Summary
이 방법은 토끼에 개재 정 맥 이식의 배치, 이식, 변환 및 내구성 transgene 식의 성과 설명합니다. 이로써 transgenes 이식할된 혈관에 단백질 제품의 생리 및 병 적인 역할 및 정 맥 이식 질병에 대 한 유전자 치료의 테스트의 조사.
Abstract
정 맥 이식 수술은 폐색 동맥 질환;에 대 한 일반적인 치료 그러나, 장기적인 성공은 이식 실패 혈전 증, 내 증식 및 동맥 경화에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목표는 토끼, 양측 정 맥 개재 이식 배치 다음 시험 튼튼한 transgene 식 달성 유전자 전달 벡터와 이식 하는 방법을 보여 줍니다. 메서드를 사용 하면 정상적인 정 맥 이식 항상성에서 유전자와 단백질 제품의 생물 학적 역할의 조사 수 있습니다. 그것은 또한 transgenes 예정 맥 이식 실패를 막을 수 있는 활동에 대 한 테스트 수 있습니다., 여부는 transgene의 표현 neointimal 성장을 방지, 혈관 염증 감소 또는 토끼에 있는 아 테 롬을 감소 먹이 와 고 지방 다이어트. 초기 생존 수술 하는 동안 왼쪽과 오른쪽 외부 경 정 맥의 세그먼트 excised 고 반전된 엔드-투-사이드 일반적인 경 동맥 중재 이식으로 양측 배치. 두 번째 생존 수술, 28 일 후, 수행 하는 동안 각는 이식 혈관 클립 순환에서 격리 이며 루멘 채워진다 (는 arteriotomy)를 통해 도우미 종속 adenoviral (HDAd) 벡터를 포함 하는 솔루션. 20 민 부 화 후 벡터 솔루션 발음 하 고는 arteriotomy 수리 흐름 복원 됩니다. 혈관 각 실험 프로토콜에 의해 결정 하는 시간 포인트에서 수확. 28 일 간격으로 이식 배치 및 변환 동맥 순환에 정 맥 이식의 적응을 위해 필요 하다. 이 적응 정 맥 이식 불리고 전이나 접목 직후에 발생 하는 transgene 식의 급속 한 손실을 방지 합니다. 메서드는 고유한 이식할된 혈관에 내구성, 안정적인 transgene 식을 달성 하는 능력. 다른 큰 동물 정 맥 이식 모델에 비해, 토끼는 저가 및 쉬운 취급의 이점이 있다. 쥐 나 정 맥 이식 모델에 비해, 토끼 크고 조작에 쉽게 혈관이 풍부한 조직 분석을 위해 제공 하는 있다.
Introduction
동맥 경화는 지질 축적과 혈관 벽에 염증 배 루멘, 심장 마비, 뇌졸중, 및 사지1,2의 손실의 축소로 이어질 만성 염증 성 질병 이다. 경 피 적인 내정간섭 (예., 혈관 및 stenting) 및 의료 치료 (예., 스타 틴과 항 에이전트) 아 테 롬;에 대 한 유용한 치료법 그러나, 그들은 하지 종종 관상동맥 및 말 초 순환에 모두 심각한 폐쇄성 질환 치료에 효과적입니다. 우회 접목, 자생 정 맥 세그먼트를 사용 하 여 심각한, 확산 관상 동맥 및 주변 혈관 질병3,4환자 치료에 대 한 일반적인 절차 남아 있다. 그러나, 모두는 관상에 이식 정 맥 그리고 주변 순환 가난한 장기 patency 요금. 관상 동맥 순환에 있는 정 맥 이식 1 년 50%에서 가려진는의 대략 10-20%는 10 년5,6에 의해 가려진. 주변 순환에서 정 맥 이식 실패 속도 5 년7에서 30-50%.
그것은 질병의 위치에 정확 하 게 치료 유전자 제품을 제공할 수 있기 때문에 유전자 치료는 정 맥 이식 실패의 예방에 대 한 매력적인 접근 이다. 따라서, 수많은 임상 연구는 정 맥 이식 유전자 치료8,9을 테스트 하 고 있다. 그러나, 기본적으로 초기 시간 포인트 (2-12 주)10,11,12,13,,1415, 에서 효능을 조사는 이러한 연구의 모든 16 , 17. 우리는 유전자 치료 개입 내구성 제공할 수 있다는 증거가 인식 (년) 일반적으로 neointimal 증식 및 동맥 경화4결과인 늦은 정 맥 이식 실패에 대 한 보호. 우리 이식할된 혈관에 튼튼한 transgene 식이 허용 함으로써 초기 뿐 아니라 늦은 시간 지점에서 유전자 치료 개입의 테스트 방법을 개발. 튼튼한 transgene 식을 위해 메서드 HDAd 벡터 지연된 변환 전략을 통합. HDAd 벡터 바이러스 성 유전자, 면역 시스템18,19,에 의해 불리고 셀의 인식 (및 제거)20, 를 방지 부족 하기 때문에 장기간된 transgene 식을 제공 21. 지연 변환 (이식 배치 후 수행된 28 일) 일찍22이식 후 발생 하는 arterialization 과정 불리고 세포의 손실 방지.
이식 배치10,,1112,15,16 시 정 맥 이식의 변환에 의존 하는 정 맥 이식 벽에 치료 transgene 식을 달성 하는 다른 방법 ,17. 연속적으로 측정 하는 경우 변환22,23후 transgene 식이이 접근을 사용 하 여 신속 하 게 거절 합니다. 따라서, 학문이 접근이 방식을 사용 하는 하지는 정 맥 접목, 가장 안 4 주 넘어 효능 평가 함께 후 12 주 이상의 효능을 시험 했다. 반면에, 우리의 방법은 정 맥 이식 달성 및 기반 비슷한 연구에서 동맥 가능성이 수행에 24 주 이상 안정적으로 지속 되는 transgene 식 계속 훨씬 더22,24. 우리는 다른 정 맥 이식 유전자 치료 개입 안정적인 transgene 표현의이 기간을 달성 하는 알고 있습니다.
우리는 우리의 방법을 개발 하는 토끼 모델을 사용. 정 맥을 테스트 하려면 큰 동물 이식 유전자 치료10,11,12,15,,1617,25, 또는 다른 사람 설치류, 토끼, 사용 26. 설치류 모델에 비해, 토끼는 더 비싼 하 고는 더 엄격한 규제 요건이 적용 됩니다. 그러나, 더 큰 동물에 비해 (예. 돼지, 개), 토끼는 구입 하 고 집까지 저렴 하 고 훨씬 쉽게 처리할. 또한, 토끼 배 순수 인간의 배를 닮은27, 그들은 충분히 큰 경 피 적인 내정간섭28,29, 테스트를 위해 사용할 수 있습니다 그리고 그들은 충분 한 조직을 제공 여러 끝점 (예., 조직학, 단백질, RNA) 단일 혈관 표본22,30을 사용 하 여 시험 될 수 있다. 또한, 먹 일 때 정 맥 이식 된 토끼는 높은 지방 다이어트와 함께, 그들은 개발 정 맥 이식 동맥 경화31,32, 관상 동맥 바이패스 정 맥 이식 실패4,5의 일반적인 원인입니다. . 이러한 동맥 경 화성 토끼 정 맥 이식이이 방법으로 전달 하는 유전자 치료 개입을 테스트 하기 위한 기판으로 사용할 수 있습니다. 제공 된 프로토콜 토끼 정 맥 이식에 튼튼한 transgene 식을 달성 하는 데 필요한 기술을 마스터 하는 수사를 도울 수 있다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜 및 연구는 동물 복지의 워싱턴 사무실의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 사전 작업 (모든 수술)에 대 한
- Paraspinous 근육에 근육 주사 (IM)으로 30 mg/kg 케 타 민 및 1.5 mg/kg xylazine와 토끼를 anesthetize.
참고: 수술 전에 음식과 물을 제한 되지 않습니다 됩니다. - 기다리는 동안 마 취의 충분 한 깊이, 준비 실 및 수술 실 (OR)에 테이블을 설정 합니다.
- 준비 실 면도 토끼의 목과 귀 (생존 수술만)에 정 맥 (IV) 포트의 위치에 대 한 준비. 준비 테이블에 눈 연 고, 펜타닐 패치 (생존 수술), 발기, 알코올 준비 패드, 24 G x ¾"카 테 터, 주사 포트, 외과 테이프를 놓습니다.
- 또는에서 모니터링 장비를 설정 하 고 관련 프로브 (심전도 (EKG), 펄스 프로브가 (SpO2), 및 온도). 18-19-G 또는 바늘 100 mL 염 IV 부대로 IV 펌프를 준비 하 고 10 mL/h로 유량을 설정/kg (생존 수술에만). (정 맥 접목 또는 수확 수술) nosecone와 산소와 isoflurane 장비를 설정 합니다.
- 토끼에 nosecone를 보호 하는 nosecone에 가스를 공급 하는 튜브 주위 거 즈 스트립 루프. 이 루프 어디는 nosecone에 연결 하는 튜브를 주위 해야 합니다. 무료 거 즈 스트립 끝 둘 다 대략 45 cm 긴 될 해야 합니다. (연결 된 거 즈)와 nosecone 테이블의 맨 끝에 놓습니다.
- 순환 물 설정 및 강제 공기 또는 테이블에 담요를 온난 화. 데우는 담요에 목 지원으로 압 연된 타월을 놓고 electrocautery 분산 전극 플레이트를 배치 합니다.
- 로컬 진통제로 2% lidocaine HCl의 1 mL 주사기에 결합 하 고 0.5% bupivacaine HCl.의 1 mL 희석 원하는 농도에 바이러스 (여기, HDAd에 대 한 2 x 1011 바이러스 성 입자/mL 사용) 살 균 DMEM과 얼음 (유전자 전송 수술만) 계속.
- 적절 한 마 취 깊이 도달 하면 수술에 대 한 토끼를 준비 합니다.
참고: 적절 한 마 취 심도 보장 하기 위해 페달 철수 반사의 부족에 대 한 테스트. 수술 내내 페달 반사 모니터링을 계속.- 토끼의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 직장 온도 프로브를 위치 수 있도록, 항문 바로 위에 gloved 손가락으로 누르고 토끼의 항문에서 stooling를 제거 하는 항문 쪽으로 손가락을 이동.
- Mandible의 가장자리에 sternal 노치에서 토끼를 면도. 4 배치에 대 한 귀 및 펜타닐 패치 관리 (생존 수술만)에 대 한 반대 귀 면도. SpO2 프로브 위치 왼쪽된 후면 중간 발가락을 면도.
- 벡터 주입 수술에 대 한 토끼를 넣어야 합니다. 4 mm O.D./3 mm 아이디 uncuffed endotracheal 튜브는 arthroscope 이상의 스레드를 사용 합니다. Sternal recumbency에 토끼를 놓고 하이퍼 확장 목. 토끼의 입 벌리고 누른는 arthroscope glottis 및 laryngeal 주름 시각화를 사용 하 여. 영감, 동안 부드럽게 endotracheal 튜브 통해 후 두와 기관지로 삽입 합니다.
- 생존 수술에 대 한 배치 하 고 토끼의 왼쪽된 귀 정 맥에 24 G IV 카 테 터를 확보 주입 포트와 모자. 토끼의 오른쪽 귀를 25 µ g/h 펜타닐 패치를 적용 합니다.
참고: 프로토콜은 토끼의 오른쪽에 배치 하는 외과입니다. 외과 의사는 토끼의 왼쪽에 있을 것입니다, 와이어와 외과 의사의 반대 IV를 유지 하려면이 단계에서 양측을 없애면 됩니다. 필요에 따라 미래 단계에 측을 전환 합니다. - 정 맥 접목 및 수확 수술 nosecone;와 일반적인 마 취 관리 벡터 주입 수술 endotracheal 튜브를 통해 전신 마 취 관리.
참고: 모든 수술에는 삽 관 법을 사용할 수 있습니다. 그러나 우리의 경험에서는,, 삽 관 법 중 tracheal 및 후 두 외상에서 합병증의 위험 수 보다 중요 한 삽 관 법의 혜택. 포함 하는 유전자 이동 (특히 콜레스테롤 먹인 토끼)에 이식 하는 수술은 유일한 수술은 삽 관 법에 인터넷 혜택을 제공 하는 것으로 보인다. - OR에 토끼를 나 른 다. 토끼의 머리 바로 아래 위치 목 지원 수건으로 토끼 운영 테이블에 부정사 위치에 놓습니다. 부드럽게 때까지 직선 및 약 가로 토끼의 목을 확장 합니다.
- 토끼 (정 맥 접목 및 수확 수술)에 nosecone 또는 O2 1 L/min, endotracheal 관 (벡터 주입 수술)을 연결 놓고 isoflurane 시작 합니다. 경우는 nosecone를 사용 하 여, 토끼의 목 지원 수건 주위 연결 된 거 즈 스트립의 끝을 포장 하 여 보안. 마 취의 수술 수준을 유지 하기 위해 (일반적으로 1-2%)을 필요에 따라 isoflurane 농도 조정 합니다.
- 토끼의 뒷면 아래 electrocautery 분산 전극 플레이트 센터. 직장 온도 프로브를 삽입 하 고 토끼에 SpO2 프로브 및 심전도 리드를 적용.
- 토끼의 왼쪽된 귀에 카 테 터 포트에 염 분 4 라인을 연결 하 고 시작 IV 주입 펌프에서 10 mL/h/kg. 1 시간 후 5 mL/h에 식 염 수 주입 율을 감소/kg.
- 구속으로 운영 테이블에 토끼의 앞 다리를 느슨하게 넥타이.
참고: 필요에 따라, 작은 플라스틱 테이블 놓일 수 있다 토끼의 가슴/복 부를 잠재적으로 일으키는 위 식도 역류와 열망에서 외과 의사를 방지 하기 위해 토끼를 통해. - Lidocaine/bupivacaine (2 mL, 50: 50 혼합, 단계 1.2.4)을 피하 주사 (SQ) 국 소 마 취에 대 한 계획 된 절 개 라인 따라 목에.
- 비서는 수술 소독 액체 글 루 콘 산 및 소 프로 파 놀, 스크럽을 번갈아 3 사이트 다음 povidone-요오드와 함께 사이트를 스프레이. 외과 의사 스크럽, 가운, 장갑, 무 균 원칙에 따라 있다.
- 무 균 조건 하에서 생존 수술을 수행 합니다. 보조 비 살 균 항목, 처리 및 aseptically 외과 의사를 살 균 물질을 통과 또는 aseptically draped 악기 테이블에 그들을 배치 했습니다.
- 외과 의사 사용 메 마른 수건 aseptically 현미경 등 비 멸 균 장비를 조작 하는. 외과 의사는 수술의 첫 번째 절반을 수행 하는 동안 수술 loupes x 2를 착용 있다.
2. 정 맥 이식 수술 (생존)
- 악기와 무 균 필드를 준비 합니다.
- 멸 균 팩 (테이블 드 레이프, 종이 주름 잡아 드리운 다, 및 6 수건)를 열고 aseptically 외과 의사를 내용을 전송 도우미를 있다.
- 악기 테이블 드러 워 진. 종이 드 레이프와 draped 악기 테이블에 메 마른 수건을 놓습니다. 4 타 올 노출 목에만 외과 사이트를 떠나는 토끼, 드러 워 진. 토끼 종이 드 레이프 바닥. 한 수건은 나중에 사용 될, 그리고 마지막 하나는 백업.
- 길잡이 소독된 악기 팩을 열고 aseptically는 외과 악기 트레이 통과 했습니다. 악기 악기 테이블에 정렬 합니다.
- 다음 장비를 열고 aseptically 외과 의사 전달 및 악기 테이블에 배치할 비서: 1 1 mL 주사기, 한 3 mL 주사기, 한 20 mL 주사기, 한 21 G 바늘, 3-0 polyglycolic 산 (PGA) 봉합 사, 5-0 PGA 봉합 7-0 폴 리 프로필 렌 봉합, 그리고 한 24 G IV 카 테 테 르.
- 7.25"Kantrowitz 집게를 사용 하 여 토끼를 덮고 드 레이프 electrocautery 케이블을 보호 합니다. 케이블의 플러그 끝을 electrosurgery 단위에 연결 하는 길잡이 설정 운영 테이블의 가장자리에 놓습니다.
- 살 균 염 분 염 분 가방 또는 유리병의 비서에 의해 개최로 20 mL 주사기를 채우십시오. 작업 중 노출 된 조직의 탈수를 방지 하기 위해이 분을 필요에 따라 사용 합니다.
- 염 분 해결책, 즉5 mL 0.1 mL 5000 IU/mL 헤 파 린을 추가 하 여 5 mL heparinized 생리 식 염 수 솔루션의 준비., 100 IU 덤플링을/mL, 작은 외과 그릇에. 이 솔루션을 사용 하 여 경 동맥 및 정 맥 이식 이식 절차 동안 정기적으로 플러시.
- 토끼의 목에 외과 사이트를 통해 종이 드 레이프에 구멍을 절단. 수건을 사용 하 여 기본 수건을 구멍의 모서리를 클램프 클램프.
- 혈관의 해 부
참고: 2 x 수술 loupes를 사용 하 여이 부분 수술의 원조.- Sternal 노치와 mandible (길이 약 7-9 cm) 사이 중간 따라 electrocautery와 피부를 잘라내어 토끼의 목 피부는 수건을 수건 클램프와 클램프. 꼬리 끝에 짧은 측면 컷 electrocautery와 근 막 통해 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 전체 중간 큰가 위를 사용 하 여 따라 근 막 아래 해 부. Electrocautery와 중간 선 따라 해 부 fascial 레이어를 통해 잘라.
- 오른쪽에서 시작 합니다. 기도 overlying sternohyoid 근육 사이의 V 자형 sternocephalic 근육, 일반적인 경 동맥을 노출 해 부.
- 신중 하 게 일반적인 경 동맥 및 그것의 큰 가지 (측 당 일반적으로 1-2) 조직 주변에서 무료의 4-5 cm 세그먼트를 해 부. 인 두 신경의 교차점에 proximally 목의 기지에서 해 부 distally 확장. 해 부 중 경 동맥의 수축에 도움을 사용 하 여 수술 실리콘 루프. 각 분기 distally 절단 하기 전에 5-0 비단 봉합 일반적인 경 동맥의 큰 가지를 선.
참고: 수 평행 일반적인 경 동맥, 또는 동맥 교차 하는 작은 신경 미주 신경 방해 하지 않도록 주의 하십시오. - 왼쪽 (2.2.3 단계)에 절 개를 반복 합니다.
- 조직 잡고 집게를 사용 하 여 일시적으로 피하 조직 층을 닫습니다. 외부 경 정 맥 노출 될 때까지 오른쪽에 피부에서 표면 근 막 해 부. 4-5 cm 세그먼트 외부 경 정 맥 혈관의 해 부 및 주변 조직, 5-0 비단 봉합 작은 가지 분기를 절단 하기 전에 ligating에서 그것의 분기 있습니다.
- 왼쪽 (단계 2.2.5)에 절 개를 반복 합니다.
- 4 카 테 터에 헤 파 린 (150 IU/kg)을 주사 하십시오 하 고 10 mL의 염 분으로 플러시.
- 오른쪽 측면에 외부 경 정 맥의 3 cm 세그먼트를 측정 하 고 5-0 비단 봉합으로 세그먼트의 꼬리 끝을 선. 정 맥 피를 채울 수 있도록 다음 정 맥 세그먼트의 두개골 끝 선. 외부 경 정 맥 세그먼트의 두개골 끝 분할 신중 하 게 플러시 heparinized 정상적인 염 분 (100 U/mL) 24 G IV-카 테 터에 부착 된 3 mL 주사기를 사용 하는 용기. 그것의 꼬리 끝에 정 맥 세그먼트를 나눕니다. 정 맥 세그먼트는 꼬리와 두개골 끝은 명확 하 게 식별 표준된 위치에 놓습니다.
- 정 맥 접목
- 보조 외과 의사 로부터 수술 loupes를 제거 하 고 수술 현미경 (25 X) 위치로 이동 하자.
참고: 외과 의사 야 드러 워 진 메 마른 수건 현미경을 통해. 이로써 불 임을 유지 하면서 현미경을 조작 하는 외과 의사. - 미니-클램프, 먼저 동맥, 다음 꼬리 클램프를 배치에 대 한 있도록 두개골 클램프 배치와 격리 된 세그먼트의 각 끝에 바로 일반적인 경 동맥 클램프.
- 뻣 뻣 한 종이 (무 균 봉합 포장에서 사용 가능) 1 × 2 cm 조각 잘라내어 노출을 향상 시키기 위해 일반적인 경 동맥, 아래 배치.
- 한 arteriotomy 단지 두개골 꼬리 클램프 (꼬리 arteriotomy)을 수행 합니다. Arteriotomy 길이 정 맥 세그먼트의 두개골 끝의 직경이 크거나 같아야 합니다. 꼬리 arteriotomy 통해 IV 카 테 터와 주사기를 삽입 하 고 일반적인 heparinized 염 분으로 경 동맥 루멘을 플러시.
- 7-0 폴 리 프로필 렌 봉합 사를 사용 하 여 단일 바늘 (그림 1)로 꼬리 arteriotomy 하 정 맥의 두개골 끝 봉합
- 두개골 정 맥 세그먼트 끝에 꼬리 arteriotomy의 꼬리 끝을 봉합 하는 첫 번째 스티치를 놓습니다. 두 번째 스티치 봉합 두개골 정 맥 세그먼트 끝에 꼬리 arteriotomy의 두개골 끝에 첫번째 스티치에서 180 °를 놓습니다.
- 장소는 문 합의 측면 쪽에 처음 두 바늘에서 등거리 지점에서 세 번째 스티치. 문 합, 처음 두 바늘에서 및 세 번째 스티치에서 등거리의 중간 측에 4 스티치를 놓습니다. 바늘 1-4의 각각 사이 4 추가 바늘 (바늘 5-8)를 배치 합니다.
- 두개골 클립의 꼬리 쪽에 두개골 arteriotomy를 수행 합니다. 두개골 arteriotomy의 두개골 끝과 꼬리 arteriotomy의 꼬리 끝 사이의 거리 정 맥 세그먼트의 길이와 동일 해야 합니다. 두개골 arteriotomy의 길이 정 맥 세그먼트의 꼬리 끝의 직경이 크거나입니다.
- Cranially 어떤 왜곡 없이 경, 위에 누워 문 합에서 정 맥을 확장 합니다. 경 동맥을 플러시 하 고 두개골 arteriotomy 통해 heparinized 일반적인 염 분으로 정 맥. 염 분 꼬리 문 합을 통해 혈관에는 동맥을 통해 흐름 것 이다 하 고 정 맥의 자유롭고 unsutured 끝에서 종료 됩니다. 플러싱에 정 맥은 또한 왜곡에서 그것을 방지할 수 있습니다.
- 두개골 arteriotomy (그림 1)에 정 맥의 꼬리 끝 봉합
- 정 맥 세그먼트의 꼬리 끝에 두개골 arteriotomy의 꼬리 끝을 봉합를 첫 스티치를 놓습니다. 정 맥 세그먼트의 꼬리 끝에 두개골 arteriotomy의 두개골 끝을 봉합 하는 두 번째 스티치를 놓습니다. 2.3.5.2 단계에서 설명한 대로 문 합을 완료 합니다. 그냥 마지막 매듭 두개골 문 합에 연결 하기 전에 짧게 다시 출혈 경 동맥 및 정 맥 이식할된에 공기를 밖으로 씻어 수 있도록 해 부 일반적인 경 동맥 세그먼트의 두개골 끝에 클램프를 엽니다. 그런 다음, 마지막 매듭을 조입니다.
- 혈액으로 정 맥 이식 작성을 허용 하 고 다음 꼬리 클램프를 놓습니다 두개골 클램프를 해제 합니다. 활발 한 맥 동 정 맥 이식에 보여야 한다. anastomoses에서 어떤 출혈을 멈추게 하는 마른 거 즈로 부드러운 압력을 적용 합니다.
- 3-0 비단 봉합으로는 anastomoses를 연결 하는 일반적인 경 동맥 세그먼트의 두 끝 다 선 하 고 경 연자 (그림 1) 사이 분할. 각 문 합에 인접 한 경 동맥을 papaverine (3.5 mg/mL)의 몇 방울을 적용 합니다.
- 귀 4 카 테 터로 헤 파 린 (75 IU/kg)을 주사 하십시오 하 고 10 mL의 염 분으로 플러시. 이 시점에서 펜타닐 패치 펜타닐의 진통 플라스마 수준을 제공 될 때까지 수술 후 무 통을 제공 하기 위해 buprenorphine (SQ, 0.02 mg/kg) 주사.
참고: 추가 buprenorphine 주사 (SQ, 0.02 m g/k g) 플라즈마 펜타닐 치료 농도 도달할 때까지 무 통을 유지 하기 위해 첫 번째 주사 후 필요한 6 h를 있을 수 있습니다. - 접목 (단계 2.2.8, 2.3.2-2.3.9) 왼쪽에 반복 합니다.
- 피하 조직 5-0 PGA 봉합 연속 패턴을 사용 하 여 닫습니다. 3-0 PGA 봉합은 피부 패턴을 사용 하 여 피부를 닫습니다. 양쪽 끝에 매듭을 묻어.
- 보조 외과 의사 로부터 수술 loupes를 제거 하 고 수술 현미경 (25 X) 위치로 이동 하자.
- 수술 복구, 정리, 및 관리
참고: 침착, 조용한 환경에서 마 취에서 회복 하기 위해 토끼를 허용 합니다. 그것은 완전히 복구 될 때까지 지속적으로 적절 한 산소와 신체 온도 대 한 토끼를 모니터링 합니다.- Isoflurane 및 산소를 토끼에서 마 취 기계를 분리 합니다. 토끼에서 IV 액체 튜브를 분리 하지만 긴급 액세스에 대 한 귀 정 맥에 4 포트를 두고.
- 복구 새 장에 토끼를 전송 하 고 그것의 측면에 배치. 따뜻한 물 담요 (또는 강제 공기 온난화) 열 지원을 제공 합니다. SpO2 안정 될 때까지 nosecone에 의해 O2 를 제공 합니다.
- 토끼 앉을 수 있고 그것의 감 금에서 ambulate 때까지 그것의 다른 쪽 매 15 분을 토끼를 플립. 다음 귀 IV 정 맥을 제거 하 고 그것의 감 금에 토끼를 반환 합니다. 그것은 완전히 마 취에서 회복 한 후에 다른 동물의 회사에는 토끼를 반환 합니다.
- 생물 학적 및 sharps 폐기물 처리에 대 한 어떤 폐기물 다음 적절 한 프로토콜의 처분.
- Postoperatively, 토끼의 건강 및 수술 상처 매일 확인 합니다. 관리 buprenorphine 펜타닐 패치 관리 하지 통증에 대 한 필요 합니다. 3 수술 당일 펜타닐 패치를 제거 합니다.
3. 경 피 성 초음파
- 이식 patency 평가 수행 초음파 시험 비 취 토끼에 5-7 일 정 맥 이식 수술과 유전자 이동 수술 후.
- 담요에 비 취 토끼를 안전 하 게 포장 하 고 확장 하는 그것의 목 토끼를 수의 V-구 유에 부정사 장소. 목, 면도 하거나, 필요한 경우 depilatory 에이전트와 함께 머리를 제거 합니다. 목에 초음파 젤을 적용 하 고 초음파 시험을 수행.
참고: 초음파 시험 또한에 실행 된다 마 취 토끼 유전자 전송 수술과 이식 patency을 확인 하 고 이식 루멘 직경 측정 하 터미널 이식 수확 수술의 시간에서. 시험 바로 전에 목 닦 고 이루어집니다 그리고 비 취 토끼에 대해서 비슷한 방식으로 수행 됩니다.
- 담요에 비 취 토끼를 안전 하 게 포장 하 고 확장 하는 그것의 목 토끼를 수의 V-구 유에 부정사 장소. 목, 면도 하거나, 필요한 경우 depilatory 에이전트와 함께 머리를 제거 합니다. 목에 초음파 젤을 적용 하 고 초음파 시험을 수행.
4. 유전자 이동 수술 수행 ~ 이식 배치 (생존 수술) 후 28 일
- 악기 및 불 임 분야를 준비 합니다.
- 2.1.1-2.1.3을 단계를 따릅니다. 정 맥 이식 수술.
- 열고 다음 장비 중 aseptically 조 하 게 의사 전달 또는 악기 테이블에 배치 하는: 6 1 mL 주사기 (바늘)로, 한 3 mL 주사기, 한 20 mL 주사기, 한 21 G 바늘, 한 19-G 바늘, 3-0 PGA 봉합 5-0 PGA 봉합, 7-0 폴 리 프로필 렌 봉합 사, 2 개의 24 G 4 카 테 터 및 살 균 혈액 흐름 조사.
- 2.1.5-2.1.6을 단계를 따릅니다. 정 맥 이식 수술.
- 동맥 및 정 맥 이식 세척을 위한 1 mL DMEM와 함께 한 1 mL 주사기를 준비 하 고 바이러스 솔루션 2 1-mL-주사기를 준비 (~ 0.5-0.7 mL 바이러스 솔루션/정 맥 이식). 조 수 바이러스를 해 동 하 고 DMEM에 희석을 하자. Lidocaine/bupivacaine (50: 50 혼합, 단계 1.2.4)의 0.5 mL와 함께 한 3 mL 주사기를 준비 합니다.
- 2.1.8 정 맥 이식 수술에서 단계를 따릅니다.
- 정 맥 이식 술과 인접 한 경 동맥의 격리
참고: 외과 loupes x 2이이 부분에 대 한 사용 해야 합니다.- Sternal 노치와 mandible (길이 약 7-9 cm) 사이 중간 따라 electrocautery와 피부를 잘라내어 타월 클램프와 피부 열기를 클램프. 0.5 mL (50: 50 혼합, 단계 1.2.4) lidocaine/bupivacaine의 피하 조직에 적용 됩니다.
- 꼬리 끝에 짧은 측면 컷 electrocautery와 근 막 통해 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 전체 중간에 따라 근 막 아래 해 부. Electrocautery, 중간 선 따라 해 부 근 막 통해 잘라.
- 오른쪽에서 시작 합니다. 기도 overlaying sternohyoid 근육 사이의 V 자형 sternocephalic 근육의 정 맥 이식 폭로 해 부. 신중 하 게 정 맥 이식 및 두개골과 꼬리 양쪽에 이식에 인접 한 경 동맥의 1.5-2.0 c m를 격리 합니다.
- 4.2.3 단계 다음 왼쪽에 절 개를 반복 합니다.
- 정 맥 이식에 혈액의 흐름을 측정 합니다.
- 파도 소리의 전송을 사용할 수 있도록 일반적인 염 분에는 오른쪽에 수술 상처 구멍을 채우십시오. 상처 구멍에서 염 분 2 mm 혈관 주위 흐름 조사 (볼륨 흐름 미터에 연결)를 담가 그리고 흐름 속도 0으로 설정.
- 꼬리 또는 정 맥 이식에 두개골 흐름 조사 경 동맥 주위를 놓습니다. 전자 데이터 수집 시스템 흐름 조사에서 데이터를 기록 합니다.
- 흐름 측정 단계 4.3.2 다음 왼쪽에 반복 합니다.
- Pulsatility 피크 수축 유량, 최소 확장기 흐름 속도, 그리고 평균 유량에 따라 계산 합니다. 또한 유량에 따라 층 류 전단 응력 및 루멘 직경 (transcutaneous 초음파로 측정)를 계산 합니다.
- 정 맥 이식에 벡터 솔루션을 고취
참고: puncturing, 주입, 및 경 동맥의 복구에 대 한 필요에 따라 수술 현미경 (16 X)가 사용 됩니다.- 보조 외과 의사의 수술 loupes 제거 하 고 수술 현미경을 이동 하는 위치에 있다. 현미경을 통해 메 마른 수건을 드러 워 진 의사가 있다. 메 마른 수건 불 임을 유지 하면서 현미경을 조작 하는 의사 수 있습니다.
- 4 카 테 터에 있는 헤 파 린 (150 IU/kg) 주사 보조 하 고 염 분으로 플러시.
- 큰 바늘 드라이버를 사용 하 여 바로 위에 경사 약 80 ° 21 G 바늘을 구 부 (구부리지 마십시오 경사; 그림 2A)입니다.
- 미니-클램프, 먼저 동맥, 다음 꼬리 클립 배치에 대 한 있도록 두개골 클램프 배치와 정 맥 이식의 각 끝에 일반 경 동맥 클램프. 장소 꼬리 클립 약 10 m m 문 합, 꼬리는 arteriotomy에 대 한 어떤 공간을 두십시오.
- 2 실크 넥타이 동맥 주위 그냥 꼬리는 이식에 넣고 각-그들을 강화 하지 않고 단일 overhand 매듭.
- 꼬리는 이식 경 꼬리 혈관 클립의 단지 두개골 구부러진된 21g 바늘으로 찔린 합니다. 하지 또는 측 벽을 펑크에 주의 해야 합니다. 뒤로-및-앞뒤 두 번 되도록 루멘, 루멘으로 바늘을 미리 다음 신중 하 게 바늘을 철회 합니다.
참고 사항: 일반적인 경 펑크는 동맥 adventitia 미세 집게로 파악 하 고 부드럽게 리프트 지점 (그림 2A) 그냥 꼬리 바늘의 끝을 삽입 하는 동안 정면 벽을 해제 하 여 주 었 될 수 있습니다. 이 바늘 뒤쪽 벽을 명 중 하기의 위험을 줄일 수 있습니다. - 여러 펼친된 거 즈 패드와 함께 혼합 사용 하는 주사기를 둥지를 만듭니다. 이 거 즈 둥지 꼬리 수술 사이트에 배치 합니다.
- DMEM 전용으로 주사기에 24 G IV-카 테 터를 넣고 주사기에 카 테 터를 강화 (주사기 제거 됩니다 나중에이 수술) 누설을 방지 하기 위해 충분 한 테 구 부 ~ 끝에서 4 mm는 출시 후 약 75 °에서 보유 하 고 있는 벤드.
- 벤드 포인트까지 일반적인 경 arteriotomy IV 카 테 터를 삽입 하 고 정 맥 이식 루멘 DMEM의 0.5 mL로 두 번 세척. 각 반복에 대 한 정 맥 이식 DMEM 채워 놓습니다. 다음에 이식의 두개골 끝 gloved 손가락으로 가볍게 눌러는 이식에서는 DMEM 제거 합니다. 조심 스럽게 luminal 내용을 플러시하는 arteriotomy를 통해 이식의 꼬리 끝으로 손가락을 슬라이드.
- 카 테 터, 혈관에 카 테 터를 떠나에서 DMEM 주사기를 제거 합니다. 공기는 카 테 터를 입력 확인 하 고 바이러스 솔루션을 포함 하는 주사기를 연결 합니다. 때까지 그들은 카 테 터 팁 주위 하지만 그들을 조여 하지 동맥 아래로 느슨하게 매듭이 실크 관계 이동 합니다.
- 0.03 mL 테에서 나머지 DMEM 밀어 바이러스 솔루션의 달 이다. 부드럽게 두개골에서 꼬리를 누르면 손가락 정 맥 이식 루멘에서 모든 액체를 제거 합니다.
- 인감 루멘 동맥 카 테 터 팁 주위 두 관계를 조입니다. 정 맥 팽창 될 때까지 바이러스 솔루션을 달 이다. 부드럽게 누워 주사기 거 즈의 둥지에.
참고: 중요 한 정 맥 이식의 사전 변환 구경에 확장 하 고 바이러스 주입 동안 높게 남아 있다 이다. 그렇지 않은 경우에 유전자 이동의 양은 크게 감소 될 것입니다. - 20 분에 대 한 정 맥 이식 루멘에서 바이러스를 포함 하는 솔루션을 두고 빈 주사기 카 테 터에 부착 된 포함 하는 바이러스 주사기를 바꿉니다. 선박 쓰러질 때까지 부드럽게는 이식에서 바이러스를 포함 하는 솔루션을 발음. 장소에서 카 테 터를 떠나 주사기를 제거 합니다. 잘라 풀어 실크 봉합 하 고 선박에서 카 테 터를 철회. 내 피 손상을 방지 하려면 신중 하 게 경 동맥에서 카 테 터를 제거 합니다.
- 수술 현미경의 도움으로는 arteriotomy 7-0 폴 리 프로필 렌 봉합 X-패턴 (그림 2B)를 사용 하 여 닫습니다.
- 봉합 바늘 홀더를 잡고, arteriotomy, 오른쪽 하단에 선박을 입력 하 고 왼쪽 하단에 선박을 종료. 교차 하 여 혈관 밖에 서 고 위쪽-오른쪽에서 두 번째 패스를 왼쪽.
- 봉합을 강화 하기 전에 짧게 동맥 및 정 맥 이식에서 공기 및 잔여 바이러스를 두개골 혈관 클립을 해제 합니다. 피는 클램프 출시는 arteriotomy에서 흐름 것입니다.
- 닫기 살짝 당겨 봉합 arteriotomy 그리고 2 스퀘어 매듭 함께 그들을 묶어.
참고:는 bunching 조직의 흐름을 방해, 혈전 증 위험을 증가 하 고 잠재적으로 통제 변수를 소개 하면 봉합을 너무 꽉 당겨.
- 두개골 혈관 클립 다음 꼬리 클립을 놓습니다. 거 즈를 사용 하 여 가벼운 압력을 적용 하 여 어떤 출혈을 중지 합니다.
- 이 무렵, 펜타닐 패치 진통제 펜타닐 플라스마 수준을 제공 될 때까지 수술 후 무 통을 제공 하기 위해 buprenorphine (SQ, 0.02 mg/kg) 주사.
참고: 추가 buprenorphine 주사 (SQ, 0.02 m g/k g) 플라즈마 펜타닐 치료 농도 도달할 때까지 무 통을 유지 하기 위해 첫 번째 주사 후 필요한 6 h를 있을 수 있습니다. - 바이러스 주입 프로토콜, 다음 단계 4.4.5-4.4.15 왼쪽에 반복 합니다.
- 상처 폐쇄
- 연속 패턴을 사용 하 여 5-0 PGA 봉합과 피하 조직을 닫습니다. 3-0 PGA 봉합은 피부 패턴을 사용 하 여 피부를 닫습니다. 양쪽 끝에 매듭을 묻어.
- 수술 복구, 정리, 및 관리
- 2.4 단계를 따릅니다.
5. 수확 수술 (터미널)
- 악기 및 외과 사이트를 준비 합니다.
- 정 맥 이식 수술에서 단계 2.1.1-2.1.3을 따릅니다.
- 조 수 열 aseptically 악기 테이블에 장소 (또는 외과 의사를 전달) 하 게: 한 20 mL 주사기, 한 21 G 바늘, 3-0 비단 봉합, 그리고 메 마른 혈액 흐름 조사.
- 단계 2.1.5-2.1.6와 2.1.8 정 맥 이식 수술.
- 일반 경 동맥 및 정 맥 이식의 격리
- Sternal 노치와 mandible (길이 약 7-9 cm) 사이 중간 따라 electrocautery와 피부를 잘라내어 토끼의 목 피부를 수건 타월 클램프와 클램프.
- 꼬리 끝에 짧은 측면 컷 electrocautery와 근 막 통해 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 전체 중간에 따라 근 막 아래 해 부. 잘라 electrocautery와 중간 선 따라 해 부 근 막 통해.
- 오른쪽에서 시작 합니다. 기도 overlying sternohyoid 근육과 일반 경 동맥 및 정 맥 이식 노출 V 자형 sternocephalic 근육 사이 해 부.
- 바로 정 맥 이식 및 주변 조직에서 일반적인 경 동맥 해 부. 수술 실리콘 루프를 사용 하 여 동안 해 부는 동맥과 정 맥 이식의 철회에 대 한.
- 다음 단계 5.2.3-5.2.4 왼쪽에 절 개를 반복 합니다.
- 흐름 측정 단계 4.3.1-4.3.3 유전자 이전 수술에서 다음을 확인 합니다.
- 정 맥 이식의 수확
- 3-0 비단 봉합으로는 이식에 두개골 바로 일반적인 경 동맥 선. 다음에 이식에 꼬리 경 선.
- 바로 정 맥 이식은 ligations의 각 및 인접 한 문 합 사이 인접 한 경 동맥을 분할 하 여 삭제할. 토끼에서 정 맥 이식 제거 하 고 식 염 수와 루멘을 플러시.
- 경 동맥 및 정 맥 이식의 양쪽에서 anastomoses를 잘라. 멀리 초과 adventitial 조직 정 맥 이식에서 트림 하 고 다른 끝점 분석에 대 한 필요에 따라 세그먼트에 이식을 잘라.
- 5.4.1-5.4.3 단계를 반복 하 여 왼쪽된 정 맥 이식 수확.
- Phenytoin/pentobarbital 토끼를 안락사를 IV의 1 mL를 주사.
- 생물 학적 및 sharps 폐기물 처리에 대 한 어떤 폐기물 다음 적절 한 프로토콜의 처분.
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Representative Results
New 연산자의 기술 능력 연산자 실험 데이터를 생성 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다 확인 해야 합니다. New 연산자를 달성 해야 합니다 첫 번째 이정표는 일관 정 맥 이식 patency 초기 정 맥 이식 수술과 이후 지연 변환 수술 후. 이상 90 %patency 각 수술의 바람직한 이며 달성 후. patency 비 접촉 우리가 일반적으로 수술 후 하루 5-7에서 수행 하는 경 피 성 초음파를 사용 하 여 평가 될 수 있다. 특허 혈관과 토끼, 초음파 시험 활발 한 꼬리-두개골 혈액 흐름 (그림 3A) 앞쪽 목의 양쪽에 큰 혈관을 발표할 예정 이다. 정 맥 이식 중 차단 되 면 폐색된 이식으로 붙이는에 아무 감지 꼬리-두개골 혈이 됩니다 합니다. 그러나, 두개골-꼬리 혈 여전히 내부 경 정 맥 (그림 3B)에서 검색 됩니다.
New 연산자를 달성 해야 합니다 두 번째 이정표 이식 정 맥 내 피 세포의 효율적인 변환입니다. 여기, 표현 하는 β-galactosidase adenoviral vector는 내 피 유전자 이동의 효율성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 우리 실험실에서 새로운 연산자 β-galactosidase (AdnLacZ) 설명 하는 방법을 사용 하 여 표현 하는 아 데 노 바이러스와 정 맥 이식 불리고. 이식 변환 후 수확된 3 일 이었고 세그먼트를 잘라. 일부 세그먼트 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal)와 얼룩이 있었다. En 얼굴 화상 luminal 표면의 효율적인 변환(그림 4)와 가난한 변환 (그림 4B) 정 맥 이식 했다. 더 새로운 연산자의 능력 평가, β-galactosidase mRNA 불리고 정 맥 이식의 추출 물에는 또한 측정 양적 역전사 중재 PCR를 사용 하 여 glyceraldehyde 인산 염의 수준에 신호를 정상화 효소 (GAPDH) mRNA 측정 같은 정 맥 이식.
New 연산자에 의해 불리고 정 맥 이식에서 β-galactosidase mRNA의 수준은 크게 정 맥 이식 경험이 연산자 (그림 5)에 의해 불리고 있는 β-galactosidase mRNA 수준에서 다른 했다. 숙련 된 운영자에 의해 불리고 정 맥 이식에서 mRNA 샘플 비교를 위해 사용할 수 없는 경우, 부정적인 컨트롤 정 맥 이식 mRNA 정 맥 시험에 의해 생성 될 수 있습니다 비 표현 제어 벡터 (AdNull)으로 이식. 우리 것으로 나타났습니다 β-galactosidase mRNA의 평균 수준을 정 맥 이식 경험이 연산자에 의해 불리고는 약 1,000-fold AdNull 불리고 이식 (그림 5)에서 측정 하는 β-galactosidase mRNA에 대 한 배경 PCR 신호 보다 더 높은 .
그림 1 . 반전된 바로 외부 경 정 맥에서 오른쪽 일반적인 경 동맥 이식의 엔드-투-사이드 anastomoses와 배치. 정 맥 이식 (파란색)은 두 개의 anastomoses에서 일반적인 경 동맥 (빨간색)에 봉합. 각 문 합에 바늘 (화이트 X) 배치는 순서 대로 번호가 매겨집니다. 모두는 anastomoses의, 바느질 1 봉합 외부 경 정 맥에 arteriotomy의 꼬리 끝. 바느질 2 봉합 외부 경 정 맥에 arteriotomy의 두개골 끝. 스티치 3 처음 두 바늘에서 등거리 지점에서 문 합의 측면에 배치 됩니다. 스티치 4 문 합, 등거리에서 처음 두 개의 스티치 및 스티치 3 건너편의 중간 측에 배치 됩니다. 4 개의 추가 바늘 (바늘 5-8) 4 개의 기존 바늘 사이 배치 됩니다. 경 동맥 세그먼트는 anastomoses 사이 3-0 비단 봉합 (화살표)와 양 끝에서 출혈 및 분할 (파선)는 합자 사이. 왼쪽 면 이식 비슷한 방식으로 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 생성 및 경 arteriotomy의 폐쇄. (A) 일반적인 경 동맥 adventitia 미세 집게와 정 맥 이식 근처 파악은 하 고 상승 견인 동맥 벽에 적용 됩니다. 이 구부러진된 21 G 바늘을 삽입할 수 있도록 수직 서피스를 생성 동맥의 뒤 벽을 puncturing의 위험을 감소 배 루멘에 약 하 게 평행 하 게. (B)는 arteriotomy X 패턴에 7-0 폴 리 프로필 렌을 사용 하 여 봉합 이다. 첫 번째 봉합 패스 arteriotomy (1 사이트의) 오른쪽 하단에 동맥 루멘을 입력 하 고 왼쪽 하단 (2 사이트에) 루멘을 종료. 봉합은 다음에 arteriotomy 십자가. 다음 패스 (위치 3), 오른쪽 상단에 루멘을 재입력 하 고 (4 사이트) 왼쪽 상단에 루멘을 종료 합니다. 부드러운 견인 봉합 (사이트 1에서 사이트 4 종료 끝)의 끝에는 arteriotomy를 닫습니다. 봉합 끝 2 스퀘어 매듭와 함께 묶여있다. 솔리드 블루 원형 봉합 동맥 벽을 관통 하는 위치를 나타냅니다. 파란색 실선 표시 봉합; 동맥 벽의 외부 전달 파란색 점선된 라인 봉합 루멘 안에 위치 하 고 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 경 피 성 초음파 이미지 평가 토끼 목의 정 맥 이식 patency 접목 후 5-7 일. (A) 특허 정 맥 이식 (빨간) 혈과 꼬리-두개골 방향에는 표시 (화살표). (B) 폐색 이식 정 맥. 아니 꼬리-두개골 혈액 흐름 (빨간색 표시) 검색 됩니다. 내부 경 정 맥 (파란색) 두개골-꼬리 방향으로 혈액의 흐름을 표시 (별표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 베타-galactosidase transgene 식 정 맥 이식에. 접목, 후 28 일 토끼 정 맥 이식 수술 고립 된 정 맥 이식의 루멘 내 β-galactosidase 표현 adenoviral 벡터의 20 분 부 화에 의해 불리고 있었다. 정 맥 이식 변환 후 수확된 3 일 있었고, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside와 스테인드. (A) En 얼굴 이미지의 효율적인 변환 보여주는 정 맥 세그먼트의 luminal 표면. (B) 가난한 변환 보여주는 정 맥 세그먼트의 luminal 표면의 En 얼굴 이미지. 눈금 막대 = 1.0 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 베타-galactosidase (β-gal) transgene의 표현에 정 맥 이식 세그먼트 mRNA. 토끼 년에 경 정 맥 개재 이식의 배치 후 28 일에 이식 했다 불리고 베타-galactosidase (AdnLacZ) 표현 adenoviral vector 또는 제어 adenoviral 벡터는 transgene (AdNull을 표현 하지 않는다 ). 수술 경험이 연산자 (외과 1) 또는 (외과 2) new 연산자에 의해 완료 되었다. 정 맥 이식 AdnLacZ로 불리고 변환 후 모든 수확된 3 일 이었다. 이식 AdNull로 불리고 고 수확 14 일 후에 변환도 분석, 부정적인 컨트롤에서 추출 하는 RNA 베타-galactosidase mRNA의 표현 glyceraldehyde 인산 효소 mRNA 동일한 추출에서 측정 하 고 임의의 단위 (AU)로 정규화 하는 값으로 정량 역전사 중재 PCR에 의해 정량 했다. 막대 표시 의미 값; p 값은 순위 합계 테스트에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 중요 한 단계에는 마 취 관리, anticoagulation, 외과 동맥/투입 정 맥의 조작과 이식할된 정 맥의 hemodynamic 측정 포함 됩니다. 마 취의 적절 한 관리는 포함 하는 두 개의 비교적 긴 작업 (일반적으로 3-3.5 h 양자 정 맥 접목 및 양측 이식 변환에 대 한 1.5-2.5 h)이 여러 생존 수술 모델에에서 중요 한. 우리 마 취는 nosecone 통해 고 endotracheal 삽 관 법에 의해 관리 하 고는 삽 관 법 가능성이 긍정적인 압력 환기는 atelectasis를 방지 하기 때문에 이식 변환 수술 후 생존을 개선 하 고 관련 된 발견 호흡 실패입니다. 토끼를 넣어야 하 고, 도전 그리고 기도 삽 관 법 관련 외상 수술 stridor 발생할 수 있습니다. 그러나, 도전과 삽 관 법의 합병증은 수술 사망률 및 정 맥 이식 수술 연관 사망률의 대부분을 제거 하는 위하여 지불할 작은 가격.
Anticoagulation 중 생존 수술 후 발생할 수 있는 융합 하였습니다 혈관의 혈전 증을 방지 하기 위해 필수적 이다. 혈전 증은 경 피 성 초음파 검사에 특허 5-7 일 postoperatively 정 맥 이식 특허 수확에 거의 항상 있기 때문에 초기 수술 후 이벤트를 것 처럼 보인다. 첫 번째 수술 후는 혈전 증을 방지 하기 위해 (즉., 이식 정 맥), 4 헤 파 린은 첫 번째 외부 경 정 맥을 수확 하기 전에 관리. 토끼 (1-2 h)에 헤 파 린 플라스마 반감기에 따라, 4 헤 파 린에의 한 추가 절반 복용량 contralateral 외부 경 정 맥을 수확 하기 전에 관리 된다. 또한, 개별 정 맥 이식의 arteriovenous anastomoses 모두 완료 될 때까지, 우리는 경 동맥과 정 맥 이식 heparinized 일반적인 염 분으로 8 분 마다 약의 루멘 플러시. 이식 혈전 증을 방지 하려면 주의 해야 하지 정 맥 이식-특히 내 피를 손상 하기-수확 및 이식 하는 동안. 이것 포함 부드러운 수술 도구와 처리는 정 맥의 정 맥에 연결 된 adventitial 지방이 많은 직물의 얇은 층을 떠나. 우리는 또한 방지 하기 위해 융합 하였습니다 경 동맥 또는 혈전 증에 기여할 수 있는 리버스 vasospasm을 국 소 papaverine의 단 하나의 복용량을 관리 합니다.
외과 기술에 세심 한 주의 정 맥 이식 수술 중 필요 합니다. anastomoses, 이식 혈전 증, 및 통제 hemodynamic 변수의 소개에서 출혈을 방지 하려면 두 개의 arteriotomies의 적절 한 길이 여야 합니다. Arteriotomy는 너무 짧은 경우에, 문 합, 출혈을 허용 하는 간격을 만드는 사이트에 정 맥 이식 ostial 벽 중복 될 것입니다. arteriotomy 너무 긴 경우는 arteriotomy를 충당 하기 위해 정 맥을 스트레칭 가져올 것 이다 정 맥 이식 벽 근접, 어렵게 상대 정 맥을 봉합 하지 않으려면 외과 이식 벽 (기본적으로 보장 수술 후 함께 혈전 증)입니다. 또한, 정 맥 이식 루멘 정 맥은 지나치게 긴 arteriotomy를 기지개 하기 때문에 나가고는, 경우는 협이 만들어집니다 전단 응력을 증가, 혈전 증33, 경향 및 잠재적으로 같은 결과 변수를 변경 하는 neointimal 성장과 혈관 개장34,35. 또한, 루멘 축소 또는 비정상적인 흐름에 발생할 수 있습니다 정 맥 이식으로 소개 하는 왜곡을 피하기 위해 중요 하다. 이식의 왜곡 방지 하려면 우리는 항상 일반적인 경 동맥의 복 부 표면 정 맥 세그먼트를 정렬 하 고 아무 왜곡 정 맥에는 확인 하십시오. 변경할 변수 수술 기법에 대 한 잠재력으로 인해 정 맥 이식 hemodynamics 및 변경된 hemodynamics 결과 변수 치료에 독립적으로 영향을 미칠 수, 때문에 우리가 정기적으로 혈액의 흐름 및 이식 직경의 벡터 주입 전과에 측정 수확의 시간입니다. 우리는 전단 응력 및 pulsatility를 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다. 미리 정해진 범위 hemodynamic 측정 정 맥 이식 추가 분석, 통계적 인 힘을 증가 하 고 실험적인 가변성을 감소에서 객관적으로 제외할 수 있습니다.
우리가이 방법을 개발, 우리는 몇 가지 수정을 했다. 처음에, 우리는 이식 작업 중 정 맥 이식 유전자 이동 시도. 이러한 상황에서의 transgene 식 거의 완전 하 게 유전자 전송22후 3 일에 의해 분실 되었다. Transgene 식 여부 정 맥 세그먼트 제자리에 불리고 다음 투입 하거나 정 맥 먼저 투입 했다 그리고 다음 불리고 급속 하 게 분실 되었다. 만 정 맥 이식 했다 (우리는 짧은 지연 수 있습니다 비록 유전자 전송을 수행을 접목 후 28 일 때까지 기다렸다) 동맥 순환에 적응 한 후에 변환까지 지연 했다 transgene 식 피할22의 급속 한 손실 . 우리 또한 변환 nosecone 전달 마 취에서 endotracheal 튜브 전달 마 취 두 번째 (유전자 이동) 수술 자가 수술 후 사망자 발생 후. 또한, 발생 한 후 수술 후 토끼 폐 렴 명백한 포부, 우리 (아래 무 균 커튼) 토끼의 복 부에 작은 플라스틱 테이블을 배치 하기 시작 했다. 테이블 실수로 잠재적으로 위 식도 역류와 열망을 자극 하는 토끼의 복 부에 기대에서 외과 의사를 방지 하기 위해 배치 되었다. 우리 테이블의 배치 후 더 많은 포부 이벤트를 했다. 그러나,이 배치 endotracheal 삽 관 법을 shift와 동시에, 때문에 우리가 확신할 수 없습니다 어떤 개입 포부 이벤트를 제거에 대 한 책임이 있다.
또한이 메서드는 제한이 있습니다. 미국에서는, 토끼 대신 설치류를 사용 하 여 1966 년 실험실 동물 복지 행위의 요구 사항 준수를 필요로합니다. 따라서, 토끼 (또는이 법에 의해 보호 하는 다른 동물)를 사용 하 여 조사 운영 객실 및 전문가 담당 하 고 수술 후 모니터링 및 치료의 높은 수준을 제공 해야 합니다. 두 번째 한계 2 수술은 영구 transgene 식22를 보장 하는 데 필요한 것 이다. 두 번째 수술 실험의 비용을 증가 하 고 잠재력 수술과 수술 합병증의 추가 집합을 각 토끼를 노출. 그러나, 우리는 다른 어떤 유전자 전송 접근법 한다 정 맥 이식에 튼튼한 transgene 식의 인식 되지 않습니다. 이 방법의 세 번째 제한 HDAd 벡터의 건설 및 높은 titer HDAd 주식 준비 전문 지식이 필요로 하는. 많은 실험실 adenoviral, lentiviral, 1 세대와 전문성 그리고 adeno 관련 바이러스 (AAV)를 벡터, 하지만 상대적으로 적은 그룹 HDAd와 경험이 있고 일반적으로이 전문 지식을 얻기 위해 협력을 설정할 필요가 있을 것입니다. 방법의 임상 적용도 제한 될 수 있습니다. 인 간에 대 한 두 번째 수술 비용 및 합병증 위험을 증가할 것입니다. 토끼 외부 경 정 맥 인간의 saphenous 정 맥 (동맥 및 주변 바이패스 수술에 사용)에 비해 매우 얇은 벽을 더하여, 있다. 벽 두껍게 하 고는 개장 후 발생 토끼 외부 경 정 맥 동맥 순환으로 접목 감쇠 될 것 이라고 정 맥 이식에 이미 두꺼운 벽 경우 가능 하다. 마지막으로, 최대 6 개월까지 지속이 모델에 실험, 이식할된 혈관의 협 착22개발 했다. 따라서,이 방법은 정 맥 이식 실패에 기여 하는 생물 학적 과정의 모든 모델에 표시 되지 않습니다.
결론적으로, 메서드가 있는 transgenes는 시간 (6 개월 이상)22의 장기간 동안 안정적으로 표현 하는 이식할된 혈관 생성을 인간의 혈관 질환 (토끼)의 강력한 동물 모델을 사용 합니다. 안정적인 표현의 정 맥 이식에서 transgenes 정상적인 맥락에서 그들의 역할 항상성 이식 및 정 맥 이식 유전자 치료에 대 한 그들의 잠재력을 명확히 밝힐 것 이다. 메서드를 개선 하 고 더 임상 적용 함으로써 두 번째 수술을 피하 정 맥 이식에 벡터의 경 피 적인 납품을 허용 하는 기술의 개발에 의해 만들어 수 있습니다. 이 기술은 카 테 터 기반36,37하거나 그들은 주변 정 맥에 주입 하 고 대상으로 정 맥 이식 벽 예 자기장38에 의해 특별히 준비 벡터를 통합할 수 있는. 방법은 또한 lentiviral 포함 한 정 맥 이식 유전자 치료에 대 한 HDAd 이외의 벡터와 비 바이러스 성 벡터 뿐만 아니라 AAV 벡터의 테스트 수 있습니다. 39 , 40 , 41 , 42
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
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