Summary
Bu yöntem interpozisyonu ven greft tavşanların yerleşimini, greft iletim ve dayanıklı transgene ifade ulaşılmasına anlatılmaktadır. Bu soruşturma transgenes ve protein ürünlerini aşılı damarlarında fizyolojik ve patolojik rolleri ve gen terapileri ven greft hastalığı için test sağlar.
Abstract
Ven greft bypass cerrahisi tıkayıcı damar hastalığı için ortak bir tedavidir; Ancak, uzun vadeli başarı greft hatası nedeniyle kan pıhtılaşması, intimal hiperplazi ve ateroskleroz ile sınırlıdır. Bu makalenin amacı iki taraflı venöz interpozisyonu Greftler giyen bir tavşan..... yerleştirerek, sonra Greftler dayanıklı transgene ifade elde bir gen transferi vektör ile transducing bir yöntem göstermektir. Yöntemi normal ven greft homeostazı, genler ve protein ürünleri biyolojik rollerinin incelenmesi sağlar. Ayrıca transgenes ven greft başarısızlık, e.gengelleyebilir faaliyetleri için test sağlar., ister bir transgene ifade neointimal büyüme engeller, damar iltihabı azaltır veya ateroskleroz tavşanların azaltır beslenen yüksek yağlı diyet ile. Bir ilk hayatta kalma ameliyat sırasında sağ ve sol dış juguler ven parçalarını çıkardım ve bilateral ters uç-yan ortak karotid arter interpozisyonu greft yerleştirilir. 28 gün sonra gerçekleştirilen ikinci bir hayatta kalma ameliyat sırasında her greft dolaşımı damar klipleri ile yalıtılmış ve lümen (bir arteriotomy) yardımcı bağlı adenoviral (HDAd) vektör içeren bir çözüm ile doldurulur. 20-min kuluçka sonra vektör çözüm emişli, arteriotomy tamir ve akış geri yüklenir. Damarları bireysel deneysel iletişim kuralları tarafından dikte zaman noktalarda hasat. Greft yerleştirme ve iletim arasında 28 günlük gecikmeye arteriyel dolaşımı için ven greft adaptasyon sağlamak gereklidir. Bu adaptasyon hızlı önce veya hemen sonra aşılama transduced ven greft oluşur transgene ifade kaybı önler. Sağlam, dayanıklı transgene ifade aşılı damarlarında elde etmek için onun yetenek benzersiz bir yöntemdir. Diğer büyük hayvan ven greft modellerle karşılaştırıldığında, tavşan düşük maliyetli ve kolay kullanım avantajları var. Kemirgen ven greft modellerle karşılaştırıldığında, tavşan bol doku analizi için sağlamak daha büyük ve daha kolay manipüle kan damarları var.
Introduction
Ateroskleroz lipid birikimi ve damar duvarındaki inflamasyon gemi lümen, kalp krizi, felç ve bacaklarda1,2kaybı daralma için kurşun Kronik iltihabi bir hastalıktır. Perkütan girişimler (Örn., anjiyoplasti ve stent uygulamaları) ve medikal tedavi (e.g., Statinler ve antiplatelet ajanlar) yararlı tedaviler için ateroskleroz; Ancak, koroner ve periferik dolaşımları ciddi obstrüktif hastalık her iki tedavisinde etkisiz çoğu zaman. Bypass greftleme, otojen damar parçalar, kullanarak şiddetli, diffüz koroner ve periferik damar hastalığı3,4olan hastalar tedavi için ortak bir yordam kalır. Ancak, her iki koroner yerleştirilen Greftler damar ve periferik dolaşımları zavallı uzun vadeli açıklık oranlarına sahip. Koroner dolaşım ven greft 1 yıl ve % 50 tıkandı yaklaşık % 10-20 10 yıl5,6tarafından tıkandı. Periferik dolaşım ven greft başarısızlık oranları 30-%50 5 yıl7de vardır.
Tam yerinde hastalığın bir tedavi gen ürünü teslim edebilirsiniz çünkü gen tedavisi damar grefti başarısızlık önlenmesi için çekici bir yaklaşımdır. Buna göre çok sayıda preklinik çalışmaları ven greft gen terapisi8,9test ettik. Ancak, aslında tüm bu çalışmaların erken zaman puan (2-12 hafta)10,11,12,13,14,15, etkinliğini inceledik 16 , 17. gen tedavisi müdahalelerin dayanıklı sağlayabilir bulgusuna farkındayız genellikle sonuçlar neointimal hiperplazi ve ateroskleroz4geç ven greft hatalarına karşı koruma (yıl). Aşılı damarlarında dayanıklı transgene ifade sağlar ve böylece gen tedavisi müdahalelerin geç gibi erken zaman noktalarda test sağlayan bir yöntem geliştirdik. Dayanıklı transgene ifade elde etmek için HDAd vektörler ve Gecikmeli İletim strateji yöntem içermektedir. HDAd vektörel çizimler sağlamak uzun süreli transgene ifade onlar viral genler tarafından bağışıklık sistemi18,19,transduced hücre tanıma (ve ret)20, önlenmesi, eksikliği nedeniyle 21. Ertelenen iletim (greft yerleştirme sonrası gerçekleştirilen 28 gün) erken aşılama22sonra oluşan arterialization işlemi sırasında transduced hücrelerinin kaybı önler.
Ven greft iletim greft yerleştirme10,11,12,15,16 zamanında tedavi transgene ifade ven greft duvardaki ulaşmak diğer yöntemleri itimat ,17. Seri olarak ölçülen zaman transgene ifade bu yaklaşım kullanarak hızlı bir şekilde iletim22,23sonra azalır. Buna göre bu yaklaşımı kullanarak çalışmalar ven, etkinlik 4 hafta ötesinde değerlendirilmesi ile en değil bir aşılama sonra 12 hafta ötesinde etkinliğini inceleyen değil. Buna ek olarak, bizim Yöntem damar grefti elde stably en az 24 hafta boyunca ve arterler büyük olasılıkla gerçekleştirilen benzer çalışmalar üzerinde tabanlı devam ederse transgene ifade devam ediyor uzun süre22,24. Biz kararlı transgene ifade, bu süre elde hiçbir diğer damar grefti gen terapisi müdahalesi farkındayız.
Bir tavşan modeli bizim yöntem geliştirmek için kullanılır. Diğerleri kemirgenler, tavşan, kullanmış ya da damar sınamak için daha büyük hayvanlar gen terapisi10,11,12,15,16,17,25grefti, 26. Kemirgen modellerle karşılaştırıldığında, adatavşanı are daha pahalı ve daha sıkı düzenleyici gereksinimlerine tabidir. Ancak, daha büyük hayvanlar için karşılaştırıldığında (Örn., domuzlar ve köpekler), adatavşanı are çok daha az pahalı satın almak ve ev ve işlemek daha kolay. Ayrıca, insan damarlarının fizyolojik tavşan damarları benzer27, onlar yeterince büyük perkütan girişimler28,29test etmek için kullanılabilir ve bu yeterli doku sağlar birden çok uç nokta (Örn., histoloji, protein, RNA) bir tek damar numune22,30kullanılarak incelenebilir. Ven greft tavşanlarla yüksek yağlı diyet ile beslenir, buna ek olarak, onlar ven greft ateroskleroz31,32, koroner arter bypass ven greft başarısızlık4,5 ortak bir neden olan geliştirmek . Bu aterosklerotik tavşan ven greft gen terapisi müdahaleler bu yöntemle teslim test etmek için bir substrat olarak hizmet verebilir. Sağlanan Protokolü tavşan ven greft dayanıklı transgene ifade ulaşmak için gerekli teknik becerileri Master müfettişler yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan iletişim kuralları ve çalışmalar Washington Office hayvan refah üniversite tarafından kabul edildi.
1. işlem öncesi (için tüm ameliyatları)
- Paraspinous kaslar kas içi enjeksiyon (IM) tarafından 30 mg/kg ketamin ve 1.5 mg/kg xylazine tavşanına anestezi.
Not: Yiyecek ve su ameliyattan önce sınırlı değildir. - Anestezi yeterli derinlik için beklerken, hazırlık odası ve ameliyathane (OR) tablolarda ayarlayın.
- Tavşan boyun ve kulak (sadece hayatta kalma cerrahi) intravenöz (IV) liman yerleşimini tıraş için hazırlık odasını hazırlayın. Oftalmik merhem, fentanil yama (hayatta kalma cerrahi), saç kesme makineleri, alkol hazırlık pad, ¾" kateter, enjeksiyon liman ve cerrahi bant x 24-G hazırlık masaya koyun.
- Ameliyathanede, izleme ekipmanları ayarla ve problar (elektrokardiyogram (EKG), Nabız oksimetri (SpO2) ve sıcaklık) ilişkili. IV pompa 100 mL serum fizyolojik IV çantalı bir 18-G veya 19-G iğne ile hazırlamak ve akış hızı 10 mL/h ayarla/kg (sadece hayatta kalma cerrahi). Oksijen ve isoflurane ekipman ile bir nosecone (damar grefti veya hasat ameliyatları) ayarlayın.
- Nosecone tavşan için güvenli hale getirmek için gaz nosecone için malzemeleri tüp etrafında bir gazlı bez şerit döngü. Bu döngü nereye nosecone için verdiği tüp çevreleyen. Gazlı bez şerit ücretsiz biter her ikisi de yaklaşık 45 cm uzun olmalıdır. Nosecone (ile ekli gazlı bez) tablo baş ucuna yerleştirin.
- Dolaşımdaki su açmak ve/veya zorla hava ısınma Battaniye OR tablo. Isınma battaniye üzerinde rulo havlu boyun desteği konumlandırın ve elektrokoter dağıtıcı elektrot tabak yerleştirin.
- Yerel bir analjezik olarak bir şırınga %2 lidokain HCl 1 mL birleştirmek ve % 0,5 bupivacaine HCl. 1 mL seyreltik virüs istenen konsantrasyonu (HDAd için 2 x 1011 viral parçacıkların/mL al, kullan) steril DMEM ve buz (gen transferi cerrahi sadece) üzerinde tutun.
- Yeterli bir anestezik derinlik ulaşıldıktan sonra tavşan ameliyat için hazırlayın.
Not: yeterli anestezik derinlik sağlamak için pedal çekilme refleks olmaması için Test. Ameliyat boyunca pedal refleks izlemeye devam edin.- Oftalmik merhem tavşan gözler için geçerlidir.
- Rektal sıcaklık probu yerleşim için izin vermek için hemen üstünde rektum eldivenli parmağınızla basın ve parmakları tavşan rektum muhbirlik kaldırmak için anüs doğru hareket.
- Sternal çentik dan tavşan mandibula kenarına tıraş. IV yerleşim için bir kulak ve fentanil yama yönetim (sadece hayatta kalma cerrahi) için ters kulak traş. SpO2 prob yerleşimini için sol arka orta ayak parmakları tıraş.
- Vektör infüzyon ameliyat için tavşan tüp takacağım. 4 mm O.D./3 mm Manşonsuz kimlik Endotrakeal Tüp, bir arthroscope üzerinde dişli kullanın. Tavşan sternal recumbency yerleştirin ve hiper-boyun uzatın. Geniş açık tutmak belgili tanımlık adatavşanı ağız ve glottis ve laryngeal kıvrımlar görselleştirmek için arthroscope kullanın. Sırasında ilham, yavaşça Endotrakeal tüp larinks ve trakea içine yerleştirin.
- Hayatta kalma ameliyatlarında yerleştirin ve bir 24-G IV kateter tavşan sol kulak damar içine güvenli ve o bir enjeksiyon portu ile kap. 25 µg/h fentanil yama belgili tanımlık adatavşanı sağ kulak için geçerlidir.
Not: Belgili tanımlık adatavşanı sağ tarafında konumlandırılmış bir cerrah için iletişim kuralıdır. Cerrah-ecek var olmak belgili tanımlık adatavşanı sol tarafında teller ve cerrah karşısında IV tutmak için bu adımı taraf tersine. Gelecekteki adımları gerektiği şekilde değişelim. - Damar grefti ve hasat ameliyat genel anestezi ile bir nosecone yönetmek; vektör infüzyon ameliyat için genel anestezi Endotrakeal tüp yoluyla yönetmek.
Not: Entübasyon tüm ameliyatlar için kullanılabilir. Deneyim, ancak, trakeal ve gırtlak travma komplikasyonlar entübasyon sırasında riskleri entübasyon faydaları daha ağır basar. Gen transferi için greft (özellikle tavşanlarda kolesterol beslemeli) içeren tek ameliyat cerrahidir hangi entübasyon net bir yarar sağlamak gibi görünüyor. - Tavşan Ameliyathaneye taşırlar. Tavşan sadece tavşan kafası konumlandırılmış boyun destek havlu ile ameliyat masasında sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Düz ve yaklaşık yatay kadar yavaşça tavşan boyun uzatmak.
- Nosecone (damar grefti ve hasat ameliyatları) tavşan için yer veya Endotrakeal Tüp (vektör infüzyon cerrahi) O2 1 L/dk ile bağlanın ve isoflurane başlatın. Bir nosecone kullanıyorsanız, ekli gazlı bez şeritler çevresinde tavşan boyun destek havlu ucu sarma tarafından güvenli. İsoflurane konsantrasyon (genellikle % 1-2) bir cerrahi anestezi düzeyini korumak için gereken şekilde ayarlayın.
- Merkezi elektrokoter dağıtıcı elektrot plaka tavşan geri altında. Rektal sıcaklık probu takın ve SpO2 sonda ve EKG ilan tavşan için geçerlidir.
- Serum fizyolojik damar tavşan sol kulakta kateter noktasına bağlanın ve IV infüzyon pompa 10 mL/sa başlatmak/kg. 1 saat sonra 5 mL/h için salin infüzyon hızı azaltmak/kg.
- Gevşek tavşan ön ayakları ameliyat masasına için bir kısıtlama bağla.
Not: İsteğe bağlı olarak, küçük bir plastik masa tavşan tavşan göğüs/karın bölgesinde basarak ve potansiyel olarak gastroözofageal reflü ve aspirasyon neden cerrah önlemek için üzerine yerleştirilebilir. - Subkutan lidokain/bupivacaine (2 mL, 50/50 mix, adım 1.2.4) enjekte (SQ) lokal anestezi için planlanan kesi hattı boyunca boynunda.
- Cerrahi dezenfekte yardımcınız olabilir site scrubs KLORHEKSİDİN GLUKONAT ve isopropanol alternatif 3 ile daha sonra site povidone-iyot ile sprey. Cerrah bodur, önlük ve eldiven, aseptik ilkeleri aşağıdaki var.
- Hayatta kalma cerrahi aseptik koşullar altında gerçekleştirmek. Steril olmayan tüm öğeleri işlemek ve aseptik steril malzemeler için cerrah geçmek veya aseptik onları bol dökümlü enstrüman masaya koyun yardımcınız olabilir.
- Aseptik steril olmayan ekipman mikroskop gibi işlemek için cerrah kullanım steril havlu var. 2 x cerrahi büyüteçler ameliyat ilk yarısında gerçekleştirirken giymek cerrah var.
2. damar grefti cerrahisi (yaşam)
- Aletleri ve steril alan hazırlamak.
- Steril paketleri (masa örtüsü, bir kağıt örtüsü ve 6 havlu) açın ve aseptik için cerrah ve içeriğini aktarmadan yardımcınız olabilir.
- Aracı tablo asmak. Kağıt örtüsü ve steril havlu bol dökümlü aracı tablo üzerine yerleştirin. 4 havlu ile yalnızca cerrahi sitesi boyunda maruz bırakarak tavşan, asmak. Kağıt örtüsü tavşan için yatıyordu. Bir havlu daha sonra kullanılacak olan ve sonuncusu yedeğidir.
- Sterilize edilmiş araç paketi açın ve aseptik alet tepsi için cerrah geçmek yardımcınız olabilir. Aletleri aracı tablo üzerinde düzenleyin.
- Aşağıdaki donanımları açın ve aseptik o cerrah için geçti veya enstrüman masaya koyun yardımcınız olabilir: bir 1-mL şırınga, bir 3-mL şırınga, bir 20-mL şırınga, bir 21 G iğne, 3-0 Poliglikolik Asit (PGA) dikiş, 5-0 PGA dikiş , 7-0 polipropilen sütür ve bir 24 G IV kateter.
- Elektrokoter kablonun bir 7,25" Kantrowitz forseps kullanarak tavşan kapsayan örtüsü için güvenli. Kablosunun fişini ucunu kenarına elektrokoterizasyon birimine bağlı ve Yardımcısı tarafından açık için ameliyat masasının üzerinde bırakın.
- Bir serum fizyolojik çanta veya yardımcısı tarafından düzenlenen flakon steril serum fizyolojik ile 20 mL şırıngaya doldur. Bu serum maruz doku dehidratasyon işlemi sırasında önlemek için gerektiği gibi kullanın.
- 5000 IU/mL heparin 0.1 mL 5 mL serum fizyolojik çözeltisi, i.eekleyerek 5 mL heparinized fizyolojik tuzlu su çözeltisi hazırlamak., 100 IU heparin/mL, küçük bir cerrahi kase. Bu çözüm karotid arter ve ven greft aşılama işlemi sırasında düzenli olarak temizlemek için kullanın.
- Tavşan boyun cerrahi sitesi üzerinden kağıt örtüsü delik. Kullanım havlu Mengeneler temel havlu yere delik köşe kelepçe.
- Vasküler diseksiyon
Not: 2 x cerrahi büyüteçler ameliyat bu bölümü ile yardım etmek için kullanın.- Sternal çentik ve alt çene (yaklaşık 7-9 cm uzunluğunda) arasında orta çizgi boyunca elektrokoter ile deriyi kesme ve tavşan boyun deri için havlu havlu Mengeneler ile kelepçe. Kaudal sonunda şerit elektrokoter ile ile kısa bir yanal kesme yapmak. Açık açık büyük makas kullanarak tüm orta çizgi boyunca fasya altında incelemek. Elektrokoter ile orta çizgi boyunca disseke Fasial katman kesti.
- Sağ taraftaki başlatın. Trakea örten sternohyoid kas ve ortak şah damarı ortaya çıkarmak için V şekilli sternocephalic kas arasında incelemek.
- 4-5 cm kesimini de ortak şah damarı dikkatle incelemek ve dokuları çevreleyen büyük dalları (genellikle yan başına 1-2) ücretsiz. Faringeal sinir geçiş için proksimale boyun tabanından diseksiyon klemple genişletir. Kullanım cerrahi silikon döngüler karotid arter geri çekilmesi diseksiyon sırasında yardımcı olmak. 5-0 ipek sütür ile ortak karotid arter büyük dalları her dal klemple kesmeden önce ligate.
Not: ortak karotid arter veya arter üzerinde çapraz daha küçük sinirler paralellikler vagus siniri bozmamaya dikkat. - Diseksiyon (adım 2.2.3) sol tarafında yineleyin.
- Doku-holding forseps subkutan doku katmanı geçici olarak kapatmak için kullanın. Dış juguler ven maruz kadar sağ tarafında deriden yüzeysel fasya incelemek. 4-5 cm kesimini de dış juguler ven teşrih ve şubeleri şube kesmeden önce küçük dalları 5-0 ipek sütür ile birleştirilmesi (ligasyon) çevreleyen doku üzerinden ücretsiz.
- Diseksiyon (adım 2.2.5) sol tarafında yineleyin.
- Heparin (150 IU/kg) IV kateter enjekte ve 10 mL serum fizyolojik ile yıkayın.
- Dış juguler ven sağ tarafta 3 cm segmentinin ölçmek ve kaudal sonuna 5-0 ipek sütür ile ligate. Damar kan ile doldurmak izin verin ve sonra beyin damar kesiminin sonuna ligate. Kafatası dış juguler ven kesiminin sonuna bölmek, dikkatli bir 24-G IV-kateter bağlı 3-mL şırınga kullanarak heparinized normal salin (100 U/mL) ile gemi floş. Kaudal sonunda ven segment bölün. Ven segment kaudal ve kraniyal biter belirsizliğe yer bırakmadan kimlik olan standart bir konumda yerleştirin.
- Damar grefti
- Asistan cerrah cerrahi büyüteçler kaldırmak ve cerrahi mikroskop (25 X) yerini ver.
Not: Cerrah içinde mikroskop steril bir havlu asmak. Bu kısırlık koruyarak mikroskop işlemek cerrah sağlar. - Şu ortak karotid arter her iki ucuna mini-kelepçeler için doldurma, sonra kaudal pensi yerleştirerek arter sağlamak için önce kranyal kelepçe yerleştirerek, izole segment, kelepçe.
- Sert kağıt (steril dikiş paketinden kullanılabilir) 1 × 2 cm parçası keser ve pozlama geliştirmek için ortak karotid arter altında yerleştirir.
- Bir arteriotomy kaudal pensi (kaudal arteriotomy) sadece kafatası gerçekleştirin. Arteriotomy uzunluğu kafatası sonuna damar çapına eşit olması gerekir. IV kateter aracılığıyla kaudal arteriotomy şırınga takın ve karotid arter lümen heparinized normal salin ile yıkayın.
- Kafatası sonuna kaudal arteriotomy 7-0 polipropilen sütür tek dikiş (Şekil 1) ile kullanarak, damar dikiş.
- Kaudal kaudal arteriotomy kafatası sonuna damar parçasının sonuna dikiş için ilk dikiş yerleştirin. İkinci dikiş kafatası kafatası sonuna damar parçasının kaudal arteriotomy sonuna dikiş için ilk dikiş, üzerinden 180 ° yerleştirin.
- Üçüncü dikiş bir noktada ilk iki dikiş, anastomoz yan tarafındaki üzerinden eşit uzaklıkta yer. Dördüncü dikiş anastomoz, ilk iki dikiş ve üçüncü dikiş karşısında eşit uzaklıkta medial tarafına yerleştirin. 4 ek dikiş (dikiş 5-8) her dikiş 1-4 arasında yerleştirin.
- Kraniyal arteriotomy kafatası klip kaudal tarafında gerçekleştirmek. Kraniyal arteriotomy kafatası sonu ve kaudal arteriotomy kaudal sonu arasındaki mesafe ven kesimin uzunluğu aynı olması gerekir. Kraniyal arteriotomy uzunluğu kaudal sonuna damar çapına eşittir.
- Ven cranially herhangi bir katlanmış tanıtımı olmadan karotis üzerine döşeme anastomoz uzanır. Karotid arter Temizleme ve kraniyal arteriotomy üzerinden heparinized normal salin ile damar. Serum arter kaudal anastomoz ile ven içine akar ve damar ücretsiz ve unsutured ucundan çıkar. Flushing ven Ayrıca büküm üzerinden önler.
- Kaudal sonuna damar kraniyal arteriotomy (Şekil 1) için dikiş.
- Kaudal sonuna damar parçasının kaudal sonuna kraniyal arteriotomy dikiş için bir ilk dikiş yerleştirin. İkinci bir dikiş kaudal sonuna damar parçasının kraniyal arteriotomy kafatası sonu dikiş yerleştirin. Anastomoz 2.3.5.2. adımda açıklandığı gibi tamamlayın. Sadece son düğüm üzerinde kafatası anastomoz bağlıdır önce kısa bir süre açık, kelepçe arka kanama izin vermek için disseke ortak karotid arter kesiminin, kafatası ucundaki karotid arter ve aşılı ven havada dışarı yıkar. O zaman, son düğüm sıkın.
- Ven greft doldurma kan ile izin ve kaudal pensi serbest bırakmak için kafatası kelepçe serbest bırakın. Tempolu pulsasyonu ven greft görülmelidir. Herhangi bir anastomoses kanamayı durdurmak için kuru gazlı bezle hafif basınç uygulayın.
- Her iki ucunda da anastomoses 3-0 ipek sütür ile bağlayan ortak karotid arter kesiminin ligate ve karotis (Şekil 1) bitişik harfler arasında yarım bölün. Karotid arter her anastomoz bitişik papaverin (3.5 mg/mL) birkaç damla uygulanır.
- Heparin (75 IU/kg) kulak IV kateter enjekte ve 10 mL serum fizyolojik ile yıkayın. Şu anda, fentanil yama fentanil analjezik plazma seviyeleri sağlamıştır kadar ameliyat sonrası analjezi sağlamak için buprenorfin (SQ, 0,02 mg/kg) enjekte.
Not: İlk iğne sonra plazma fentanil bir terapötik konsantrasyon ulaşıncaya kadar analjezi sağlamak için gerekli 6 h ek buprenorfin iğne (SQ, 0,02 mg/kg) olabilir. - Sol tarafta (adımları 2.2.8, 2.3.2-2.3.9) aşılama yineleyin.
- Subkutan doku 5-0 PGA dikiş ile sürekli bir modeli kullanarak kapatın. Cilt 3-0 PGA dikiş ile bir intradermal desen kullanarak kapatın. Her iki ucunda knot gömün.
- Asistan cerrah cerrahi büyüteçler kaldırmak ve cerrahi mikroskop (25 X) yerini ver.
- Ameliyat sonrası kurtarma, temizleme ve bakım
Not: tavşan anestezi sakin, sessiz bir ortamda kurtarmak izin verir. Tamamen iyileşmiş kadar tavşan uygun oksijenlenme ve vücut sıcaklık için sürekli olarak izlemek.- İsoflurane ve oksijen kapalı ve anestezi makine tavşan kesin. IV sıvı tüp tavşan kesmek, ancak acil erişim için kulak ven IV limanda bırakın.
- Tavşan bir kurtarma kafes için taşıma ve onun yanına koyun. Termal bir sıcak su battaniye (veya destek zorla-hava ısınma ile) sağlar. SpO2 stabil olana O2 nosecone tarafından ver.
- Tavşan ayağa kalk ve onun kafes içinde ambulate kadar diğer yanının her 15dk için tavşan çevirme. Sonra kulak IV Kanül kaldırmak ve tavşan onun kafes için dönün. Sadece tamamen anesteziden kurtarıldıktan sonra tavşan diğer hayvanlar şirkete geri.
- Biohazard ve "Sharps" atık bertarafı için herhangi bir atık aşağıdaki uygun iletişim kuralı atmayın.
- Postoperatively, belgili tanımlık adatavşanı sağlık ve cerrahi yara her gün kontrol edin. Fentanil yama tarafından yönetilen değil ağrı için ihtiyaç olarak buprenorfin yönetmek. Fentanil yama ameliyat sonrası günde 3 kaldırın.
3. Transkutanöz ultrason
- Greft açıklık değerlendirmek için ultrason sigara anestezi tavşan ' 5-7 gün ven greft cerrahisi ve gen transferi ameliyattan sonra muayenesi.
- Anestezi tavşan güvenli bir battaniyeye sarın ve tavşan boynunu genişletilmiş bir veteriner V-yalak sırtüstü yerleştirin. Boyun tıraş veya gerekirse, depilatory bir ajanı ile tüylerden. Boyun için ultrason jeli uygulayın ve bir ultrason muayenesi.
Not: Bir ultrason sınav de gen transferi cerrahi ve terminal greft hasat greft açıklık incelemek ve greft lümen çapı ölçmek için zamanda imzalat tavşan gerçekleştirilir. Sınav sadece boyun ovma önce yapılır ve sigara anestezi tavşan gelince benzer bir şekilde gerçekleştirilir.
- Anestezi tavşan güvenli bir battaniyeye sarın ve tavşan boynunu genişletilmiş bir veteriner V-yalak sırtüstü yerleştirin. Boyun tıraş veya gerekirse, depilatory bir ajanı ile tüylerden. Boyun için ultrason jeli uygulayın ve bir ultrason muayenesi.
4. gen transferi cerrahi gerçekleştirilen ~ 28 gün sonra greft yerleştirme (Survival cerrahi)
- Aletleri ve steril alan hazırlamak.
- Adımları 2.1.1-2.1.3 izleyin. ven greft ameliyatta.
- Aşağıdaki ekipman ve ya aseptik açmak yardımcı izin için cerrah geçmek veya enstrüman masaya yerleştirin: altı 1 mL şırınga (iğne ile) bir 3-mL şırınga, bir 20-mL şırınga, bir 21 G iğne, bir 19-G iğne, 3-0 PGA dikiş , 5-0 PGA dikiş, 7-0 polipropilen sütür, iki 24 G IV kateterler ve steril kan akışı sonda.
- Adımları 2.1.5-2.1.6 izleyin. ven greft ameliyatta.
- Arter ve ven greft yıkamak için bir 1-mL şırınga ile 1 mL DMEM ve virüs çözümü ile 1-mL-şırınga iki hazırlayın (~ 0.5-0.7 mL virüs çözüm/damar grefti). Virüs çözülme ve DMEM içinde seyreltik yardımcı'yı ver. Lidokain/bupivacaine (50/50 mix, adım 1.2.4) 0.5 mL bir 3-mL şırınga hazırla.
- Adım 2.1.8 ven greft cerrahisi izleyin.
- Yalıtım bitişik karotid arter ve ven greft
Not: Bu bölümü için 2 x cerrahi büyüteçler kullanılmalıdır.- Sternal çentik ve alt çene (yaklaşık 7-9 cm uzunluğunda) arasında orta çizgi boyunca elektrokoter ile deriyi kesme ve cilt aç havlu Mengeneler ile kelepçe. Lidokain/bupivacaine (50/50 mix, adım 1.2.4) 0.5 mL subkutan doku için geçerlidir.
- Kaudal sonunda şerit elektrokoter ile ile kısa bir yanal kesme yapmak. Açık açık tüm orta çizgi boyunca fasya altında incelemek. Orta çizgi boyunca disseke fasya elektrokoter ile kesti.
- Sağ taraftaki başlatın. Trakea overlaying sternohyoid kas ve damar grefti ortaya çıkarmak için V şekilli sternocephalic kas arasında incelemek. Dikkatle ven greft ve 1.5-2.0 cm karotid arter greft kafatası ve kaudal iki bitişik izole etmek.
- 4.2.3. adımda takip sol tarafında diseksiyon yineleyin.
- Ven greft kan akımını ölçmek.
- Sağ tarafta cerrahi yara den ses dalgaları iletimini etkinleştirmek için normal salin ile doldurun. (Birim debimetre için bağlı) 2-mm perivasküler akışı sondayı salin yara boşluğunda içine sokmak ve akış oranı sıfır olarak ayarlayın.
- Karotid arter etrafında akış sonda kaudal veya kafatası ven greft için yerleştirin. Bir elektronik veri toplama sistemi ile akış sonda gelen verileri kaydetmek.
- 4.3.2. adımda takip sol tarafında akış ölçüm yineleyin.
- En yüksek sistolik kan akış hızı, en az diyastolik akım hızı ve ortalama akış oranı temelinde rezistivite hesaplayın. Ayrıca akış oranına göre laminer kesme stres ve lümen çapı (Transkutanöz ultrason ile ölçülen) hesaplar.
- Vektör çözüm ven greft demlemek
Not: Cerrahi mikroskop (16 X) delinme, infüzyon ve şahdamarı tamiri için gerektiği gibi kullanılır.- Cerrahın cerrahi büyüteçler kaldırmak ve cerrahi mikroskop yerini yardımcınız olabilir. Steril bir havlu üzerinde mikroskop asmak cerrah var. Steril havlu kısırlık koruyarak mikroskop işlemek cerrah sağlar.
- IV kateter heparin (150 IU/kg) enjekte yardımcınız olabilir ve serum floş.
- Bir büyük iğne sürücü yaklaşık 80 ° eğim hemen üstünde 21 G iğne eğmek için kullanın (eğimi; eğmek değil Şekil 2A).
- Ortak karotid arter ven greft ile mini-kelepçeler için doldurma, sonra kaudal klip yerleştirerek arter sağlamak için önce kranyal kelepçe yerleştirerek, her ucundaki kelepçe. Kaudal klip yaklaşık 10 mm arteriotomy de yer bırakın anastomoz, kaudal yerleştirin.
- İki ipek bağları atardamar etrafında sadece kaudal greft için koymak ve her - onları sıkma olmadan tek bir yukarıdan aşağı düğüm kravat.
- Boyun arterine için greft kaudal bükülmüş 21 G iğne kaudal vasküler klibin sadece kafatası delik. Arka veya yan duvarları delmek değil dikkatli olun. İğne lümen ve iki kez Lümen açık olduğundan emin olmak için ileri geri ilerlemek, sonra dikkatle iğne çekilme.
Notlar: Ortak karotid ponksiyon arteryel adventitia iyi forseps ile açgözlü ve hafifçe açık duvar iğne kaldırma noktasına (Şekil 2A) sadece kaudal ucu eklerken kaldırma tarafından destekli. Bu iğne ile arka duvarına isabet riskini azaltır. - Birkaç gelişeceğini gazlı bez yastıkları ile infüzyon için kullanılan şırınga yerleştirmek için bir yuva oluşturun. Bu gazlı bez yuva kaudal cerrahi siteye koyun.
- Salt DMEM şırınga 24 G IV-kateter koymak ve kateter şırınga üzerinde sıkın (şırınga silinecektir sonra bu ameliyatta) kaçağı önlemek yeterli ve kateter viraj ~ ucundan 4 mm böylece yayımlandıktan sonra viraj 75° tutar.
- Ortak karotid arteriotomy bend noktaya kadar IV kateter takın ve damar grefti lümen iki kez DMEM 0.5 mL ile yıkayın. Her yineleme için ven greft DMEM ile doldurun. Sonra DMEM hafifçe greft kafatası sonundaki eldivenli bir parmak basarak greft kaldırın. Dikkatlice parmak arteriotomy luminal içeriği ortaya çıkartmak için greft kaudal kısmına doğru kaydırın.
- DMEM şırınga kateter gemi içinde bırakarak kateter, kaldırın. Havasız kateter girer emin virüs solüsyon içeren şırınga bağlayın. Onlar kateter ucu, ama onları sıkın değil kadar gevşek düğümlü ipek arter bağları taşıyın.
- Kalan DMEM kateter dışarı itmek için virüs çözümü 0,03 mL süzülür. Tüm sıvı damar grefti lümen bir parmağınızla hafifçe kafatası için kaudal basarak çıkarın.
- Lümen imzalamaya arter ve kateter ucu etrafında iki bağları sıkın. Damar şişmiş kadar virüs çözümü süzülür. Şırınga gazlı bez yuva üzerinde yavaşça yere bırak.
Not: Ven greft onun öncesi iletim kalibre genişletir ve virüs infüzyon sırasında şişirilmiş kalır önemlidir. Eğer değilse, gen transferi miktarı önemli ölçüde azalmıştır. - Virüs içeren çözüm ven greft lümen 20 dk için bırakın ve sonra boş bir şırınga için kateter bağlı virüs içeren şırınga değiştirin. Gemi çöker kadar yavaşça greft virüs içeren çözümden Aspire edin. Kateter yerinde bırakarak şırınga, kaldırın. Kesmek ve ipek dikiş çöz ve kateter gemiden çekmek. Kateter dikkatli endotel zarar görmesini önlemek için karotis arterin kaldırın.
- Cerrahi mikroskop yardımıyla, arteriotomy 7-0 polipropilen sütür ile bir X-desen (Şekil 2B) kullanarak kapatın.
- Dikiş İğne bağı ile kavramak, sağ alt köşesinde arteriotomy gemisine girin ve sol alt köşesinde gemi çıkın. Açılış çapraz gemi dışında ve üst-sağdan ikinci geçişi için üst sola dön.
- Dikişi sıkma önce kısaca arter ve ven greft hava ve kalan virüs temizlemek için beyin damar klip serbest bırakın. Kıskaç serbest bırakıldığında kan arteriotomy dışarı akacaktır.
- Yakın dikişi hafifçe çekerek arteriotomy sona erer ve onları birlikte 2 kare knot kravat.
Not: dikişi çok sıkı çekerek, akışını rahatsız, kan pıhtılaşması riskini artırdığı, ve potansiyel olarak kontrolsüz değişkenleri tanıtmak dokusunun demetleme neden olur.
- Beyin damar klip, sonra kaudal klip bırakın. Herhangi bir hafif basınç uygulamak için gazlı bez kullanarak kanamayı kes.
- Bu sıralarda, fentanil yama analjezik fentanil plazma düzeyleri sağlamıştır kadar ameliyat sonrası analjezi sağlamak için buprenorfin (SQ, 0,02 mg/kg) enjekte.
Not: İlk iğne sonra plazma fentanil bir terapötik konsantrasyon ulaşıncaya kadar analjezi sağlamak için gerekli 6 h ek buprenorfin iğne (SQ, 0,02 mg/kg) olabilir. - Virüs infüzyon protokolü aşağıdaki adımları 4.4.5-4.4.15 sol tarafında yineleyin.
- Yara kapatma
- Subkutan doku ile 5-0 PGA dikiş, sürekli bir modeli kullanarak kapatın. Cilt 3-0 PGA dikiş ile bir intradermal desen kullanarak kapatın. Her iki ucunda knot gömün.
- Ameliyat sonrası kurtarma, temizleme ve bakım
- Adım 2.4 izleyin.
5. hasat (Terminal)
- Aletleri ve cerrahi sitesi hazırlamak.
- Adımları 2.1.1-2.1.3 ven greft cerrahisi izleyin.
- Açma ve aseptik enstrüman masaya yerleştirin (veya cerrah için geçmek) yardımcı'yı izin: bir 20 mL şırınga, bir 21G iğne, 3-0 ipek sütür ve steril kan akışı sonda.
- Adımları izleyin 2.1.5-2.1.6 ve 2.1.8 ven greft cerrahisi.
- Yalıtım ortak karotid arter ve ven greft
- Sternal çentik ve alt çene (yaklaşık 7-9 cm uzunluğunda) arasında orta çizgi boyunca elektrokoter ile deriyi kesme ve tavşan boyun deri için havlu havlu Mengeneler ile kelepçe.
- Kaudal sonunda şerit elektrokoter ile ile kısa bir yanal kesme yapmak. Açık açık tüm orta çizgi boyunca fasya altında incelemek. Elektrokoter ile orta çizgi boyunca disseke fasya kesti.
- Sağ taraftaki başlatın. Trakea örten sternohyoid kas ve ortak karotis ve damar grefti ortaya çıkarmak için sternocephalic V şekilli kaslar arasında incelemek.
- Doğru ven greft ve ortak karotid arter çevre dokulardan ücretsiz incelemek. Arter ve ven greft geri çekilmesi sırasında diseksiyon için cerrahi silikon döngüler kullanın.
- Diseksiyon aşağıdaki adımları 5.2.3-5.2.4 sol tarafında yineleyin.
- Aşağıdaki adımları 4.3.1-4.3.3 gen transferi cerrahi akışı ölçümleri yapmak.
- Hasat ven greft
- 3-0 ipek sütür ile Şu ortak karotid arter greft için kafatası ligate. O zaman için greft kaudal karotis ligate.
- Doğru ven greft bitişik karotid arter d ve bitişik anastomoz arasında bölerek tüketim. Ven greft tavşan çıkarma kaldırmak ve lümen serum fizyolojik ile yıkayın.
- Karotid arter ve anastomoses her iki uçtan ven greft kırpın. Ven greft uzak aşırı adventitial dokudan trim ve greft bölümler halinde farklı bitiş noktası analizleri için gerektiği gibi kesti.
- Sol ven greft adımları 5.4.1-5.4.3 tekrar ederek hasat.
- Fenitoin/Fentobarbital IV tavşan ötenazi için 1 mL enjekte.
- Biohazard ve "Sharps" atık bertarafı için herhangi bir atık aşağıdaki uygun iletişim kuralı atmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Işleç deneysel verileri oluşturmak için bu yöntemi kullanmadan önce yeni bir işleç teknik yeterlilik doğrulanması gerekir. Yeni bir işleç elde etmek gerekir ilk kilometre taşı tutarlı ven greft açıklık ven-aşılama ameliyat ve sonraki Gecikmeli İletim ameliyattan sonra olmuştur. Her ameliyat bir arzu ve ulaşılabilir sonra bitti % 90 açıklık. Açıklık olmayan invaziv genellikle ameliyat sonrası günlük 5-7 gerçekleştirmek Transkutanöz ultrason kullanarak tespit edilebilir. Tavşanlarla patent damarlar ultrason sınavı ön boyun (Şekil 3A) her iki tarafında tempolu kaudal-için-beyin kan akımı ile büyük bir kan damarı ortaya çıkaracaktır. Ya ven greft tıkandı, orada tespit kaudal-için-beyin kan akımı üzerinde olacaktır tehlikesi greft ile side(s). Ancak, kafatası-için-kaudal kan akımı hala iç juguler ven (Şekil 3B) tespit edilecektir.
Yeni bir işleç elde etmek gerekir ikinci kilometre ven greft endotel hücrelerinin verimli iletim taşıdır. Burada, β-galaktozidaz ifade eder adenoviral bir vektör endotel gen transferi verimliliğini değerlendirmek için kullanılır. Yeni bir işleç bizim laboratuarında ven greft bir adenovirus β-galaktozidaz (AdnLacZ) açıklanan yöntemleri kullanarak ifade transduced. Greftler hasat 3 gün sonra iletim vardı ve kesimleri içine kesti. Bazı kesimleri ile 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) lekeli. Tr yüz görüntüleme luminal yüzeylerin ven greft ile verimli iletim (Şekil 4A) ve zavallı iletim (Şekil 4B) gösterdi. Daha fazla yeni bir işleç yeterlilik değerlendirmek için β-galaktozidaz mRNA transduced ven greft özleri içinde da kantitatif PCR transkriptaz aracılı kullanarak ve sinyal gliseraldehit fosfat düzeyi için normalize ölçülür dehidrogenaz (GAPDH) mRNA aynı ven greft ölçülür.
Yeni operatör tarafından transduced ven greft β-galaktozidaz mRNA düzeyde deneyimli bir operatör (Şekil 5) tarafından transduced ven greft β-galaktozidaz mRNA düzeyleri önemli ölçüde farklı değildi. Deneyimli bir operatör tarafından transduced ven greft mRNA örnekleri karşılaştırma için kullanılabilir değilse, negatif kontrol ven greft mRNA ven transducing tarafından oluşturulan bir sigara ifade denetim ile vektör (AdNull) greft. O β-galaktozidaz mRNA ortalama düzeyde ven greft deneyimli bir operatör tarafından transduced yaklaşık 1000 kat daha fazla arka plan PCR sinyal AdNull transduced Greftler (Şekil 5) ölçülen β-galaktozidaz mRNA için daha yüksek bulduk .
Resim 1 . Bir ters değil dış juguler ven sağ ortak karotid arter greft ile uç-yan anastomoses yerleşimini. Ven greft (mavi) için ortak karotid arter (kırmızı) adlı iki anastomoses dikildi. Her anastomoz dikiş (beyaz x) hangi onlar yerleştirilir sıraya göre numaralandırılır. Her iki anastomoses için arteriotomy için dış juguler ven kaudal sonu 1 dikiş dikiş. 2 dikiş için dış juguler ven arteriotomy kafatası sonuna stitch. Dikiş 3 anastomoz ilk iki dikiş eşit uzaklıkta bir noktada yan tarafında yer alıyor. Dikiş 4 anastomoz, ilk iki dikiş ve dikiş 3 karşısında eşit uzaklıkta medial tarafında yer alıyor. Dört ek dikiş (dikiş 5-8) dört varolan dikiş arasında orta yerleştirilir. Karotid arter kesimi arasında anastomoses (kesik çizgi) bölünmüş ve 3-0 ipek sütür (oklar) ile her iki ucunda bakmaksızın bitişik harfler arasında. Sol taraflı Greftler benzer bir şekilde gerçekleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Oluşturma ve kapatılması karotid arteriotomy. (A) ortak karotid arter adventitia iyi forseps ile ven greft kavradı ve yukarı çekiş arter duvarına uygulanan. Bu eklenecek bükülmüş 21 G iğne sağlayan dikey bir yüzey oluşturur yaklaşık arter arka duvarına delinme riskini azaltmak gemi lümen paralel. (B) arteriotomy 7-0 polipropilen bir X-desen kullanarak dikmiş. İlk dikiş geçiş arter lümen sonundaki şu arteriotomy (sayfa 1) girer ve lümen alt sol (site 2) çıkar. Dikişi sonra arteriotomy haçlar. Sonraki lümen (sitesi 3) sağ üst yeniden girer ve lümen (site 4) üst sol çıkar. (Çıkış uçları site 1 ve site 4) dikiş ucunda yumuşak çekiş arteriotomy kapatır. Dikiş biter 2 kare knot ile bağlanmıştır. Katı mavi daireler nerede dikişi arteryel duvar nüfuz konumları belirtin. Nerede dikişi arteryel duvardaki dışında geçer katı mavi çizgilerle gösterilir; dikişi lümen içinde bulunan noktalı mavi çizgilerle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Tavşan boyunlu, değerlendirme Transkutanöz ultrason görüntülerini ven greft açıklık 5-7 gün sonra aşılama. (A)Patent ven greft (kırmızı) kan akımı ile kaudal-için-kranial yönde olduğu belirtilen (ok). (B) Utah'a ven greft. (Hangi kırmızı görünür) kaudal-için-beyin kan akımı tespit edilmiştir. Kan akışını kafatası-için-kaudal yönde ile iç juguler ven (mavi) belirtilir (yıldız işareti). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Beta galaktozidaz transgene ifadede ven greft. 28 gün sonra aşılama, tavşan ven greft 20 dk kuluçka adenoviral vektörlerin β-galaktozidaz cerrahi olarak izole ven greft lümen içinde ifade tarafından transduced. Ven greft hasat 3 gün sonra iletim vardı ve 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside ile lekeli. (A) tr yüz görüntü etkin iletim gösteren bir ven kesimi luminal ve yüzey. (B) tr yüz görüntü zavallı iletim gösteren bir ven kesimi luminal ve yüzey. Ölçek çubuğu 1.0 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Beta-galaktozidaz (β-gal) transgene ifade mRNA ven greft kesimleri içinde. 28 gün sonra juguler ven interpozisyonu Greftler tavşan şahdamarı içinde yerleşimini Greftler beta-galaktozidaz (AdnLacZ) ifade adenoviral bir vektör ile veya bir transgene (AdNull ifade edemediği bir denetim adenoviral vektör ile transduced ). Ameliyatlar deneyimli bir operatör (cerrah 1) ya da yeni bir işleç (cerrah 2) tarafından tamamlanmıştır. AdnLacZ ile transduced ven greft bütün hasat 3 gün sonra iletim vardı. AdNull ile transduced ve 14 gün sonra iletim Ayrıca, bir negatif kontrol analiz edildi hasat Greftler çıkarılan RNA. Beta galaktozidaz mRNA ifade transkriptaz aracılı kantitatif PCR ile mRNA aynı özleri ölçülen ve rasgele birimler (AU) ifade gliseraldehit fosfat dehidrogenaz için normalleştirilmiş değerlere sahip sayısal. Çubuklar ortalama değerleri gösterir; p değerleri sırası toplamlı testlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda anestezi yönetimi, arter/aşılı damar anticoagulation, cerrahi manipülasyon ve aşılı damarın hemodinamik ölçümleri içerir. İki nispeten uzun işlemleri (genellikle 3-3.5 bilateral ven greft için h ve ikili greft iletim için 1,5-2,5 h) içeren bu modelde birden çok hayatta kalma cerrahi anestezi düzgün yönetimi önemlidir. Biz anestezi ile bir nosecone ve endotrakeal entübasyon tarafından yönetilen ve entübasyon pozitif basınç havalandırma atelectasis engeller çünkü hayatta kalma greft iletim ameliyattan sonra muhtemelen geliştirilmiş ve ilişkili bulundu solunum yetmezliği. Tavşan entübasyon için zorlu ve entübasyon ile ilgili hava yolu travma ameliyat sonrası stridor neden olabilir. Ancak, sorunlar ve entübasyon komplikasyonları Perioperatif morbidite ve mortalite ven aşılama cerrahi ile ilişkili çoğunu ortadan kaldırarak yararı için ödenecek küçük bir bedel vardır.
AntiCoagulation hayatta kalma ameliyatların sonra oluşabilir aşılı damar trombozu önlemek için önemlidir. 5-7 gün postoperatively Transkutanöz ultrason muayenede patent ven greft neredeyse her zaman hasat patent olduğundan trombozu bir erken postoperatif olay gibi görünüyor. İlk ameliyattan sonra trombozu önlemek için (i.e., aşılama damar), IV heparin yönetilen ilk dış juguler ven hasat önce. Heparin (1-2 h) tavşanlarda plazma yarı ömrü bağlı olarak, bir ek yarım doz IV heparin kontralateral dış juguler ven hasat önce yönetilmektedir. Buna ek olarak, her iki arteriovenöz anastomoses bir bireysel ven greft tamamlanana kadar karotid arter ve ven greft yaklaşık her 8 min heparinized normal salin ile lümen sifonu çek. Greft trombozu önlemek için ven greft-özellikle de endotel zarar vermemeye özen gösterilmelidir-hasat ve aşılama sırasında. Bu nazik damar cerrahi aletler ile işleme ve adventitial yağ damarı için bağlı doku ince bir tabaka bırakarak içerir. Ayrıca önlemek için aşılı karotid arter veya tromboz için katkıda bulunabileceğini ters vasospasm tek doz topikal papaverin yönetmek.
Cerrahi teknik titiz dikkat damar cerrahi aşılama sırasında gereklidir. Anastomoses, greft trombozu ve kontrolsüz hemodinamik değişkenler getirilmesi kanama önlemek için iki arteriotomies uygun uzunluğu olmalıdır. Bir arteriotomy çok kısa ise, ven greft ostial duvar anastomoz, kanama izin boşluklar oluşturma sitesinde gereksiz olacaktır. Arteriotomy çok uzun ise, arteriotomy kapsayacak şekilde ven germe ven greft duvarları karşı damar dikiş önlemek cerrah zor yapım yakın getirecek greft duvarlar (aslında ameliyat sonrası garanti birlikte tromboz). Ven aşırı uzun bir arteriotomy kapsayacak şekilde gerilmiş çünkü ven greft lümen daralmış ayarladıysanız, Ayrıca, bir stenoz kesme stres artar, tromboz33' e açmaları ve potansiyel olarak sonuç değişkenleri gibi değiştirir oluşturulur. neointimal büyüme ve vasküler remodeling34,35. Buna ek olarak, lümen daralması veya anormal akışı neden olabilir ven greft içine katlanmış tanıtımı önlemek önemlidir. Greft büküm kaçınmak için biz her zaman damar segment ortak karotid arter menfez yüzey boyunca hizalayın ve hiçbir katlanmış ven olduğundan emin olun. Değiştirmek değişken cerrahi teknik potansiyeli nedeniyle damar grefti hemodinami ve değiştirilmiş hemodinami sonucu değişkenleri bağımsız olarak tedavi etkileyebileceğinden, rutin kan akışı ve greft çapı önce vektör infüzyon ve adlı ölçmek hasat zamanı. Yamultma stres ve rezistivite hesaplamak için bu değerleri kullanın. Damar grefti önceden belirlenen aralıklar dışında hemodinamik ölçümleri ile deneysel değişkenlik azalan ve artan istatistiksel güç daha fazla analiz, objektif olarak bırakılabilir.
Bu yöntem geliştirdik gibi birçok değişikliği yaptık. Başlangıçta, aşılama işlemi sırasında damar grefti gen transferi çalıştı. Ancak, bu şartlar altında transgene ifade neredeyse tamamen 3 gün sonra gen transferi22tarafından kayboldu. Transgene ifade ven segment transduced in situ yapıldı ve sonra aşılı ya da olup ven ilk aşılı ve sonra transduced hızla kayboldu. Ven greft (her ne kadar kısa bir gecikme olasılığı vardır gen transferi, gerçekleştirmek için aşılama sonra 28 gün kadar bekledik) arteriyel dolaşımı için uyarlanmış sonra sadece kadar iletim geciktirerek, kaçınılması transgene ifade22 hızlı kaybı oldu . Biz de nosecone teslim anesteziden Endotrakeal tüp teslim anestezi ikinci (gen transferi) cerrahi ameliyat sırasındaki ve ameliyat sonrası ölüm ettikten sonra dönüştürülür. Ayrıca, ameliyat sonrası bir tavşan belirgin aspirasyon pnömoni karşılaştıktan sonra biz küçük bir plastik masa (steril örtüler altında) belgili tanımlık adatavşanı karın üzerine getirin başladı. Tablo yanlışlıkla potansiyel gastroözofageal reflü ve aspirasyon uyarıcı tavşanın karnına eğilerek cerrah önlemek için yerleştirildi. Tablo yerleşim sonra daha fazla hiçbir aspirasyon olayı vardı. Bu yerleşim endotrakeal entübasyon için shift ile çakıştı çünkü ancak, hangi müdahale aspirasyon olaylar ortadan kaldırılması için sorumludur emin olamayız.
Bu yöntem ayrıca sınırlamalar vardır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, laboratuvar hayvan refah Yasası'nın gerekliliklere uyum 1966 kemirgenler yerine tavşan kullanımını gerektirir. Buna göre tavşan (veya bu kanun kapsamına diğer hayvanlar) kullanarak müfettişler iyi donanımlı ameliyathane ve uzman anestezi ve ameliyat sonrası izleme ve bakım yüksek düzeyde sağlamak gerekir. 2 ameliyat kalıcı transgene ifade22sağlamak için gerekli olan ikinci kısıtlamadır. İkinci ameliyat deneyler maliyetini artırır ve her tavşan için ek bir set potansiyel operatif ve perioperatif komplikasyonlar ortaya çıkarır. Ancak, ven greft dayanıklı transgene ifade elde diğer gen transferi yaklaşım farkında değiliz. Bu yöntemin üçüncü sınırlama HDAd vektörler inşaatı ve yüksek-titresi HDAd hisse senetleri hazırlanması uzmanlık gerektirmesidir. Uzmanlık ilk nesil ile adenoviral, lentiviral ve viral (AAV) vektörel çizimler adeno ilişkili birçok laboratuarlar var, ama nispeten daha az sayıda gruplar HDAd deneyimli ve genellikle bu bilgi birikimi elde etmek için bir işbirliği kurmak gerekir. Yöntem ve klinik uygulaması da sınırlı olabilir. İnsanlar için ikinci bir ameliyat maliyet ve komplikasyon riski artar. Buna ek olarak, insan safen damarlar (koroner ve periferik bypass ameliyatları için kullanılır) karşılaştırıldığında, tavşan dış şah damarları çok ince duvarlar var. Bir tavşan dış juguler ven arteryel dolaşıma aşılama zayıflatılmış sonra duvar kalınlaşma ve bu remodeling ven greft zaten daha kalın bir duvar varsa oluşur mümkündür. Son olarak, 6 aya kadar süren bu modelde deneylerde aşılı damarlar hiçbiri stenoz22geliştirdi. Bu nedenle, bu yöntem damar grefti başarısızlık katkıda biyolojik işlemlerin tümü modellemek için görünmez.
Sonuç olarak, yöntemi aşılı damarlar içinde transgenes stabil saat (en az 6 ay)22uzun süre için ifade edilir oluşturmak için güçlü bir hayvan modeli insan damar hastalığı (tavşan) kullanır. Transgenes ven greft olarak istikrarlı ifade rolleri normal ven homeostazı grefti ve potansiyellerini ven greft gen tedavisi için açıklığa kavuşacaktır ortaya çıkaracaktır. Yöntem geliştirilmiş ve böylece ikinci cerrahi kaçınarak ven greft için vektörel çizimler perkütan teslim sağlar teknikleri geliştirme tarafından yapılan daha klinik olarak uygulanabilir. Bu teknikler kateter tabanlı36,37olabilir veya periferik damar içine enjekte ve sonra ven greft duvara hedef örneğin manyetik alanlar38tarafından özel olarak hazırlanmış vektörel çizimler dahil olabilir. Yöntem de HDAd dışında vektörel çizimler için ven greft gen tedavisi, lentiviral de dahil olmak üzere ve AAV vektörel çizimler gibi viral vektörel çizimler test izin vermez. 39 , 40 , 41 , 42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W.
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
