Summary
Diese Methode beschreibt die Platzierung der Zwischenschaltung Vene Transplantationen bei Kaninchen, die Transduktion der Grafts und die Erreichung des dauerhaften Transgene Ausdruck. Dies ermöglicht die Untersuchung der physiologischen und pathologischen Rollen von transgenen und deren Proteinprodukte in veredelten Adern und Prüfung der Gentherapien für Venenleiden Transplantat.
Abstract
Ader-Transplantat-Bypass-Chirurgie ist eine gemeinsame Behandlung für arterielle Verschlusskrankheit; langfristiger Erfolg wird jedoch durch Transplantat Versagen aufgrund von Arteriosklerose, Thrombose und Intima-Hyperplasie begrenzt. Das Ziel dieses Artikels ist zu zeigen, ein Verfahren zur bilateralen venösen Zwischenschaltung Transplantate in ein Kaninchen zu platzieren, dann transducing die Transplantate mit einem Gen-Transfer-Vektor, der dauerhafte Transgene Ausdruck erreicht. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der biologischen Rollen von Genen und deren Proteinprodukte in normalen Vene Transplantat Homöostase. Es erlaubt auch das Testen von transgenen für Aktivitäten, die Vene Transplantat Versagen, z.B.verhindern könnte., ob der Ausdruck ein Transgen verhindert das Wachstum von Neointimal, reduziert die vaskuläre Entzündung oder reduziert Atherosklerose bei Kaninchen gefüttert mit einer fettreichen Diät. Während einer Operation zunächst überleben sind die Segmente des rechten und linken äußeren Halsschlagader herausgeschnitten und bilateral als umgekehrte Ende-zu-Seite Gemeinsame Halsschlagader Zwischenschaltung Transplantate platziert. Während einer zweiten überleben operiert, 28 Tage später jeder der Grafts ist isoliert aus dem Kreislauf mit vaskulären Clips und die Lumen (über eine arteriotomie) mit einer Lösung, die Helfer-abhängige adenoviralen Vektor (ADHD) gefüllt sind. Nach einer 20-min Inkubation die Vektor-Lösung wird abgesaugt, die arteriotomie repariert und Strömung wird wiederhergestellt. Geerntet werden die Venen zu Zeitpunkten einzelne experimentelle Protokolle diktiert. Die 28-Tage Verzögerung zwischen der Transplantat-Platzierung und die Transduktion ist notwendig, um die Anpassung des Transplantats Vene, die arterielle Durchblutung zu gewährleisten. Diese Anpassung verhindert schnellen Verlust der Transgen-Ausdruck, der in Vene Transplantationen ausgestrahlt vor oder unmittelbar nach der Transplantation auftritt. Die Methode ist einzigartig in seiner Fähigkeit, dauerhafte, stabile Transgene Ausdruck in veredelten Adern zu erreichen. Im Vergleich zu anderen großen Tieren Vene Transplantat Modelle, haben Kaninchen Vorteile von niedrigen Kosten und einfache Handhabung. Im Vergleich zu Nagetier Vene Transplantat Modelle, haben Kaninchen größer und leichter zu manipulieren Blutgefäße, die reichlich Gewebe zur Analyse zur Verfügung zu stellen.
Introduction
Arteriosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die in der Lipid-Akkumulation und Entzündungen in der Gefäßwand zur Verengung des Schiffes Lumen, Herzinfarkt, Schlaganfall und Verlust von Gliedmaßen1,2 führen. Perkutane Eingriffe (zB., Angioplastie und Stentimplantation) und medikamentöse Therapie (zB., Statine und thrombozytenaggregations-Agenten) gibt nützliche Behandlungen für Arteriosklerose; Sie sind jedoch oft unwirksam bei der Behandlung von schweren obstruktiven Erkrankungen in der koronaren und peripheren Zirkulation. Bypass-Operation, mit autogenen Venen Segmenten, bleibt ein gemeinsames Verfahren für die Behandlung von Patienten mit schweren, diffuse koronare und periphere arterielle Verschlusskrankheit3,4. Jedoch Vene Transplantate in beide die Herzkranzgefäße gelegt und peripheren Auflagen haben schlechte Durchgängigkeit Langzeittarife. In der Herz-Kreislauf sind etwa 10-20 % der Vene, die Transplantate mit 1 Jahr und 50 % verdeckt sind durch 10 Jahre5,6verdeckt. In die periphere Durchblutung sind Vene Transplantat Ausfallraten 30-50 % bei 5 Jahren7.
Gentherapie ist ein attraktiver Ansatz zur Prävention von Vene Transplantat scheitern, weil es eine therapeutische Genprodukt genau an die Stelle der Krankheit liefern kann. Dementsprechend haben zahlreiche präklinische Studien Vene Transplantat Gen Therapie8,9getestet. Aber haben im Wesentlichen alle diese Studien geprüft, die Wirksamkeit bei frühen Zeit Punkte (2-12 Wochen)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. wir kennen keinen Beweis, daß Gentherapie Interventionen dauerhaft zur Verfügung stellen können (Jahre) Schutz gegen Ende Vene Transplantat einrichten, die in der Regel aus Neointimal Hyperplasie und Atherosklerose4resultiert. Wir entwickelten eine Methode, die erlaubt langlebige Transgene Ausdruck in veredelten Venen und damit erlaubt das Testen der Gentherapie Interventionen zu spät sowie frühen Zeitpunkten. Um dauerhafte Transgene Ausdruck zu erreichen, beinhaltet die Methode ADHD Vektoren und eine verzögerte Transduktion Strategie. ADHD Vektoren bieten verlängerte Transgene Ausdruck, weil sie virale Gene ermangeln, verhindern die Anerkennung und Ablehnung von ausgestrahlt Zellen durch das Immunsystem18,19,20, 21. verzögerte Transduktion (durchgeführten 28 Tage nach der Transplantation Platzierung) verhindert den Verlust von Zellen ausgestrahlt während des Arterialization-Prozesses, der früh nach dem Pfropfen22auftritt.
Andere Methoden, die therapeutische Transgene Ausdruck in der Vene Transplantat Wand zu erreichen setzen auf die Transduktion des Transplantats Vene zum Zeitpunkt der Transplantation Platzierung10,11,12,15,16 ,17. Wenn seriell gemessen, lehnt Transgene Ausdruck mit diesem Ansatz schnell nach der Transduktion22,23. Dementsprechend haben Studien mit diesem Ansatz nicht die Wirksamkeit jenseits von 12 Wochen nach der Vene Aufpfropfen, mit der Beurteilung nicht Wirksamkeit über 4 Wochen untersucht. Im Gegensatz dazu unsere Methode erreicht Vene Transplantat Transgene Ausdruck, der weiterhin stabil für mindestens 24 Wochen und basierend auf ähnliche Studien Arterien-wahrscheinlich weiterhin viel länger22,24. Wir kennen keine andere Vene Transplantat Gen Therapie Intervention, die stabile Transgene Ausdruck dieser Dauer erreicht.
Ein Kaninchen-Modell verwendet, um unsere Methode zu entwickeln. Andere haben Nagetiere, Kaninchen, verwendet oder größere Tiere Ader testen Transplantat Gen Therapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Im Vergleich zu Nager-Modelle, Kaninchen sind teurer und unterliegen strengeren regulatorischen Anforderungen. Jedoch im Vergleich zu größeren Tieren (z. B.., Schweine und Hunde), Kaninchen sind weit weniger teuer zu kaufen und zu Haus und viel einfacher zu handhaben. Darüber hinaus Kaninchen Schiffe ähneln menschlichen Schiffe physiologisch27, sie sind groß genug, dass sie können perkutane Eingriffe28,29zu Testzwecken verwendet werden, und sie ausreichend Gewebe, die bieten mehrere Endpunkte (zB., Histologie, Protein, RNA) können mit einem einzigen Blutgefäß Probe22,30geprüft werden. Darüber hinaus, wenn die Kaninchen mit Vene Transplantationen mit einer fettreichen Diät gefüttert werden, entwickeln sie Vene Transplantat Atherosklerose31,32, ist eine häufige Ursache für koronare Bypass Vene Transplantat Ausfall4,5 . Diese arteriosklerotischen Kaninchen Vene Transplantate dient als Substrat für die Gentherapie Interventionen geliefert mit dieser Methode zu testen. Das angegebene Protokoll kann helfen, Ermittler, die nötige Fachkompetenz, langlebige Transgene Ausdruck in Kaninchen Vene Transplantationen zu erreichen zu meistern.
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Protocol
Alle tierischen Protokolle und Studien wurden von der University of Washington Büro Tierschutz genehmigt.
(1) vor der Operation (für alle Operationen)
- Die Kaninchen mit 30 mg/kg Ketamin und 1,5 mg/kg Xylazin durch intramuskuläre Injektion (IM) in den Paraspinous Muskeln zu betäuben.
Hinweis: Nahrung und Wasser werden vor der Operation nicht eingeschränkt. - Während des Wartens auf ausreichende Tiefe der Narkose, die Tische in den Vorbereitungsraum und OP-Saal (OR) eingerichtet.
- Bereiten Sie den Vorbereitungsraum für die Rasur des Kaninchens Hals und die Platzierung der intravenöse (IV) Hafen im Ohr (nur überleben-Chirurgie). Die Vorbereitungstisch ophthalmologischen Salbe, Fentanyl-Pflaster (Überleben Chirurgie), Haarschneidemaschinen, Prep Alkoholtupfer, 24 G x ¾" Katheter, spritzenport und chirurgische Klebeband aufsetzen.
- Im OP, Einrichten der Überwachungsgeräte und die damit verbundenen Sonden (Elektrokardiogramm (EKG), Pulsoximetrie (SpO2) und Temperatur). Vorbereiten die IV-Pumpe mit einer 100 mL Kochsalzlösung IV Tasche mit einer 18-G oder 19 G Nadel und legen Sie die Durchflussmenge als 10 mL/h/kg (nur überleben-Chirurgie). Stellen Sie den Sauerstoff und Isofluran Gerät mit einem Nosecone (Vene Pfropfung oder Ernte Operationen).
- Um das Nosecone, das Kaninchen zu schützen, Schleife einen Gaze-Streifen um das Rohr, das Gas, das Nosecone liefert. Diese Schleife sollte das Rohr umgeben, wo sie das Nosecone beimisst. Die freien Enden der Gaze-Streifen sollten beide ca. 45 cm lang sein. Legen Sie die Nosecone (mit angehängten Gaze) auf das Kopfende des Tisches.
- Schalten Sie das zirkulierende Wasser und/oder Umluft Erwärmung Decke auf den OP-Tisch. Auf die wärmende Decke einem gerollten Handtuch als eine Nackenstütze positionieren und der elektrokauter dispersive elektrodenplatte zu platzieren.
- Als ein lokales Schmerzmittel kombinieren in einer Spritze 1 mL 2 % Lidocain HCl und 1 mL 0,5 % Bupivacain HCl. verdünnen das Virus auf die gewünschte Konzentration (hier verwenden 2 x 1011 virale Partikel/mL für ADHD) in sterilen DMEM und halten Sie auf dem Eis (Transfer Genchirurgie nur).
- Nachdem eine ausreichende Narkose Tiefe erreicht ist, bereiten Sie die Kaninchen für Chirurgie.
Hinweis: Test für den Mangel an einem Pedal Rückzug Reflex, um ausreichende Narkose Tiefe zu gewährleisten. Weiterhin das Pedale Reflex während der Operation zu überwachen.- Ophthalmologische Salbe auf das Kaninchen Augen anwenden.
- Um die Platzierung einer Sonde Rektaltemperatur ermöglichen, mit behandschuhten Fingern direkt über das Rektum drücken Sie und bewegen Sie die Finger in Richtung des Afters zu entfernen aus dem Kaninchen Rektum konsumierte.
- Die Kaninchen von der sternalen Kerbe an den Rand des Unterkiefers zu rasieren. Rasieren Sie ein Ohr für die Platzierung von IV und dem gegenüberliegenden Ohr für Fentanyl Patch-Verwaltung (nur überleben-Chirurgie). Rasieren Sie die linken hinteren mittleren Zehen für die Platzierung der SpO2 Sonde.
- Für Vektor-Infusion-Chirurgie Intubation die Kaninchen. Verwenden Sie eine 4 mm O.D./3 mm I.D. Cuff endotracheal Schlauch über ein arthroskop eingefädelt. Legen Sie die Kaninchen in sternalen liegen und verlängern Sie hyper-den Hals. Halten Sie das Kaninchen Mund weit offen zu und verwenden Sie das arthroskop, die Stimmritze und Larynx Falten zu visualisieren. Legen Sie während der Inspiration sanft endotrachealen Schlauch durch den Kehlkopf und in die Luftröhre.
- Für den überleben-Operationen angebracht und einen 24-G-IV-Katheter in das Kaninchen linkes Ohr Vene befestigt und mit einer Injektion Port cap. Gelten Sie einen 25 µg/h Fentanyl Patch für rechten kaninchenohr.
Hinweis: Das Protokoll ist für einen Chirurgen auf das Kaninchen rechts positioniert. Wenn der Chirurg Links auf das Kaninchen sein wird, kehren Sie die Seiten in diesem Schritt die Drähte und IV gegenüber des Chirurgen zu halten. Wechseln Sie die Seiten in späteren Schritten, je nach Bedarf. - Für die Vene verwalten Pfropfen und Ernte Operationen Vollnarkose mit einem Nosecone; für die Vektor-Infusion-Chirurgie Verwalten der Vollnarkose durch einen endotracheal Schlauch.
Hinweis: Intubation kann für alle Operationen verwendet werden. Nach unserer Erfahrung können jedoch das Risiko von Komplikationen von trachealen und Kehlkopf Trauma während der Intubation der Intubation überwiegen. Die Operation, die Gentransfer auf ein Transplantat (insbesondere Cholesterin gefütterten Kaninchen) enthält ist die einzige Operation in die Intubation scheint einen Nettogewinn zu bieten. - Tragen Sie die Kaninchen in den op. Legen Sie die Kaninchen in Rückenlage auf dem OP-Tisch mit dem Hals Unterstützung Handtuch nur unterhalb der Hasenkopf. Erweitern Sie sanft das Kaninchen Hals bis es gerade und ungefähr horizontal ist.
- Legen Sie das Nosecone an den Hasen (Vene Pfropfen und Ernte Operationen) oder verbinden Sie den Endotrachealtubus (Vektor-Infusion-Chirurgie) mit O2 bei 1 L/min, und starten Sie Isofluran. Wenn ein Nosecone verwenden, sichern Sie es durch die Enden der angehängten Gaze-Streifen rund um das Kaninchen Hals Unterstützung Handtuch umwickeln. Passen Sie die Isofluran-Konzentration so (in der Regel 1-2 %) an eine chirurgische Anästhesie aufrecht zu erhalten.
- Zentrum der elektrokauter dispersive elektrodenplatte unter das Kaninchen Rücken. Einführen Sie die rektale Temperaturfühler und gelten Sie die SpO2 Sonde und EKG führt für das Kaninchen.
- Die saline IV-Leitung mit dem Katheter Anschluss im linken Ohr das Kaninchen verbinden und starten Sie die IV Infusionspumpe auf 10 mL/h/kg. Nach 1 h, reduzieren die saline Infusionsrate auf 5 mL/h/kg.
- Binden Sie Lose das Kaninchen Vorderbeinen auf dem OP-Tisch als eine Zurückhaltung.
Hinweis: Optional kann ein kleiner Plastiktisch über das Kaninchen zu verhindern, dass der Chirurg auf das Kaninchen Brust/Bauch drückt, und verursachen gastroösophagealen Reflux und Aspiration platziert werden. - Lidocain/Bupivacain (2 mL, 50/50 Mischung, Schritt 1.2.4) subkutan zu injizieren (SQ) in den Nacken entlang der geplanten Schnittführung für die lokale Anästhesie.
- Der Assistent der chirurgischen desinfizieren haben vor Ort mit 3 abwechselnd Peelings von Chlorhexidin Gluconat und Isopropanol, dann Sprühen Sie die Website mit Povidon-Jod. Haben Sie die Chirurgen Peeling, Kleid und Handschuh, aseptischen Grundsätzen folgen.
- Operationen Sie unter aseptischen Bedingungen überleben. Haben Sie der Assistent unsterile Gegenstände zu behandeln und der Chirurg aseptisch Sterilgut übergeben oder aseptisch legen Sie sie auf dem Instrumententisch drapiert.
- Haben Sie die Chirurgen Verwendung steril Handtücher, nicht-steriler Ausrüstung wie z. B. dem Mikroskop aseptisch zu manipulieren. Haben Sie der Chirurg 2 x chirurgischen Lupen zu tragen, während der Durchführung der ersten Hälfte der Operation.
(2) Vene Graft Chirurgie (Überleben)
- Bereiten Sie die Instrumente und sterilen Bereich.
- Haben Sie den Assistenten öffnen sterile Packungen (eine Tabelle drapieren, ein Papier drapieren und 6 Handtücher) und aseptisch übertragen der Inhalte für den Chirurgen.
- Drapieren Sie der Instrumententisch. Legen Sie das Papier drapiert und sterile Handtücher auf den Instrumententisch drapiert. Drapieren Sie mit 4 Handtücher die Kaninchen, so dass nur noch der Operationsstelle am Hals ausgesetzt. Legen Sie das Papier drapieren über das Kaninchen. Ein Handtuch wird später verwendet werden, und der letzte ist ein Backup.
- Haben Sie der Assistent öffnen die sterilisierten Instrumententafel und aseptisch der Chirurg das Instrument Tray übergeben. Ordnen Sie die Instrumente auf dem Instrumententisch.
- Der Assistent öffnen die folgende Geräte und aseptisch übergeben Sie es für dem Chirurgen oder platzieren Sie es auf dem Instrumententisch haben: eine 3-mL-Spritze, eine 20-mL-Spritze, eine Nadel 21 G, 3-0 Polyglycolic Säure (PGA) Naht, eine 1-mL-Spritze, 5-0 PGA Naht , 7-0 Polypropylen Naht und einer 24 G-IV-Katheter.
- Befestigen Sie elektrokauter Leitung zu den Faltenwurf für das Kaninchen, mit einer 7,25" Kantrowitz Zange. Fallen Sie das Stecker-Ende des Kabels über den Rand des Operationstisches Elektrochirurgie Gerät angeschlossen und eingeschaltet, indem der Assistent.
- Füllen Sie eine 20-mL-Spritze mit steriler Kochsalzlösung aus einer Kochsalzlösung Tasche oder Fläschchen vom Assistenten statt. Verwenden Sie diese Kochsalzlösung Bedarf, um die Austrocknung des exponierten Gewebes während der Operation zu verhindern.
- 5 mL heparinisierten physiologische Kochsalzlösung durch Zugabe von 0,1 mL Heparin 5.000 IE/mL bis 5 mL Kochsalzlösung, dhvorzubereiten., 100 IE Heparin/mL, in einer kleinen chirurgischen Schüssel. Mit dieser Lösung können die Carotis Arterie und Vene Transplantat während das Pfropfen Verfahren regelmäßig spülen.
- Schneiden Sie ein Loch in der Papier-Tuch über der Operationsstelle auf das Kaninchen Hals. Verwendung Handtuch Schellen, Klemmen Sie die Ecken des Lochs im Ort, um die zugrunde liegenden Handtücher.
- Vaskuläre Dissektion
Hinweis: Verwenden Sie 2 X chirurgischen Lupen, mit diesem Teil der Operation helfen.- Schneiden Sie die Haut mit elektrokauter entlang der Mittellinie zwischen der sternalen Kerbe und den Unterkiefer (ca. 7-9 cm lang) und das Kaninchen Haut des Halses, die Handtücher mit den Handtuch-Klemmen. Am kaudalen Ende machen Sie einen kurzen seitlichen Schnitt durch die Faszie mit elektrokauter. Unverblümt unter die Faszie entlang der gesamten Mittellinie mit einer großen Schere zu sezieren. Schnitt durch die seziert faszialen Ebene entlang der Mittellinie mit elektrokauter.
- Starten Sie auf der rechten Seite. Zwischen den Sternohyoid Muskel über die Luftröhre und die v-förmige Sternocephalic Muskel, die gemeinsame Halsschlagader aussetzen zu sezieren.
- Ein 4-5 cm Segment der gemeinsame Halsschlagader sorgfältig zu sezieren und größeren Filialen (in der Regel 1-2 pro Seite) frei von umgebenden Gewebe. Die Zerlegung von der Basis des Halses nach proximal bis zur Kreuzung des Nervus pharyngealen distal zu verlängern. Verwendung chirurgischen Silikon Schleifen um die Rücknahme der Halsschlagader während der Präparation zu unterstützen. Verbinden Sie die größeren Zweige der gemeinsame Halsschlagader mit 5: 0 seidenen Fäden vor dem Schneiden jede Verzweigung nach distal.
Hinweis: Achten Sie darauf, den Nervus Vagus zu stören, der parallelen der gemeinsame Halsschlagader oder kleinere Nerven, die über die Arterie zu überqueren. - Wiederholen Sie die Präparation auf der linken Seite (Schritt 2.2.3).
- Verwenden Sie Gewebe-Holding Zangen, um die subkutane Gewebeschicht vorübergehend zu schließen. Sezieren der oberflächlichen Faszie von der Haut auf der rechten Seite, bis die äußere Halsschlagader ausgesetzt ist. Sezieren ein 4-5 cm Segment der äußeren Halsschlagader und frei seine Äste aus dem umliegenden Gewebe, Ligation kleine Äste mit 5: 0 seidenen Fäden vor dem Schneiden der Branche.
- Wiederholen Sie die Präparation auf der linken Seite (Schritt 2.2.5).
- Heparin (150 IE/kg) in der IV-Katheter zu injizieren und mit 10 mL Kochsalzlösung spülen.
- Messen Sie ein 3-cm-Segment der äußeren Halsschlagader auf der rechten Seite und verbinden Sie der kaudalen Ende des Segments mit 5: 0 Seide Naht. Lassen Sie die Vene mit Blut zu füllen, dann verbinden Sie die kraniale Ende des Segments Vene. Teilen Sie der kraniale Ende des Segments äußere Halsschlagader, spülen Sie sorgfältig das Gefäß mit heparinisierten normale Kochsalzlösung (100 U/mL) mit einer 3-mL-Spritze an einem 24-G IV-Katheter befestigt. Teilen Sie die Vene Segment an seinem kaudalen Ende. Positionieren Sie die Vene-Segment standardisierte, in denen die kranialen und kaudalen enden eindeutig erkennbar sind.
- Vene Pfropfen
- Lassen Sie den Assistenten entfernt der Chirurg die chirurgischen Lupen und bewegen Sie das Operationsmikroskop (25 X) in Stellung.
Hinweis: Der Chirurg sollte über das Mikroskop ein steriles Tuch drapiert. Dies ermöglicht dem Chirurgen, das Mikroskop zu manipulieren, unter Beibehaltung der Sterilität. - Klemmen Sie direkt gemeinsame Halsschlagader an beiden Enden des Segments isoliert mit Mini-Klemme, die Craniale Klemme Arterie füllen, dann platzieren die Caudale Klammer zuerst zu platzieren.
- Schneiden Sie ein 1 × 2 cm Stück von steifem Papier (ab sterile Naht Verpackung) und legen Sie es unter die gemeinsame Halsschlagader, um die Belichtung zu verbessern.
- Führen Sie eine arteriotomie nur kranial an der kaudalen Klemme (der kaudalen arteriotomie). Die arteriotomie Länge sollte gleich dem Durchmesser des kranialen Ende des Segments Vene. Legen Sie die Spritze mit dem IV-Katheter durch den kaudalen arteriotomie und spülen Sie der Arteria carotis Lumen bei heparinisierten normale Kochsalzlösung.
- Naht kraniale Ende der Vene an der kaudalen arteriotomie, mit 7-0 Polypropylen Naht mit einzelstiche (Abbildung 1).
- Legen Sie die erste Masche um kaudalen Ende der kaudalen arteriotomie am kranialen Ende des Segments Vene Naht. Legen Sie die zweite Masche 180° von der ersten Masche, um die kranialen Ende der kaudalen arteriotomie am kranialen Ende des Segments Vene Naht.
- Legen Sie die dritte Masche an einem Punkt gleich weit entfernt von den ersten beiden Stiche an der lateralen Seite der Anastomose. Legen Sie die vierte Masche auf der medialen Seite der Anastomose, gleich weit entfernt von den ersten beiden Stiche und gegenüber dem dritten Stich. Legen Sie 4 zusätzliche Maschen (Maschen 5-8) zwischen den einzelnen Maschen 1-4.
- Führen Sie den kranialen arteriotomie auf der kaudalen Seite des kranialen Clips. Der Abstand zwischen der kranialen Ende des kranialen arteriotomie und kaudalen Ende der kaudalen arteriotomie sollte die Länge des Segments Vene identisch sein. Die Länge des kranialen arteriotomie ist gleich dem Durchmesser der kaudalen Ende des Segments Vene.
- Erweitern Sie die Vene cranially aus der Anastomose, legen es auf die Halsschlagader ohne Verdrehungen. Spülen Sie die Halsschlagader und Vene mit heparinisierten normale Kochsalzlösung über den kranialen arteriotomie. Die Kochsalzlösung wird durch die Arterie in die Vene über die Caudale Anastomose fließen und wird vom freien und unsutured Ende der Vene beendet. Flushing die Vene verhindert auch verdrehen.
- Naht der kaudalen Ende der Vene, die cranial arteriotomie (Abbildung 1).
- Legen Sie eine erste Masche um kaudalen Ende der kranialen arteriotomie am kaudalen Ende des Segments Vene Naht. Legen Sie einen zweiten Stich um kranialen Ende der kranialen arteriotomie am kaudalen Ende des Segments Vene Naht. Abzuschließen Sie die Anastomose, wie in Schritt 2.3.5.2 beschrieben. Kurz bevor der letzte Knoten auf der kranialen Anastomose gebunden ist, öffnen Sie die Halterung am kranialen Ende seziert gemeinsame Halsschlagader Segment, Rücken-Blutungen zuzulassen, die die Luft in der Arteria carotis und veredelte Vene wäscht kurz. Ziehen Sie den letzten Knoten.
- Lassen Sie die kraniale Klammer, damit Vene Transplantat Füllung mit Blut und lassen Sie dann die Caudale Klemme. Rege Pulsationen sollte in die Vene Transplantat gesehen werden. Üben Sie sanften Druck mit trockenen Gaze Blutungen bei der Anastomosen.
- Verbinden Sie beide Enden des gemeinsamen Halsschlagader Segment, das die Anastomosen mit einer 3: 0 Seide Naht verbindet und teilen Sie der Carotis auf halbem Weg zwischen der Ligaturen (Abbildung 1). Einige Tropfen Papaverine (3,5 mg/mL) auf die Halsschlagader neben jeder Anastomose anwenden
- Heparin (75 IE/kg) in das Ohr IV-Katheter zu injizieren und mit 10 mL Kochsalzlösung spülen. Spritzen Sie zu diesem Zeitpunkt Buprenorphin (SQ, 0,02 mg/kg) zur postoperativen Analgesie sorgen, bis das Fentanyl-Pflaster analgetische Plasmaspiegel von Fentanyl zur Verfügung gestellt hat.
Hinweis: Eine zusätzliche Buprenorphin-Injektion (SQ, 0,02 mg/kg) möglicherweise notwendigen 6 h nach der ersten Injektion Analgesie beizubehalten, bis Plasma Fentanyl eine therapeutische Konzentration erreicht. - Wiederholen Sie die Pfropfung auf der linken Seite (Steps 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Schließen Sie das subkutane Gewebe mit 5: 0 PGA Naht mit einem kontinuierlichen Muster. Schließen Sie die Haut mit 3: 0-PGA-Naht mit einem intradermale Muster. Begraben Sie die Knoten an beiden Enden.
- Lassen Sie den Assistenten entfernt der Chirurg die chirurgischen Lupen und bewegen Sie das Operationsmikroskop (25 X) in Stellung.
- Postoperative Erholung, Reinigung und Pflege
Hinweis: Lassen Sie die Kaninchen aus der Narkose in einer ruhigen Umgebung erholen. Überwachen Sie die Kaninchen kontinuierlich für richtige Sauerstoffversorgung und die Körpertemperatur, bis es vollständig erholt hat.- Schalten Sie Isofluran und Sauerstoff und das Kaninchen trennen Sie das Anästhesiegerät. Das Kaninchen trennen Sie IV Flüssigkeiten Schlauch, aber verlassen Sie den IV-Hafen in der Ohr-Ader für emergente Zugang.
- Die Kaninchen zu einem Recovery-Käfig zu transportieren und auf die Seite legen. Unterstützen Sie thermische mit warmem Wasser Decke (oder gezwungen-Luft Erwärmung). Geben Sie O2 durch Nosecone bis SpO2 stabil ist.
- Bis die Kaninchen können sitzen und in seinem Käfig ambulate, drehen Sie die Kaninchen auf die andere Seite alle 15 min. Dann entfernen Sie die Ohr IV Kanüle und die Kaninchen in seinem Käfig. Die Kaninchen an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, erst, nachdem es vollständig aus der Narkose erholt ist.
- Entsorgen Sie Abfälle folgenden entsprechenden Protokolle für Biohazard und Kleie Abfallentsorgung.
- Postoperativ, überprüfen Sie der Kaninchens Gesundheit und chirurgische Wunde jeden Tag. Verwalten Sie Buprenorphin Bedarf für Schmerzen, die nicht durch das Fentanyl-Pflaster verwaltet. Ziehen Sie das Fentanyl-Pflaster am 3. postoperativen Tag.
3. Transkutane Ultraschall
- Transplantat Durchgängigkeit bewerten, durchführen Sie Ultraschalluntersuchung auf Kaninchen nicht betäubt 5-7 Tage nach der Vene-Transplantat und Gentransfer Chirurgie.
- Wickeln Sie die nicht betäubt Kaninchen sicher in eine Decke und legen Sie die Kaninchen Rückenlage in einem tierärztlichen V-Trog mit seinen Hals verlängert. Rasieren Sie den Hals, oder bei Bedarf entfernen Sie die Haare mit einer Enthaarungscreme Agent. Tragen Sie Ultraschallgel auf, um den Hals und durchzuführen Sie eine Ultraschalluntersuchung.
Hinweis: Eine Ultraschalluntersuchung erfolgt auch an anästhesierten Kaninchen, die zum Zeitpunkt der Übertragung Genchirurgie und terminal Transplantat Ernte Chirurgie Transplantat Durchgängigkeit prüfen und Transplantat Lumen Durchmesser messen. Die Prüfung erfolgt kurz vor dem Hals Schrubben und erfolgt in ähnlicher Weise wie für die Kaninchen nicht betäubt.
- Wickeln Sie die nicht betäubt Kaninchen sicher in eine Decke und legen Sie die Kaninchen Rückenlage in einem tierärztlichen V-Trog mit seinen Hals verlängert. Rasieren Sie den Hals, oder bei Bedarf entfernen Sie die Haare mit einer Enthaarungscreme Agent. Tragen Sie Ultraschallgel auf, um den Hals und durchzuführen Sie eine Ultraschalluntersuchung.
(4) Gentransfer operiert ~ 28 Tage nach der Transplantation Platzierung (Überleben Chirurgie)
- Bereiten Sie die Instrumente und den sterilen Bereich.
- Befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3. in der Vene Transplantat Chirurgie.
- Lassen Sie den Assistenten folgende Geräte und entweder aseptisch öffnen der Chirurg übergeben oder platzieren Sie es auf dem Instrumententisch: sechs 1-mL-Spritzen (mit Nadel), eine 3-mL-Spritze, eine 20-mL-Spritze, eine Nadel 21 G, ein 19-G-Nadel, 3-0 PGA Naht , 5-0 PGA Naht, 7-0 Polypropylen Naht, zwei 24 G-IV-Katheter und eine sterile Blut fließen Sonde.
- Befolgen Sie die Schritte 2.1.5-2.1.6. in der Vene Transplantat Chirurgie.
- Vorbereiten einer 1-mL-Spritze mit 1 mL DMEM zum Waschen der Arterie und Vene Transplantat und bereiten zwei 1-mL-Spritzen mit Virus-Lösung (~ 0,5-0,7 mL Virus Lösung/Vene Transplantat). Lassen Sie den Assistenten Auftauen das Virus und verdünnen Sie es in DMEM. Bereiten Sie eine 3-mL-Spritze mit 0,5 mL Lidocain/Bupivacain (50/50 Mischung, Step 1.2.4).
- Folgen Sie den Schritten 2.1.8 in der Vene Transplantat Chirurgie.
- Isolierung der Ader Transplantate und angrenzenden Halsschlagadern
Hinweis: für diesen Teil sollte 2 x chirurgischen Lupen verwendet werden.- Schneiden Sie die Haut mit elektrokauter entlang der Mittellinie zwischen der sternalen Kerbe und den Unterkiefer (ca. 7-9 cm lang) und die Haut offen mit Handtuch Klemmen. Das Unterhautgewebe 0,5 mL Lidocain/Bupivacain (50/50 Mischung, Step 1.2.4) zuweisen.
- Am kaudalen Ende machen Sie einen kurzen seitlichen Schnitt durch die Faszie mit elektrokauter. Unverblümt unter die Faszie entlang der gesamten Mittellinie zu sezieren. Durchschneiden Sie mit elektrokauter die seziert Faszie entlang der Mittellinie.
- Starten Sie auf der rechten Seite. Zwischen den Sternohyoid Muskel Überlagerung der Luftröhre und der v-förmigen Sternocephalic Muskel, Ader Transplantat aussetzen zu sezieren. Isolieren Sie sorgfältig die Vene Transplantat und 1,5-2,0 cm der Halsschlagader angrenzend an das Transplantat beidseitig der kranialen und kaudalen.
- Wiederholen Sie die Präparation auf der linken Seite nach Schritt 4.2.3.
- Messen Sie den Blutfluss in der Vene Grafts.
- Füllen Sie die Operationswunde Hohlraum auf der rechten Seite mit normalen Kochsalzlösung ermöglichen die Übertragung von Schallwellen. Tauchen Sie eine 2 mm perivaskuläre Fluss Sonde (verbunden mit einer Volumen-Durchflussmesser) in den Salinen in der Wundhöhle und den Durchfluss auf NULL gesetzt.
- Legen Sie die Durchfluss-Sonde um die Arteria carotis kaudalen oder Schädel, die Vene Transplantat. Daten von der Durchfluss-Sonde mit einer elektronischen Datenerfassungssystem erfasst.
- Wiederholen Sie die Messung auf der linken Seite nach Schritt 4.3.2.
- Die pulsatilität basierend auf systolischen Strömungsgeschwindigkeit Peak, minimalen diastolischen Durchfluss und mittlere Strömungsgeschwindigkeit zu berechnen. Auch berechnen Sie laminar Schubspannung, basierend auf der Flussgeschwindigkeit und Lumen Durchmesser (gemessen durch Transkutane Ultraschall).
- Infusion von Vektor-Lösung in die Vene grafts
Hinweis: Ein Operationsmikroskop (16 X) dient bei Bedarf für die Punktion, Infusion und Reparatur der Halsschlagader.- Haben Sie den Assistenten Entfernen der Chirurg chirurgischen Lupen und verschieben das Operationsmikroskop in Position. Haben Sie den Chirurgen ein steriles Tuch über das Mikroskop zu drapieren. Die sterile Handtuch ermöglicht dem Chirurgen, das Mikroskop zu manipulieren, unter Beibehaltung der Sterilität.
- Der Assistent Spritzen Heparin (150 IE/kg) in der IV-Katheter und mit Kochsalzlösung spülen.
- Einen große Nadel-Treiber zu verwenden, um die Nadel 21 G bis ca. 80 ° oberhalb der schräge biegen (nicht knicken die Fase; Abbildung 2A).
- Klemmen Sie die gemeinsame Halsschlagader an jedem Ende der Vene Prothese mit Mini-Klemme, die Craniale Klemme Arterie füllen, dann platzieren des kaudalen Clips zuerst zu platzieren. Ort der kaudalen clip auf die Anastomose zu einigen Spielraum für die arteriotomie kaudalen ca. 10 mm.
- Zwei Krawatten aus Seide um die Arterie auf das Transplantat nur kaudalen gestellt und einen einzigen Overhand Knoten auf jeder - ohne festziehen.
- Punktion der a. carotis kaudalen um das Transplantat mit gebogenen Nadel 21 G nur kranialen kaudalen vaskuläre Clips. Achten Sie darauf, nicht die Rück- oder Seitenwand Wände durchbohren. Vorher die Nadel in das Lumen hin-und her, zweimal, um sicherzustellen, dass das Lumen klar ist, dann vorsichtig ziehen Sie die Nadel heraus.
Hinweise: Gemeinsame Halsschlagader Punktion kann durch das Greifen der arteriellen Adventitia mit feinen Zangen und leichtes Anheben der vorderen Wand beim einsetzen die Spitze der Nadel nur kaudalen auf den Aufzug Punkt (Abb. 2A) unterstützt werden. Dies reduziert das Risiko des Schlagens der Rückwand mit der Nadel. - Erstellen Sie mit mehreren entfaltet Gaze-Pads ein Nest zu legen Sie die Spritze für Infusionen verwendet. Legen Sie diese Gaze Nest kaudalen an der Operationsstelle.
- Die Spritze mit DMEM-nur 24 G IV-Katheter aufsetzen und festziehen den Katheter an der Spritze gerade genug, um auslaufen zu verhindern (die Spritze wird später in dieser Operation entfernt) und biegen Sie den Katheter ~ 4 mm von der Spitze, dass die Biegung bei ca. 75 ° c hält, nachdem es freigegeben wird.
- IV-Katheter in die gemeinsame Halsschlagader arteriotomie bis zu dem Punkt der Kurve einfügen und die Vene Transplantat Lumen zweimal mit 0,5 mL DMEM waschen. Füllen Sie für jede Wiederholung der Vene Transplantat mit DMEM. Dann entfernen Sie die DMEM aus der Prothese durch leichtes Drücken mit einem behandschuhten Finger am kranialen Ende des Transplantats. Schieben Sie vorsichtig den Finger in Richtung der kaudalen Ende der Prothese an der luminalen Inhalt über die arteriotomie durchspülen.
- Entfernen Sie die DMEM-Spritze vom Katheter, so dass des Katheters in das Schiff. Schließen Sie die Spritze mit der Virus-Lösung, um sicherzustellen, dass kein Lufteintritt in den Katheter. Bewegen Sie die lose geknüpfte Seide hinunter die Arterie bindet, bis sie rund um die Katheterspitze sind, aber nicht festziehen.
- Die Infusion 0,03 mL Virus-Lösung, die restlichen DMEM aus dem Katheter zu drücken. Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus der Vene Transplantat Lumen mit einem Finger drücken sanft vom kranialen kaudalen.
- Ziehen Sie die beiden Riegel um die Arterie und Katheter Spitze, das Lumen zu versiegeln. Infusion die Virus-Lösung, bis die Vene aufgebläht ist. Legen Sie sanft die Spritze auf das Nest der Gaze.
Hinweis: Es ist entscheidend, dass die Vene Transplantat seine Pre-Transduktion Kaliber erweitert und während der Infusion Virus aufgeblasen bleibt. Ist dies nicht der Fall, die Menge des Gentransfers wird deutlich verringert. - Lassen Sie die Virus-haltige Lösung in die Vene Transplantat Lumen für 20 min, und ersetzen Sie die Virus-haltigen Spritze des Katheters mit einer leeren Spritze befestigt. Aspirieren Sie die Virus-haltige Lösung aus dem Transplantat sanft bis das Schiff zusammenbricht. Ziehen Sie die Spritze, so dass des Katheters an Ort. Schneiden Sie und lösen Sie die seidenen Fäden und zurückziehen Sie des Katheters aus dem Gefäß. Entfernen Sie den Katheter aus der Arteria carotis sorgfältig um eine Beschädigung des Endothels.
- Schließen Sie mit Hilfe des Operationsmikroskops die arteriotomie mit 7: 0 Polypropylen Naht mit einem X-Muster (Abbildung 2B).
- Fassen Sie die Naht mit einem Nadelhalter, geben Sie das Schiff rechts unten auf die arteriotomie und verlassen Sie das Schiff an der unteren linken Ecke. Überqueren Sie die Öffnung außerhalb des Schiffes und den zweiten Durchlauf von oben rechts zu Links oben.
- Vor dem Festziehen des Nahtmaterials kurz Loslassen des kranialen vaskulären Clips um Luft und passives Virus aus dem Transplantat Vene und Arterie zu spülen. Blut wird aus der arteriotomie fließen, wenn die Klemme freigegeben wird.
- In der Nähe die arteriotomie durch leichtes Ziehen des Nahtmaterials endet und zusammen mit 2 Quadrat Knoten zu binden.
Hinweis: Die Naht zu eng ziehen bewirkt Wölbung des Gewebes stören den Fluss, Thrombose-Risiko erhöhen, und potenziell unkontrollierte Variablen einzuführen.
- Release des kranialen vaskuläre Clips dann der kaudalen Clip. Stoppen Sie eine Blutung mit Gaze, leichten Druck auszuüben.
- Spritzen Sie um diese Zeit Buprenorphin (SQ, 0,02 mg/kg) zur postoperativen Analgesie sorgen, bis das Fentanyl-Pflaster Schmerzmittel Fentanyl-Plasmaspiegel zur Verfügung gestellt hat.
Hinweis: Eine zusätzliche Buprenorphin-Injektion (SQ, 0,02 mg/kg) möglicherweise notwendigen 6 h nach der ersten Injektion Analgesie beizubehalten, bis Plasma Fentanyl eine therapeutische Konzentration erreicht. - Wiederholen Sie das Virus-Infusion-Protokoll auf der linken Seite, folgende Schritte 4.4.5-4.4.15.
- Wundverschluss
- Schließen Sie das subkutane Gewebe mit 5: 0 PGA Naht, mit einem kontinuierlichen Muster. Schließen Sie die Haut mit 3: 0-PGA-Naht mit einem intradermale Muster. Begraben Sie die Knoten an beiden Enden.
- Postoperative Erholung, Reinigung und Pflege
- Folgen Sie Schritt 2.4.
5. Ernte Chirurgie (Terminal)
- Bereiten Sie die Instrumente und die Operationsstelle.
- Befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 in der Vene Transplantat Chirurgie.
- Lassen Sie den Assistenten öffnen und aseptisch setzen auf dem Instrumententisch (oder pass für den Chirurgen): eine 20-mL-Spritze, eine Nadel 21G, 3-0 Seide Naht und eine sterile Blut fließen Sonde.
- Führen Sie die Schritte 2.1.5-2.1.6 und 2.1.8 Vene Transplantat Chirurgie.
- Isolierung von gemeinsamen Halsschlagadern und Ader Transplantate
- Schneiden Sie die Haut mit elektrokauter entlang der Mittellinie zwischen der sternalen Kerbe und den Unterkiefer (ca. 7-9 cm lang) und das Kaninchen Haut des Halses, die Handtücher mit Handtuch Klemmen.
- Am kaudalen Ende machen Sie einen kurzen seitlichen Schnitt durch die Faszie mit elektrokauter. Unverblümt unter die Faszie entlang der gesamten Mittellinie zu sezieren. Schnitt durch die seziert Faszie entlang der Mittellinie mit elektrokauter.
- Starten Sie auf der rechten Seite. Sezieren Sie zwischen den Sternohyoid Muskel über die Luftröhre und die v-förmige Sternocephalic Muskeln, die gemeinsame Halsschlagader und Vene Transplantat verfügbar zu machen.
- Die richtige Vene Transplantat und gemeinsame Halsschlagader frei aus dem umliegenden Gewebe zu sezieren. Verwenden Sie chirurgische Silizium Schleifen für die Rücknahme der Arterie und der Vene Transplantat während der Präparation.
- Wiederholen Sie die Dissektion auf der linken Seite folgende Schritte 5.2.3-5.2.4.
- Durchflussmessungen nach Schritte 4.3.1-4.3.3 gen Übertragung Chirurgie zu machen.
- Ernte der Vene Transplantationen
- Verbinden Sie mit 3: 0 Seide Naht rechts gemeinsame Halsschlagader cranial auf das Transplantat. Dann verbinden Sie die Carotis kaudalen um das Transplantat.
- Verbrauchssteuern Sie die richtige Vene Transplantat durch Division der angrenzenden Halsschlagader zwischen jedem der die Verbindlichkeiten und die angrenzenden Anastomose. Entfernen Sie die Vene Transplantat aus dem Kaninchen und spülen Sie das Lumen mit Kochsalzlösung.
- Schneiden Sie die Halsschlagader und Anastomosen von beiden Enden des Transplantats Vene. Trim entfernt überschüssiges adventitial Gewebe aus der Vene Transplantat und das Transplantat in Segmente geschnitten, als für die anderen Endpunkt Analysen benötigt.
- Ernten Sie die linke Vene Transplantat durch Wiederholen der Schritte 5.4.1-5.4.3.
- Spritzen Sie 1 mL Phenytoin/Pentobarbital IV, die Kaninchen einzuschläfern.
- Entsorgen Sie Abfälle folgenden entsprechenden Protokolle für Biohazard und Kleie Abfallentsorgung.
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Representative Results
Die technische Leistungsfähigkeit eines neuen Betreibers muss überprüft werden, bevor der Betreiber diese Methode verwenden kann, um experimentelle Daten zu generieren. Der erste Meilenstein, den ein neuer Betreiber zu erreichen, müssen ist konsequente Vene Transplantat Durchgängigkeit nach der ersten Vene Pfropfung Operation und die anschließende verzögert Transduktion Chirurgie. Über 90 % Durchgängigkeit nach jeder der Operationen wünschenswert und realisierbar ist. Die Durchgängigkeit kann beurteilt werden, nicht-invasiv mittels Transkutane Ultraschall, die wir in der Regel auf postoperativen Tag 5-7 durchführen. Bei den Kaninchen mit patent Venen zeigen die Ultraschalluntersuchung ein großes Blutgefäß mit flottem kaudalen-cranial Blutfluss auf beiden Seiten des vorderen Halses(Abbildung 3). Wenn entweder der Vene Transplantationen ist verdeckt, werden keine nachweisbaren kaudalen-cranial Durchblutung auf die Seite(n) mit den verstopften Graft. Cranio-Caudale Blutfluss wird jedoch noch in der inneren Halsschlagader (Abbildung 3B) nachgewiesen werden.
Der zweite Meilenstein, den ein neuer Betreiber zu erreichen, müssen ist effiziente Transduktion von Endothelzellen Vene-Transplantat. Hier wird ein adenoviralen Vektor, der β-Galaktosidase ausdrückt verwendet, um die Effizienz der endothelialen Gentransfer bewerten. Ein neuer Betreiber in unserem Labor ausgestrahlt Vene Transplantate mit ein Adenovirus β-Galaktosidase (AdnLacZ) mit den beschriebenen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Die Transplantate waren geernteten 3 Tage nach der Transduktion und in Segmente geschnitten. Einige Segmente wurden mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) gebeizt. En Face -Bildgebung der luminalen Oberflächen zeigte Vene Grafts mit effizienten Transduktion (Abb. 4A) und schlechte Transduktion (Abbildung 4B). Um die Ausprägung eines neuen Betreibers weiter zu bewerten, wird β-Galaktosidase mRNA in den Auszügen des Transplantats ausgestrahlt Ader auch gemessen mittels quantitativen Reverse-Transkriptase-mediated PCR und das Signal auf das Niveau der Glyceraldehyde Phosphat normalisieren Dehydrogenase (GAPDH) mRNA in der gleichen Ader Grafts gemessen.
Die β-Galaktosidase mRNA in Vene Transplantationen ausgestrahlt durch den neuen Betreiber waren nicht signifikant verschieden von den Ebenen der β-Galaktosidase mRNA in Vene Transplantationen ausgestrahlt von einem erfahrenen Bediener (Abbildung 5). Wenn mRNA Proben aus der Vene Grafts ausgestrahlt von einem erfahrenen Bediener nicht zum Vergleich vorliegen, Transplantate Negativkontrolle Vene Transplantat mRNA erzeugt werden kann, durch transducing Vene mit einem nicht mit dem Ausdruck ihrer Kontrolle Vektor (AdNull). Wir haben festgestellt, dass die mittlere Höhe der β-Galaktosidase mRNA in Vene Transplantate ausgestrahlt von einem erfahrenen Bediener sind etwa 1,000-fold höher als das Hintergrundsignal PCR für β-Galaktosidase mRNA in AdNull ausgestrahlt Transplantate (Abbildung 5) gemessen .
Abbildung 1 . Die Platzierung der eine umgekehrte direkt externe Halsschlagader-nach-rechts gemeinsame Halsschlagader-Transplantat mit End-to-Side Anastomosen. Die Vene Transplantat (blau) ist auf die gemeinsame Halsschlagader (rot) an zwei Anastomosen genäht. Bei jeder Anastomose Stiche (weiße x) sind in der Reihenfolge, in der sie platziert sind, nummeriert. Nähen Sie für beide die Anastomosen 1 Nähte kaudalen Ende der arteriotomie, die äußere Halsschlagader. Nähen Sie 2 Nähte kraniale Ende der arteriotomie, die äußere Halsschlagader. Stich 3 befindet sich an der lateralen Seite der Anastomose an einem Punkt gleich weit entfernt von den ersten beiden Stiche. Masche 4 befindet sich auf der medialen Seite der Anastomose, gleich weit entfernt von den ersten beiden Stiche und gegenüber dem Stich 3. Vier weitere Maschen (Maschen 5-8) befinden sich auf halbem Weg zwischen den vier vorhandenen Stichen. Die Arteria carotis-Segment zwischen den Anastomosen ist an beiden Enden mit 3: 0 seidenen Fäden (Pfeile) ligiert und geteilt (gestrichelte Linie) auf halbem Weg zwischen der Ligaturen. Linksseitige Transplantate werden in ähnlicher Weise durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Die Gründung und Schließung der Halsschlagader arteriotomie. (A) die gemeinsame Halsschlagader Adventitia ist in der Nähe der Vene Transplantat mit feinen Pinzette erfasst und nach oben Traktion auf der Arterienwand angewendet wird. Dadurch entsteht eine senkrechte Fläche, so dass gebogene Nadel 21 G eingefügt werden etwa parallel zum Schiff Lumen, Verringerung der Durchbohrung der hinteren Wand der Arterie. (B) die arteriotomie wird vernäht mit 7: 0 Polypropylen in ein X-Muster. Im erste Durchgang der Naht Arterie Lumen an der unteren Ecke des arteriotomie (Standort 1) betritt und verlässt das Lumen unten links (Seite 2). Der Faden kreuzt dann die arteriotomie. Der nächste Pass wieder betritt das Lumen rechts oben (Seite 3) und beendet das Lumen oben links (Seite 4). Sanfte Traktion an den Enden des Nahtmaterials (die Enden Ausfahrt von Seite 1 und Seite 4) schließt die arteriotomie. Die Fadenenden sind mit 2 Quadrat Knoten gebunden. Die solide blaue Kreise zeigen die Orte, wo die Naht der Arterienwand dringt. Die durchgezogenen blauen Linien zeigen, wo die Naht außerhalb der Arterienwand übergeht; gepunktete blauen Linien zeigen, dass die Naht in das Lumen befindet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Transkutane Ultraschallbilder von Kaninchen Hälse, Bewertung Vene Transplantat Durchgängigkeit 5-7 Tage nach der Pfropfung. (A) Patent Vene Graft (rot) mit Blutfluss im kaudalen-kranialer Richtung ist angegeben (Pfeil). (B) Okkludiert Vene Transplantat. Keine kaudalen-cranial Durchblutung (die rote erscheinen würde) erkannt wird. Die innere Halsschlagader (blau) mit Blutfluss in Cranio-Caudale Richtung angegeben (Sternchen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Beta-Galaktosidase Transgene Ausdruck in Vene Transplantationen. 28 Tage nach der Transplantation, wurden Kaninchen Vene Transplantationen von einer 20-min Inkubation adenovirale Vektoren Ausdrücken β-Galaktosidase in das Lumen der chirurgisch isolierte Ader Grafts ausgestrahlt. Vene Transplantate wurden geerntet 3 Tage nach Transduktion und gefärbt mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) En Face Bild der luminalen Oberfläche eine Vene-Segment zeigt effiziente Transduktion. (B) En Face Bild der luminalen Oberfläche eine Vene-Segment zeigt schlechte Transduktion. Maßstabsleiste = 1,0 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Expression des Transgens Beta-Galaktosidase (β-gal) mRNA in Vene Transplantat Segmenten. 28 Tage nach der Platzierung der Halsschlagader Zwischenschaltung Grafts in Kaninchen Halsschlagadern wurden die Transplantate ausgestrahlt, mit einem adenoviralen Vektor mit dem Ausdruck Beta-Galaktosidase (AdnLacZ) oder mit einem Steuerelement adenoviralen Vektor, der kein Transgen (AdNull zum Ausdruck bringt ). Operationen wurden durch einen erfahrenen Operator (Chirurg 1) oder einen neuen Operator (Chirurg 2) abgeschlossen. Vene Transplantate mit AdnLacZ ausgestrahlt wurden alle geernteten 3 Tage nach Transduktion. RNA entnommenen Grafts ausgestrahlt mit AdNull und 14 Tage nach Transduktion auch, als Negativkontrolle analysiert wurde geerntet. Der Ausdruck des Beta-Galaktosidase mRNA wurde durch quantitative Reverse-Transkriptase-mediated PCR mit Werte normiert auf Glyceraldehyde phosphat Dehydrogenase mRNA in den gleichen Auszügen gemessen und ausgedrückt als willkürliche Einheiten (AE) quantifiziert. Balken zeigen Mittelwerte; p -Werte sind von Rang-Sum-Tests. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wichtige Schritte in diesem Protokoll gehören die Verwaltung der Anästhesie, Antikoagulation, chirurgische Manipulation der Vene Arterie/veredelt und hämodynamische Messungen der veredelten Ader. Ordnungsgemäße Verwaltung der Anästhesie ist von entscheidender Bedeutung in diesem mehrere überleben Chirurgie Modell mit zwei relativ langen Operationen (in der Regel 3-3,5 h für bilaterale Vene Pfropfen und 1,5-2,5 h für bilaterale Transplantat Transduktion). Wir haben Anästhesie über eine Nosecone und durch endotracheale Intubation verabreicht und festgestellt, dass die Intubation das Überleben postoperativ Transduktion Transplantat möglicherweise verbessert weil Überdruckbeatmung der Atelektase verhindert und die damit verbundenen respiratorische Insuffizienz. Kaninchen sind anspruchsvoll, Intubation, und im Zusammenhang mit der Intubation Atemwege Trauma postoperativer Stridor verursachen kann. Allerdings sind die Herausforderungen und Komplikationen der Intubation ein kleiner Preis zu zahlen zum Wohle der Großteil der perioperativen Morbidität und Mortalität verbunden mit der Vene Pfropfen Operation beseitigen.
Antikoagulation ist notwendig, um die Thrombose der veredelten Venen, zu verhindern, die nach entweder überleben Operationen auftreten können. Die Thrombose scheint ein frühen postoperativen Ereignis sein, weil die Vene Grafts, die patent auf Transkutane Ultraschallprüfung 5-7 Tage nach der Operation sind fast immer patent bei der Ernte sind. Die Thrombose nach der ersten Operation zu verhindern (i.e., Vene, Pfropfung), IV Heparin ist vor der Ernte der ersten externen Halsschlagader verabreicht. Basierend auf die Plasmahalbwertszeit von Heparin bei Kaninchen (1-2 h), ist eine zusätzliche halbe IV Heparin verabreicht vor der Ernte der kontralateralen äußere Halsschlagader. Darüber hinaus, bis beide arteriovenösen Anastomosen von einer einzelnen Ader Transplantat abgeschlossen sind, spülen wir die Lumen der Arteria carotis und der Vene Prothese ca. alle 8 min mit heparinisierten normale Kochsalzlösung. Zur Vermeidung von Transplantat Thrombose sollte darauf geachtet werden, nicht zu beschädigen die Vene Transplantat-vor allem das Endothel-während der Ernte und Veredelung. Dazu gehören sanfte Handhabung der Vene mit chirurgischen Instrumenten und verlassen eine dünne Schicht der adventitial Fettgewebe an die Vene befestigt. Wir verwalten auch eine Einzeldosis von topischen Papaverine veredelte Halsschlagader zu verhindern oder umgekehrte vasospasmen, die zu Thrombose beitragen könnten.
Während die Vene Pfropfung Chirurgie ist Sorgfalt Operationstechnik erforderlich. Zur Vermeidung von Blutungen an der Anastomosen, Transplantat Thrombose und unkontrollierte hämodynamische Variablen eingeführt werden, müssen die beiden Arteriotomies die richtige Länge aufweisen. Wenn eine arteriotomie zu kurz ist, werden die Vene Transplantat ostial Wand redundante auf dem Gelände der Anastomose, Erstellen von Lücken, die Blutung zu ermöglichen. Wenn die arteriotomie zu lang ist, erstreckt sich die Vene zur Deckung der arteriotomie bringt die Vene Transplantat Wände in der Nähe, so dass es schwierig für den Chirurgen zu nähen die gegnerische Vene Transplantat Wände zusammen (im wesentlichen Gewährleistung postoperative (Thrombose). Darüber hinaus Wenn die Vene Transplantat Lumen verengt wird, weil die Vene gestreckt wurde, um eine überlange arteriotomie decken wird eine Stenose erstellt werden, erhöht die Scherspannung, prädisponiert zu Thrombose33, und möglicherweise verändert Ergebnis Variablen wie Neointimal Wachstum und vaskuläre umgestaltet34,35. Darüber hinaus ist es wichtig, zu vermeiden, Einführung von Wendungen in die Vene Transplantat, Lumen Verengung oder abnormen Fluss führen. Zur Vermeidung des Transplantats verdrehen wir immer ausrichten Segment Vene entlang der ventralen Oberfläche der gemeinsame Halsschlagader und sicherzustellen, dass es gibt keine Wendungen in die Vene. Aufgrund des Potenzials für Variable Operationstechnik ändern Vene Transplantat Hämodynamik und da veränderte Hämodynamik Ergebnis Variablen unabhängig von der Behandlung beeinflussen kann, messen wir routinemäßig Blut fließen und Transplantat Durchmesser vor Vektor-Infusion und bei die Zeit der Ernte. Wir verwenden diese Werte um Schubspannung und pulsatilität berechnen. Vene Grafts mit hämodynamischen Messungen außerhalb der vorgegebenen Bereiche können Objektiv von der weiteren Analyse, abnehmende experimentelle Variabilität und zunehmende statistische Trennschärfe ausgeschlossen werden.
Da wir diese Methode entwickelt, haben wir einige Änderungen gemacht. Zunächst versuchten wir Vene Transplantat Gentransfer bei der Pfropfen Operation. Allerdings war unter diesen Umständen Transgene Ausdruck fast vollständig von 3 Tagen nach gen Übertragung22verloren. Transgene Ausdruck war schnell verloren, ob die Vene-Segment wurde ausgestrahlt in Situ und dann veredelt oder ob die Vene war zunächst veredelt und dann ausgestrahlt. Nur durch die Verzögerung der Transduktion bis nach der Vene Transplantat an den arteriellen Kreislauf angepasst hatte (wir warteten bis 28 Tage nach der Pfropfung Gentransfer, ausführen, obwohl eine kürzere Verzögerung möglich sein könnte), war der schnelle Verlust des Transgens Ausdrucks vermieden22 . Wir auch umgewandelt aus der Narkose Nosecone geliefert endotracheal Schlauch geliefert Anästhesie für die zweite Operation (Gentransfer) nach intraoperative und postoperative Todesfälle zu erleben. Darüber hinaus nach der Begegnung mit scheinbaren Aspirationspneumonie in einem postoperativen Kaninchen, begannen wir, ein kleiner Plastiktisch über das Kaninchen Bauch (unter sterilen Tüchern) statt. Die Tabelle wurde aufgestellt, um verhindern, dass der Chirurg versehentlich stützte sich auf das Kaninchen Bauch, potenziell anregende gastroösophagealen Reflux und streben. Wir hatten keine Ereignisse mehr Streben nach der Platzierung des Tisches. Aber weil diese Platzierung mit dem Wechsel in endotracheale Intubation fiel, kann nicht wir sicher sein welche Intervention ist verantwortlich für die Beseitigung streben Veranstaltungen.
Diese Methode hat auch Grenzen. In den Vereinigten Staaten erfordert den Einsatz von Kaninchen anstatt Nagetiere Übereinstimmung mit den Anforderungen des Tierschutzgesetzes Labor von 1966. Dementsprechend müssen Ermittler mit Kaninchen (oder anderen Tieren, die durch dieses Gesetz abgedeckt) verfügen über gut ausgestattete Operationssäle und erfahrenen Anästhesisten und bieten ein hohes Maß an postoperative Nachsorge und Pflege. Die zweite Einschränkung ist, dass 2 Operationen erforderlich, um hartnäckige Transgene Ausdruck22zu gewährleisten. Die zweite Operation erhöht die Kosten der Experimente und macht jedes Kaninchen, einen zusätzlichen Satz von operativen Möglichkeiten und Perioperative Komplikationen. Allerdings kennen wir keiner andere gen-Transfer-Ansatz, der dauerhafte Transgene Ausdruck in Vene Transplantate erzielt. Die dritte Einschränkung dieser Methode ist, dass es Know-how im Bau von ADHD Vektoren und Vorbereitung der hohen Titer ADHD Bestände erfordert. Viele Labors haben Erfahrung mit ersten Generation adenoviralen, Lentivirale und Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren, aber relativ wenige Gruppen haben Erfahrung mit ADHD und müssten in der Regel eine Zusammenarbeit um diese Kompetenz zu erhalten. Die klinische Anwendbarkeit der Methode kann ebenfalls eingeschränkt sein. Für den Menschen würde eine zweite Operation Kosten und Komplikationen erhöhen. Darüber hinaus haben im Vergleich zu menschlichen saphenous Adern (verwendet für koronare und periphere Bypass-Operationen), externe halsvenen Kaninchen sehr dünne Wände. Es ist möglich, dass die Wand Verdickung und Umbau, die nach Pfropfen ein Kaninchen äußere Halsschlagader in den arteriellen Kreislauf gedämpft würde auftritt, wenn die Vene Transplantat bereits eine dickere Wand hat. Schließlich entwickelte sich in Experimenten in diesem Modell bis zu 6 Monate dauern, keiner der veredelten Venen eine Stenose22. Daher erscheint diese Methode nicht alle biologischen Prozesse zu modellieren, die dazu beitragen, die Vene Transplantat scheitern.
Abschließend verwendet die Methode ein robustes Tiermodell der menschlichen Gefäßerkrankungen (Kaninchen), um veredelte Venen zu generieren, in denen transgene stabil für längere Zeit (mindestens 6 Monate)22ausgedrückt werden. Stabile Expression von transgenen in Vene Transplantationen wird zeigen, ihre Rolle im normalen Vene Transplantat Homöostase und ihr Potenzial für die Vene Transplantat Gentherapie zu klären. Die Methode könnte verbessert und durch die Entwicklung von Techniken, mit denen perkutane Lieferung von Vektoren, die Vene Graft, wodurch die zweite Operation klinisch anwendbar gemacht werden. Diese Techniken möglicherweise Katheter-basierten36,37, oder sie könnten speziell präparierte Vektoren, die in eine periphere Vene injiziert und dann gezielt an die Vene Transplantat Wand, zum Beispiel durch Magnetfelder38enthalten. Die Methode könnten Testen von Vektoren als ADHD für die Vene Transplantat Gentherapie, einschließlich Lentivirale und AAV-Vektoren sowie nicht-viralen Vektoren. 39 , 40 , 41 , 42
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
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