patch de fentanyl. Retirer le patch de fentanyl au jour postopératoire 3.
3. transcutanée par ultrasons
- Afin d’évaluer la perméabilité de la greffe, effectuer échographie non anesthésiés lapin 5-7 jours après la chirurgie de greffe veineuse et chirurgie de transfert génétique.
- Envelopper le lapin non anesthésiés en toute sécurité dans une couverture et placer le lapin en position couchée dans un creux V vétérinaire avec son cou étendu. Raser le cou, ou le cas échéant, enlever les poils avec un produit dépilatoire. Appliquer le gel d’échographie au cou et d’effectuer une échographie.
Remarque : Une échographie est également effectuée sur des lapins anesthésiés au moment de l’opération de transfert de gène et la chirurgie de récolte de greffon terminal pour examiner la perméabilité du greffon et mesurez le diamètre du greffon lumen. L’examen est effectué juste avant le lavage du cou et s’effectue de la même manière que pour les lapins non anesthésiés.
- Envelopper le lapin non anesthésiés en toute sécurité dans une couverture et placer le lapin en position couchée dans un creux V vétérinaire avec son cou étendu. Raser le cou, ou le cas échéant, enlever les poils avec un produit dépilatoire. Appliquer le gel d’échographie au cou et d’effectuer une échographie.
4. transfert de gènes chirurgie exécutée ~ 28 jours après la pose de prothèse (chirurgie de survie)
- Préparer les instruments et le champ stérile.
- Suivez les étapes 2.1.1-2.1.3. dans la chirurgie de greffe de veine.
- Laissez l’assistant ouvrir l’équipement suivant et soit aseptiquement passez-le au chirurgien ou placez-la sur la table de l’instrument : six seringues de 1 mL (avec aiguille), une seringue de 3 mL, une seringue de 20 mL, une aiguille 21 G, une aiguille 19 G, suture PGA 3-0 , Suture PGA 5-0, 7-0 suture en polypropylène, deux cathéters IV de 24 G et une sonde de débit sanguin stérile.
- Suivez les étapes 2.1.5-2.1.6. dans la chirurgie de greffe de veine.
- Préparer une seringue de 1 mL avec 1 mL DMEM pour laver le greffon artère et la veine et de préparer deux 1-mL-seringues-solution antivirus (~ 0,5 à 0,7 greffon de solution/veine virus mL). Laissez l’assistant décongeler le virus et le diluer dans DMEM. Préparez une seringue de 3 mL avec 0,5 mL de lidocaïne/bupivacaïne (mélange 50/50, point 1.2.4).
- Suivez l’étape 2.1.8 dans la chirurgie de greffe de veine.
- Isolement des greffes de veines et les artères carotides adjacentes
NOTE : 2 x loupes chirurgicales devrait être utilisé pour cette partie.- Couper la peau avec le bistouri électrique le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et de la mandibule (environ 7-9 cm de longueur) et serrer la peau ouverte avec des colliers de serviette. Appliquer 0,5 mL de lidocaïne/bupivacaïne (mélange 50/50, point 1.2.4) pour le tissu sous-cutané.
- À l’extrémité caudale, faites une coupe latérale courte à travers le fascia avec bistouri électrique. Carrément disséquer sous le fascia le long de la ligne médiane ensemble. Avec bistouri électrique, couper à travers le fascia disséqué le long de la ligne médiane.
- Commencer sur le côté droit. Disséquer entre le muscle sternohyoid qui vient se superposer la trachée et le muscle en forme de V sternocephalic, d’exposer la greffe veineuse. Soigneusement isoler la greffe veineuse et 1,5 à 2,0 cm de l’artère carotide adjacente à la greffe sur les deux faces crâniale et caudales.
- Répétez la dissection sur le côté gauche après étape 4.2.3.
- Mesurer le flux sanguin dans les veine des greffes.
- Remplir la cavité de la plaie opératoire sur le côté droit avec une solution saline normale pour permettre la transmission des ondes sonores. Plonger dans la solution saline dans la cavité de la plaie, d’une sonde de débit de périvasculaires de 2 mm (relié à un compteur de débit-volume) et régler le débit à zéro.
- Placez la sonde de flux autour de l’artère carotide caudale ou crânienne à la greffe de veine. Enregistrer des données de la sonde de débit avec un système d’acquisition de données électroniques.
- Répétez la mesure du débit sur le côté gauche après étape 4.3.2.
- Calculer la pulsatilité basée sur le débit moyen débit systolique de pointe et un débit minimum diastolique. Aussi calculer la contrainte de cisaillement laminaire, basé sur le débit et diamètre du lumen (mesurée par échographie transcutanée).
- Infuser le vecteur solution dans les veine des greffes
Remarque : Un microscope chirurgical (16 X) est utilisé au besoin pour la ponction, infusion et la réparation de l’artère carotide.- Avoir l’assistant supprimer loupes chirurgicales du chirurgien et déplacez-y le microscope chirurgical de position. Avoir le chirurgien pende une serviette stérile au microscope. La serviette stérile permet au chirurgien de manipuler le microscope tout en conservant la stérilité.
- Avoir l’assistant injecter l’héparine (150 UI/kg) dans le cathéter IV et rincer avec du sérum physiologique.
- Utiliser un pilote de grande aiguille pour plier l’aiguille de 21 G à environ 80°, juste au-dessus du biseau (ne pas plier le biseau ; Figure 2 a).
- Clamper la carotide commune à chaque extrémité de la greffe de veine avec mini serre-joint, en plaçant la pince crânienne tout d’abord pour permettre artère de remplissage, puis placer le clip caudal. Place le clip caudal caudale à l’anastomose, environ 10 mm pour laisser une certaine marge pour l’artériotomie.
- Mettre deux cravates en soie autour de l’artère caudale juste à la greffe et nouez un nœud unique de chacun - sans les serrer.
- Percez la carotide caudale à la prothèse avec l’aiguille 21 G plié juste crânienne du clip vasculaire caudal. Faire attention à ne pas percer les murs arrière ou latérales. Avancer l’aiguille dans la lumière arrière-et-vient deux fois pour que la lumière soit claire, puis soigneusement retirer l’aiguille.
Notes : Ponction carotidienne commune peut être facilitée en saisissant l’adventice artérielle avec une pince fine et en soulevant doucement la façade tout en insérant la pointe de l’aiguille juste caudale jusqu’au point de levage (Figure 2A). Cela réduit le risque de frapper le mur du fond avec l’aiguille. - Avec plusieurs tampons de gaze non plié, créer un nid pour placer la seringue utilisée pour les infusions. Placez ce nid de gaze caudal au site chirurgical.
- Placer un 24 G IV-cathéter sur la seringue avec DMEM-only et serrer le cathéter sur la seringue juste assez pour éviter les fuites (la seringue sera supprimée plus tard dans cette chirurgie) et plier le cathéter ~ 4 mm de l’extrémité pour que le coude est titulaire à environ 75° après qu’il est libéré.
- Insérer le cathéter IV dans l’artériotomie carotide commune jusqu’au point de virage et laver le lumen de greffe veine deux fois avec 0,5 mL de DMEM. Pour chaque répétition, remplir la prothèse de veine de DMEM. Supprimez le DMEM de la prothèse en appuyant légèrement avec un doigt ganté à l’extrémité crânienne du greffon. Glisser le doigt vers l’extrémité caudale de la prothèse afin d’éliminer le contenu luminal par l’intermédiaire de l’artériotomie.
- Retirer la seringue DMEM du cathéter, laissant le cathéter dans le vaisseau. Connecter la seringue contenant la solution de virus, en s’assurant qu’aucun air ne pénètre dans le cathéter. Déplacer que la soie souplement nouée des liens vers le bas de l’artère jusqu'à ce qu’ils sont autour de l’extrémité du cathéter, mais ne pas serrer les.
- Faire infuser 0,03 mL de solution antivirus pour pousser le DMEM restant sur le cathéter. Retirez tous les fluides de la lumière du greffe veine avec un doigt, en appuyant légèrement du crâne à la caudale.
- Serrer les deux liens autour de la pointe de l’artère et le cathéter pour sceller la lumière. Faire infuser la solution virus jusqu'à ce que la veine est distendue. Déposer délicatement la seringue sur le nid de gaze.
Remarque : Il est vital que la greffe de veine se développe pour son calibre de transduction avant et reste gonflée pendant la perfusion de virus. Si ce n’est pas le cas, le montant du transfert de gènes est considérablement réduit. - Laissez la solution contenant le virus dans le lumen de greffe veineuse pendant 20 min et puis remplacer la seringue contenant le virus attachée au cathéter avec une seringue vide. Aspirer doucement la solution contenant le virus de la prothèse jusqu'à ce que le navire s’effondre. Retirer la seringue, en laissant le cathéter en place. Couper et délier les sutures en soie et retirer le cathéter du vaisseau. Retirer le cathéter de l’artère carotide avec précaution pour éviter d’endommager l’endothélium.
- Avec l’aide du microscope chirurgical, fermer l’artériotomie avec suture en polypropylène 7-0 à l’aide d’un modèle X (Figure 2B).
- Saisir la suture avec un porte-aiguille, entrer dans le bateau en bas à droite de l’artériotomie et quitter le navire en bas à gauche. Traversez l’ouverture à l’extérieur du navire et faire la seconde passe du haut à droite en haut à gauche.
- Avant de serrer la suture, brièvement relâcher la pince vasculaire crânienne pour vider l’air et virus résiduel de la greffe de veine et artère. Sang s’écoule de l’artériotomie en relâchant la bride.
- Fermer l’artériotomie en tirant doucement sur la suture se termine et les attacher avec 2 noeuds de square.
Remarque : En tirant la suture trop serré cause regroupement du tissu qui va perturber la circulation, augmenter le risque de thrombose et introduire potentiellement variables incontrôlées.
- Relâchez le clip vasculaire crânien, puis le clip caudal. Arrêter tout saignement à l’aide de gaze d’appliquer une légère pression.
- À cette époque, injecter la buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) pour fournir l’analgésie postopératoire jusqu'à ce que le patch de fentanyl a fourni fentanyl analgésique plasmatique.
Remarque : Une injection supplémentaire de buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) peut être nécessaire 6 h après la première injection à maintenir une analgésie jusqu’au fentanyl plasma atteint une concentration thérapeutique. - Répétez le protocole de perfusion de virus sur le côté gauche, suivant étapes 4.4.5-4.4.15.
- Fermeture de la plaie
- Fermer le tissu sous-cutané avec suture de PGA 5-0, à l’aide d’un motif continu. Fermer la peau avec suture de PGA 3-0 à l’aide d’un modèle intradermique. Enterrer les nœuds aux deux extrémités.
- Entretien, nettoyage et récupération post-opératoire
- Suivez l’étape 2.4.
5. récolte chirurgie (Terminal)
- Préparer les instruments et le champ opératoire.
- Suivez les étapes 2.1.1-2.1.3 dans la chirurgie de greffe de veine.
- Laissez l’assistant ouvrir aseptiquement Placez sur la table de l’instrument (ou passer au chirurgien) : une seringue de 20 mL, une aiguille 21G, suture de soie de 3-0 et une sonde de débit sanguin stérile.
- Suivez les étapes 2.1.5-2.1.6 et 2.1.8 veine chirurgie de greffe.
- Isolement des artères carotides communes et greffes de veine
- Couper la peau avec le bistouri électrique le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et de la mandibule (environ 7-9 cm de longueur) et serrer la peau du cou du lapin pour les serviettes avec serviette pinces.
- À l’extrémité caudale, faites une coupe latérale courte à travers le fascia avec bistouri électrique. Carrément disséquer sous le fascia le long de la ligne médiane ensemble. Couper à travers le fascia disséqué le long de la ligne médiane avec le bistouri électrique.
- Commencer sur le côté droit. Disséquer entre le muscle sternohyoid, recouvrant la trachée et les muscles en forme de V sternocephalic d’exposer le greffon carotide et la veine commun.
- Disséquer le greffon de la veine droite et artère carotide commune libre les tissus environnants. Utilisez des boucles chirurgicale de silicium pour la rétraction de l’artère et la veine greffe au cours de la dissection.
- Répétez la dissection du côté gauche suite à des mesures 5.2.3-5.2.4.
- Effectuer des mesures de débit suivant étapes 4.3.1-4.3.3 dans la chirurgie de transfert de gène.
- Récolte des greffons veine
- Avec suture de soie de 3-0, ligaturer l’artère carotide commune droite crânienne à la greffe. Puis ligaturer la carotide caudale à la greffe.
- Excise la greffe veine droite en divisant la carotide adjacente entre chacun des ligature des trompes et l’anastomose adjacent. Retirer le lapin de la greffe de veine et rincer la lumière avec une solution saline.
- Couper la carotide et les anastomoses des deux extrémités de la greffe de veine. Tailler loin excès de tissu adventitiels de la greffe de veine et couper le greffon en segments comme requis pour les analyses de point de terminaison différent.
- Récolter le greffon de la veine gauche en répétant les étapes 5.4.1-5.4.3.
- Injecter 1 mL de phénytoïne/pentobarbital IV à euthanasier le lapin.
- Jeter tous déchets suivant les protocoles appropriés pour biohazard et élimination des déchets tranchants.
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Representative Results
La compétence technique d’un nouvel opérateur doit être validée avant que l’opérateur peut utiliser cette méthode pour générer des données expérimentales. La première étape qui doit parvenir à un nouvel opérateur est perméabilité greffe veineuse cohérent après la chirurgie initiale de veine-greffe tant la chirurgie ultérieure de retard-transduction. Perméabilité plus de 90 % après chacun des cabinets de consultation est souhaitable et réalisable. La perméabilité peut être évaluée à l’aide de façon non invasive échographie transcutanée, qui nous effectuent généralement le jour postopératoire 5-7. Chez les lapins avec des veines de brevets, l’échographie révèle un gros vaisseau sanguin avec du débit sanguin caudal-à-crânien rapide sur les deux côtés du cou antérieure (Figure 3A). Si ou l’autre des veine des greffes est obstrué, il n’y aura aucun sanguine caudal-à-crânien détectables sur les côtés avec le greffon occlus. Toutefois, le débit sanguin crânien-à-caudale pourront toujours être détecté dans la veine jugulaire interne (Figure 3B).
La deuxième étape qui doit parvenir à un nouvel opérateur est efficace transduction des cellules endothéliales de veine-greffons. Ici, un vecteur adénoviral qui exprime la β-galactosidase est utilisé pour évaluer l’efficacité du transfert de gènes endothéliale. Un nouvel opérateur dans notre laboratoire transduites veine greffes avec un adénovirus qui exprime la β-galactosidase (AdnLacZ) en utilisant les méthodes décrites. Les greffons ont été récoltés à 3 jours après la transduction et coupés en segments. Certains segments ont été colorées avec 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). Imagerie en face de la surface luminale a montré des greffes de veine avec transduction efficace (Figure 4A) et la transduction pauvre (Figure 4B). Pour continuer à évaluer l’aptitude d’un nouvel opérateur, ARNm de β-galactosidase dans les extraits de la greffe de veine transduite est également mesurée à l’aide de la PCR quantitative induite par la transcriptase inverse et normaliser le signal au niveau du glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) ARNm mesuré dans les même veine des greffes.
Les niveaux d’ARNm de la β-galactosidase dans les greffons de veine transduites par l’opérateur new n’étaient pas significativement différents par rapport aux niveaux d’ARNm de la β-galactosidase dans les greffons de veine transduites par un opérateur expérimenté (Figure 5). Si les échantillons d’ARNm des veine de greffes transduites par un opérateur expérimenté ne sont pas disponibles aux fins de comparaison, greffe de veine de contrôle négatif Qu'arnm peut être générés par transduction veine greffes avec un vecteur contrôle de non-expression (AdNull). Nous avons constaté que les concentrations moyennes de l’ARNm de la β-galactosidase dans la veine des greffes transduites par un opérateur expérimenté sont environ 1000 plus élevées que le signal PCR de fond pour la β-galactosidase ARNm mesuré dans les AdNull-transduites greffons (Figure 5) .
Figure 1 . Le placement d’un inversé droite externe veine jugulaire à droite commune carotide greffon avec anastomoses bout à l’autre. La greffe de veine (bleu) est suturée à l’artère carotide commune (rouge) à deux anastomoses. À chaque anastomose, points de suture (blanc x) sont numérotés dans l’ordre dans lequel ils sont placés. Pour les deux les anastomoses, piquer 1 sutures l’extrémité caudale de l’artériotomie à la veine jugulaire externe. Piquer les 2 sutures l’extrémité crânienne de l’artériotomie à la veine jugulaire externe. Point 3 est placé sur le côté latéral de l’anastomose en un point équidistant entre les deux premiers points de suture. Point 4 est placé sur le côté médial de l’anastomose, équidistant des deux premières mailles et en face du point 3. Quatre points supplémentaires (points 5 à 8) sont placés à mi-chemin entre les quatre points existants. Le segment de l’artère carotide entre les anastomoses est ligaturé aux deux extrémités par des sutures en soie 3-0 (flèches) et divisée (ligne pointillée) à mi-chemin entre les ligatures. Côté gauche les greffes sont effectuées de manière similaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . La création et la fermeture d’une carotide artériotomie. (A) l’adventice de l’artère carotide commune est saisi près de la greffe de veine avec une pince fine et traction vers le haut est appliquée à la paroi de l’artère. Cela crée une surface verticale, permettant à l’aiguille tordue de 21 G à insérer approximativement parallèle à la lumière du vaisseau, diminuant le risque de perforation de la paroi arrière de l’artère. (B) l’artériotomie est suturé à l’aide de polypropylène 7-0 dans un modèle X. La première passe de la suture entre la lumière de l’artère au bas à droite de l’artériotomie (site 1) et sort de la lumière en bas à gauche (site 2). La suture puis traverse l’artériotomie. La passe suivante entre à nouveau dans la lumière en haut à droite (site 3), puis quitte la lumière en haut à gauche (site 4). Une traction douce sur les extrémités de la suture (les extrémités sortent du site 1 et 4) ferme l’artériotomie. Les extrémités de suture sont à égalité avec 2 noeuds de square. Les cercles bleus pleins indiquent les endroits où la suture pénètre dans la paroi artérielle. Les lignes pleines de bleus indiquent où la suture passe à l’extérieur de la paroi artérielle ; les lignes bleues en pointillés indiquent que la suture est située à l’intérieur de la lumière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Images d’échographie transcutanée du cou du lapin, évaluation des veine greffon perméabilité 5-7 jours après la greffe. (A) brevet veine greffe (rouge) avec la circulation sanguine en direction caudale-à-crânien est indiquée (flèche). (B) occlus veine greffon. Aucun débit de sang caudal-à-crânien (qui semblerait rouge) n’est détecté. La veine jugulaire interne (bleu) avec la circulation sanguine en direction crânienne-à-caudale est indiquée (astérisque). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Expression de transgene bêta-galactosidase dans les greffons de veine. 28 jours après la greffe, greffes de veine de lapin ont été transduites par une incubation de 20 min de vecteurs adénoviraux exprimant la β-galactosidase dans les lumières des greffons de veine chirurgicalement isolée. Veine greffes ont été récoltées à 3 jours après le transduction et colorées au 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) image En face de la surface luminale d’un segment de veine montrant transduction efficace. (B) image En face de la surface luminale d’un segment de veine montrant les pauvre transduction. Echelle = 1,0 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Expression du transgène de bêta-galactosidase (β-gal) ARNm dans les segments de veine greffon. 28 jours après le placement des greffes d’interposition veine jugulaire dans les carotides de lapin, les greffons étaient transduites avec un vecteur adénoviral exprimant la bêta-galactosidase (AdnLacZ) ou avec un vecteur adénoviral de contrôle qui n’exprime pas un transgène (AdNull ). Chirurgies effectuées par un opérateur expérimenté (chirurgien 1) ou un nouvel opérateur (chirurgien 2). Greffes de veine transduites avec AdnLacZ étaient tous récoltés 3 jours après la transduction. ARN extrait des greffes transduites avec AdNull et récolté 14 jours après que la transduction a été également analysée, comme témoin négatif. L’expression de l’ARNm de la bêta-galactosidase a été quantifiée par PCR quantitative induite par la transcriptase inverse, avec des valeurs normalisées de glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase ARNm mesuré dans les mêmes extraits et exprimées en unités arbitraires (UA). Les barres indiquent des valeurs moyennes ; p valeurs proviennent des tests de classement-somme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des étapes cruciales dans le présent protocole comprennent la gestion de l’anesthésie, anticoagulation manipulation chirurgicale de la veine artère/greffés et mesures hémodynamiques de la veine greffée. Une bonne gestion de l’anesthésie est essentielle dans ce modèle de survie chirurgie multiple qui comprend deux opérations relativement longues (généralement de 3 à 3,5 h pour greffe veineuse bilatérale et 1,5 à 2,5 h de transduction greffe bilatérale). Nous avons administré de l’anesthésie par l’intermédiaire d’une ogive et de l’intubation endotrachéale et constaté que l’intubation amélioré la survie après la chirurgie de transduction du greffon, peut-être parce que la ventilation à pression positive empêche l’atélectasie et associés insuffisance respiratoire. Lapins sont difficiles à intuber le malade, et un traumatisme des voies aériennes liées à l’intubation peut causer stridor post-opératoire. Cependant, les défis et les complications de l’intubation sont un petit prix à payer au profit d’éliminer la majeure partie de la morbidité périopératoire et la mortalité associées à la chirurgie de greffe de veine.
L’anticoagulation est essentielle afin de prévenir la thrombose des veines greffées, qui peut se produire après une des chirurgies de la survie. La thrombose semble être un événement postopératoire précoce, parce que les greffons de veine qui sont brevets sur une échographie transcutanée 5-7 jours après l’opération sont presque toujours brevets lors de la récolte. Pour prévenir la thrombose après la première intervention chirurgicale (i.e., greffe de la veine), héparine IV est administré avant la récolte de la première veine de jugulaire externe. Basé sur la demi-vie plasmatique d’héparine chez le lapin (1-2 h), une dose supplémentaire de la moitié de l’héparine IV est administrée avant la récolte de la veine jugulaire d’externe controlatérale. En outre, que les deux anastomoses artério-veineuses d’une greffe de veine individuels soient terminées, nous rincer les lumens de la carotide et la veine greffe environ toutes les 8 min avec sérum physiologique hépariné. Pour éviter la thrombose de prothèse, il faut ne pas d’endommager la prothèse, surtout l’endothélium de veine-au cours de la récolte et la greffe. Cela inclut la douce manipulation de la veine avec des instruments chirurgicaux et laissant une mince couche d’adventitiels attaché à la veine du tissu adipeux. Nous administrons également une dose unique de papavérine topique à l’artère carotide greffé, afin d’éviter ou vasospasme inverse, qui pourrait contribuer à la thrombose.
Une attention méticuleuse à la technique chirurgicale est nécessaire pendant la veine greffe chirurgie. Pour éviter un saignement des anastomoses, thrombose de prothèse et l’introduction de variables hémodynamiques incontrôlées, les deux arteriotomies doivent être de la bonne longueur. Si une artériotomie est trop courte, la paroi ostiale de greffe veineuse sera redondante sur le site de l’anastomose, créant des lacunes qui permettent aux saignements. Si l’artériotomie est trop long, qui s’étend de la veine pour couvrir l’artériotomie apportera la veine greffon murs à proximité, rendant difficile pour le chirurgien éviter de suturer la veine adverse greffon murs ensemble (essentiellement garantissant postopératoire thrombose). En outre, si la lumière de greffe veineuse est réduite parce que la veine a été étendue pour couvrir une artériotomie excessivement longue, une sténose sera créée qui augmente la contrainte de cisaillement, prédispose à33de la thrombose et potentiellement modifie les variables de résultats tels que néointimale croissance et vasculaire retouche34,35. En outre, il est important d’éviter d’introduire des rebondissements dans la greffe de veine, ce qui peut entraîner de rétrécissement de la lumière ou écoulement anormal. Afin d’éviter la torsion de la greffe, nous avons toujours aligner le segment de veine le long de la face ventrale de l’artère carotide commune et il n’y a pas de rebondissements dans la veine. Compte tenu des variable technique chirurgicale changer de la veine greffon hémodynamique, et comme altération hémodynamique peut affecter les variables de résultat indépendamment de traitement, nous mesurons régulièrement diamètre de flux et greffe de sang avant la perfusion de vecteur et au le temps de la moisson. Ces valeurs nous permet de calculer la contrainte de cisaillement et de pulsatilité. Greffes de veine avec mesures hémodynamiques en dehors des plages prédéterminées peuvent objectivement être exclus de l’analyse, diminue la variabilité expérimentale et l’augmentation de puissance statistique.
Nous avons mis au point cette méthode, nous avons apporté plusieurs modifications. Au départ, nous avons tenté de transfert de gènes de greffe veineuse pendant l’opération de greffage. Cependant, dans ces circonstances, l’expression du transgène fut presque complètement perdue par 3 jours après le transfert de gène22. Expression du transgène a été rapidement perdu si le segment de veine a été transduite sur place et ensuite greffés ou si la veine était greffée tout d’abord et ensuite transduite. Seulement en retardant la transduction jusqu’après que la greffe veineuse s’étaient adaptées à la circulation artérielle (nous avons attendu jusqu'à 28 jours après la greffe pour effectuer le transfert de gènes, même si un délai plus court peut être possible), a été la perte rapide de transgene expression évitée22 . Nous est également passée d’anesthésie ogive-livré à l’anesthésie de livraison tube endotrachéal pour la deuxième chirurgie (transfert de gènes) après avoir connu des décès peropératoires et postopératoires. En outre, après avoir rencontré la pneumonie par aspiration apparente chez un lapin postopératoire, nous avons commencé à placer une petite table en plastique sur le ventre du lapin (sous les tentures stériles). La table a été positionnée pour empêcher que le chirurgien appuyé par mégarde sur l’abdomen du lapin, potentiellement stimulant aspiration et reflux gastro-oesophagien. Nous avons n’eu aucun autre événement d’aspiration après le placement de la table. Cependant, parce que ce placement a coïncidé avec le passage à l’intubation endotrachéale, nous ne pouvons pas être sûrs quelle intervention est responsable de l’élimination des événements de l’aspiration.
Cette méthode a aussi des limites. Aux États-Unis, l’utilisation de lapins au lieu de rongeurs nécessite la conformité avec les exigences de la Loi sur la protection des animaux de laboratoire de 1966. En conséquence, les chercheurs utilisant des lapins (ou autres animaux visés par la présente loi) doivent avoir équipées de salles d’opération et les anesthésistes experts et assurent un niveau élevé de soins et de surveillance postopératoire. La deuxième limitation est que les 2 chirurgies sont nécessaires afin d’assurer des persistants transgene expression22. La deuxième chirurgie augmente le coût des expériences et expose chaque lapin pour un jeu supplémentaire de potentiel du dispositif et des complications peropératoires. Toutefois, nous ne sommes pas au courant de toute autre approche de transfert de gène qui permet d’obtenir l’expression TRANSGENIQUE durables dans la veine des greffes. La troisième limite de cette méthode est qu’elle requiert une expertise dans la construction des vecteurs HDAd et préparation des stocks HDAd haut-titre. De nombreux laboratoires ont d’expertise avec la première génération adénovirale, des gènes et adéno-associés des vecteurs viraux (AAV), mais relativement peu de groupes ont l’expérience avec HDAd et devrait généralement établir une collaboration pour obtenir cette expertise. L’application clinique de la méthode peut également être limitée. Pour l’homme, une deuxième chirurgie augmenterait risque de coût et de complication. En outre, les veines jugulaires externes de lapin par rapport aux humains veines saphènes (utilisés pour les chirurgies de pontage coronaire et périphérique), ont des parois très minces. Il est possible que le mur s’épaississant et remodelage qui se produit après que greffe une veine jugulaire externe de lapin dans la circulation artérielle pourrait être atténuée si la greffe veineuse possède déjà une paroi plus épaisse. Enfin, dans les expériences dans ce modèle une durée maximum de 6 mois, aucun des veines greffées a développé une sténose22. Par conséquent, cette méthode ne semble pas modéliser tous les processus biologiques qui contribuent à l’échec de greffe de la veine.
En conclusion, la méthode utilise un robuste modèle animal de maladie vasculaire humaine (lapins) pour générer des veines greffées dans laquelle les transgènes sont exprimées stable pendant de longues périodes de temps (au moins 6 mois)22. Stable expression de transgènes dans les greffons de veine révélera leurs rôles dans la veine normale greffer l’homéostasie et permettra de clarifier leur potentiel pour la thérapie génique greffe veineuse. La méthode pourrait être améliorée et rendue plus cliniquement applicable par le développement de techniques qui permettent la livraison percutanée de vecteurs à la greffe de veine, évitant ainsi la deuxième chirurgie. Ces techniques pourraient être axée sur le cathéter36,37, ou ils pourraient intégrer des vecteurs spécialement préparés qui sont injectés dans une veine périphérique et ensuite ciblés à la paroi veineuse de la prothèse, par exemple par des champs magnétiques38. La méthode permettrait également de tester des vecteurs autre que HDAd pour la thérapie génique greffe veineuse, incluant des gènes et des vecteurs d’AAV ainsi que les vecteurs non viraux. 39 , 40 , 41 , 42
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
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