Summary
Denne metode beskriver placeringen af interposition vene grafts i kaniner, transduktion af podninger, og opnåelsen af holdbare transgen udtryk. Dette giver mulighed for undersøgelse af fysiologiske og patologiske roller af transgener og deres proteinprodukter i podede vener, og afprøvning af genterapier for vene graft sygdom.
Abstract
Vene graft bypass kirurgi er en fælles behandling af okklusiv arteriel sygdom; men succes på lang sigt er begrænset af transplantat svigt på grund af trombose, intima hyperplasi og åreforkalkning. Målet med denne artikel er at vise en metode til at placere bilaterale venøs interposition grafts i en kanin, så transducing podninger med et gen transfer vektor, der opnår holdbare transgen udtryk. Metoden giver mulighed for undersøgelse af gener og deres proteinprodukter biologiske roller i normale vene graft homøostase. Det giver også mulighed for afprøvning af transgener til de aktiviteter, der kunne forhindre vene graft fiasko, f.eks., om et udtryk for en transgen forhindrer neointimal vækst, reducerer vaskulær betændelse eller reducerer åreforkalkning i kaniner fodres med et højt fedtindhold kost. Under en indledende overlevelse kirurgi, er segmenter af højre og venstre eksterne halsfedt skåret ud og placeret bilateralt som tilbageførte ende-til-side fælles halspulsåren interposition podninger. Under en anden overlevelse kirurgi, udført 28 dage senere, hver af podninger er isoleret fra omsætning med vaskulære clips og lumen er fyldt (via en arteriotomy) med en opløsning indeholdende en helper-afhængige adenoviral vektor (HDAd). Efter en 20-minutters inkubation, vektor løsning er indsugning, arteriotomy er repareret og strømmen er genoprettet. Venerne er høstet på tidspunkter dikteret af individuelle eksperimentelle protokoller. Den 28-dages forsinkelse mellem graft placering og transduktion er nødvendigt at sikre tilpasningen af vene graften arteriel bevægelighed. Denne tilpasning undgår hurtige tab af transgenet udtryk, der opstår i vene grafts transduced inden eller umiddelbart efter podning. Metoden er enestående i dens evne til at opnå holdbare, stabile transgen udtryk i podede vener. Sammenlignet med andre store dyr vene graft modeller, har kaniner fordele ved lave omkostninger og let håndtering. I forhold til gnaver vene graft modeller, har kaniner større og lettere at manipulere blodkar, der giver rigelige væv til analyse.
Introduction
Åreforkalkning er en kronisk inflammatorisk sygdom lipid ophobning og betændelse i blodkar væggen medføre forsnævring af fartøjet lumen, hjerteanfald, slagtilfælde og tab af lemmer1,2. Perkutan interventioner (fx., ballonudvidelse og stent) og medicinsk terapi (fx., statiner og antiplatelet agenter) er nyttige behandlinger for åreforkalkning; men de er ofte ineffektive i behandling af svær obstruktiv sygdom både i til koronar og perifere oplag. Bypass podning, ved hjælp af autogen vene segmenter, forbliver en fælles procedure for behandling af patienter med svær, diffuse koronar og perifer karsygdom3,4. Dog vene grafts placeret i begge koronar og perifere oplag har dårlig langsigtet passage satser. I koronar omløb, er omkring 10-20% af vene grafts er tilstoppet på 1 år og 50% tilstoppet af 10 år5,6. I den perifere cirkulation er vene graft fiasko satser 30-50% på 5 år7.
Genterapi er en attraktiv tilgang til forebyggelse af venøs graft fiasko, fordi det kan levere en terapeutisk gen produkt netop i stedet for sygdommen. Derfor har talrige prækliniske undersøgelser testet vene graft gen terapi8,9. Dog har hovedsagelig alle disse undersøgelser undersøgt effekten på tidlig tid point (2-12 uger)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. vi er klar over, ingen beviser for, at genterapi interventioner kan give holdbare (år) beskyttelse mod slutningen vene graft fiasko, der typisk skyldes neointimal hyperplasi og åreforkalkning4. Vi udviklet en metode, der tillader holdbar transgen udtryk i podede vener, og dermed giver mulighed for afprøvning af genterapi interventioner på sene samt tidlige tidspunkt punkter. For at opnå holdbare transgen udtryk, indeholder metoden HDAd vektorer og en forsinket transduktion strategi. HDAd vektorer giver langvarig transgen udtryk, fordi de mangler virale gener, at forebygge den anerkendelse (og afvisning) af transduced celler i immunsystemet18,19,20, 21. forsinket transduktion (udført 28 dage efter graft placering) forhindrer tab af transduced celler under den arterialization proces, der forekommer tidligt efter at pode22.
Andre metoder, at opnår terapeutiske transgen udtryk i vene graft mur stole på transduktion af vene graften på tidspunktet for graft placering10,11,12,15,16 ,17. Da målte seriefremstillede, falder transgen udtryk ved hjælp af denne fremgangsmåde hurtigt efter transduktion22,23. Derfor undersøgt undersøgelser ved hjælp af denne fremgangsmåde ikke effekten ud over 12 uger efter vene podning, med de fleste ikke vurdere effekten ud over 4 uger. I modsætning hertil vores metode opnår vene graft transgen udtryk, der fortsætter stabilt i mindst 24 uger og-baseret på lignende undersøgelser udført i arterierne-sandsynligvis fortsætter langt længere22,24. Vi kender ikke andre vene graft gen musikterapi intervention der opnår stabile transgen udtryk af denne varighed.
Vi brugte en kanin model til at udvikle vores metode. Andre har brugt gnavere, kaniner, eller større dyr at teste vene pode gen terapi10,11,12,15,16,17,25, 26. I forhold til gnavere modeller, kaniner er dyrere og er underlagt strengere lovkrav. Men i forhold til større dyr (fx., svin og hunde), kaniner er langt billigere at købe og hus og meget nemmere at håndtere. Derudover kanin fartøjer ligne menneskelige fartøjer fysiologisk27, de er tilstrækkeligt store, at de kan bruges til at teste perkutan interventioner28,29, og de giver tilstrækkeligt væv, flere slutpunkter (fx., histologi, proteiner, RNA) kan undersøges ved hjælp af en enkelt blodkar modellen22,30. Derudover når kaniner med vene grafts fodres med et højt fedtindhold kost, udvikler de vene graft åreforkalkning31,32, hvilket er en almindelig årsag til koronararterie bypass vene graft svigt4,5 . Disse aterosklerotisk kanin vene grafts kan tjene som et substrat for afprøvning genterapi interventioner leveret med denne metode. Den angivne protokol kan hjælpe efterforskere at mestre de tekniske færdigheder kræves for at opnå holdbare transgen udtryk i kanin vene podninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller og undersøgelser blev godkendt ved University of Washington Office for Animal Welfare.
1. før operation (for alle operationer)
- Bedøver kanin med 30 mg/kg ketamin og 1,5 mg/kg xylazin ved intramuskulær injektion (IM) i paraspinous muskler.
Bemærk: Mad og vand er ikke begrænset før operationen. - Mens vi venter tilstrækkelig dybde af anæstesi, oprette tabeller i forberedelseslokalet og operationsstuen (OR).
- Forberede forberedelseslokalet for barbering kanins hals og placeringen af intravenøs (IV) havnen i øret (overlevelse kirurgi kun). Placer oftalmologiske salve, fentanyl plaster (overlevelse kirurgi), hårklippemaskiner, prep alkoholserviet, 24-G x ¾" kateter, injektion port og kirurgisk tape på tabellen forberedelse.
- I OR, oprette overvågning udstyr og tilhørende sonder (elektrokardiogram (EKG), pulsoximetri (SpO2) og temperatur). Forberede IV pumpen med en 100 mL saltvand IV taske med en 18-G eller 19-G kanyle og sæt strømningshastigheden som 10 mL/h/kg (overlevelse kirurgi kun). Opsætning af ilt og isofluran udstyret med en nosecone (vene podning eller høst operationer).
- For at hjælpe med at sikre nosecone til kanin, loop en gaze stribe rundt om røret, der leverer gas til nosecone. Denne løkke skal omgiver røret hvor det tillægger nosecone. De frie ender af gaze strip bør både være ca. 45 cm lang. Placer nosecone (med vedlagte gaze) på hovedet ende af bordet.
- Tænd den cirkulerende vand og/eller tvunget luft opvarmning tæppe på tabellen OR. På opvarmning tæppe, placere en sammenrullet håndklæde som en nakkestøtte og placere Elektrokauterisation dispersive elektrode plade.
- Som en lokal analgetikum, kombinere i en sprøjte 1 mL 2% lidocain HCl og 1 mL 0,5% bupivacaine HCl. fortyndet virus til den ønskede koncentration (her bruger 2 x 1011 virale partikler/mL for HDAd) i sterile DMEM og holde på is (gen overførsel kirurgi kun).
- Efter en passende bedøvelsesmiddel dybde nås, forberede kirurgi kanin.
NOTE: Test for manglen på en pedal tilbagetrækning refleks at sikre passende bedøvelsesmiddel dybde. Fortsætte med at overvåge den pedal refleks i hele operationen.- Anvende oftalmologiske salve til kanins øjne.
- For at give mulighed for placering af en rektal temperatur sonde, trykke med behandskede fingre lige over endetarmen og flytte fingrene mod anus til at fjerne stooling fra den kanin endetarmen.
- Barbere kanin fra brystbenet hak på kant af mandiblen. Barbere ene øre for IV placering og det modsatte øre for fentanyl plaster administration (overlevelse kirurgi kun). Barbere de venstre bageste midterste tæer til placering af SpO2 sonde.
- Vektor infusion kirurgi, intubate kanin. Bruge en 4 mm O.D./3 mm I.D. uncuffed endotrakealtube, gevind over en artroskop. Placer kanin i brystbenet recumbency og hyper-udvide halsen. Hold den kanin munden helt åben og bruge artroskop at visualisere glottis og larynx folderne. Under inspiration, Isæt forsigtigt endotrakealtube gennem strubehovedet og luftrøret.
- For overlevelse operationer, sted og sikre en 24-G IV kateter i rabbit's venstre øre vene og lægge loft over det med en injektion port. Anvende et 25 µg/h fentanyl plaster på kanins højre øre.
Bemærk: Protokollen er for en kirurg placeret på kanins højre side. Hvis kirurgen vil være på den kanin venstre side, vende sider i dette skridt til at holde ledninger og IV overfor af kirurgen. Skifte sider i fremtidige skridt efter behov. - For venen administrere podning og høst operationer, generel anæstesi med en nosecone; vektor infusion kirurgi, administrere narkose via en endotrakealtube.
Bemærk: Intubation kan bruges til alle operationer. Vores erfaring, kan risikoen for komplikationer fra luftrør og larynx traumer under intubation opvejer fordelene ved intubation. Den operation, der omfatter overførsel af gener til en transplantat (især i kolesterol-fed kaniner) er den eneste kirurgi i hvilke intubation synes at give en nettofordel. - Bære kaninen i regionerne. Placer kanin i en liggende stilling på operationsbordet med hals støtte håndklæde placeret lige under den kanin hoved. Forsigtigt udvide kanins hals, indtil det er glat og omtrent vandret.
- Placer nosecone til kanin (vene podning og høst kirurgi) eller forbinde endotrakealtube (vektor infusion kirurgi) med O2 på 1 L/min, og starte isofluran. Hvis du bruger et nosecone, sikre det af indpakning enderne af vedlagte gaze strimler omkring den kanin hals støtte håndklæde. Justere isofluran koncentration efter behov (typisk 1-2%) til at opretholde en kirurgisk anæstesi.
- Center Elektrokauterisation dispersive elektrode plade under den kanin tilbage. Indsæt rektal temperatur sonde og anvende SpO2 sonde og EKG fører til kaninen.
- Tilslut IV saltvandsslangen til kateter-porten i rabbit's venstre øre og starte IV infusion pumpe på 10 mL/h/kg. Efter 1 time, reducere saltvand infusion sats til 5 mL/h/kg.
- Løst binde den kanin forbenene til operationsbordet som en tilbageholdenhed.
Bemærk: Hvis det ønskes, en lille plast bord kan placeres over kanin at forhindre kirurgen at trykke på den kanin brystet/maven, og potentielt forårsager Gastroøsofageal refluks og aspiration. - Injicere lidocain/bupivacaine (2 mL, 50/50 mix, trin 1.2.4) subkutant (SQ) i nakken langs linjen planlagte indsnit for lokalbedøvelse.
- Har assistenten desinficere de kirurgiske site med 3 skiftevis scrubs af klorhexidin gluconat og isopropanol, så spray webstedet med povidon-jod. Har kirurgen krat, kjole og handske, efter aseptiske principper.
- Udføre overlevelse operationer under aseptiske forhold. Har assistent håndtere enhver ikke-sterile varer, og aseptisk videregive sterile materialer til kirurgen eller aseptisk placere dem på tabellen draperet instrument.
- Har kirurgen brug sterile håndklæder til aseptisk manipulere ikke-sterilt udstyr såsom mikroskop. Har kirurgen bære 2 x kirurgisk loupes mens de udfører den første halvdel af kirurgi.
2. vene knogletransplantation kirurgi (overlevelse)
- Forberede de instrumenter og sterilt felt.
- Har assistent åbne steril packs (en tabel drapere, et papir drapere og 6 håndklæder) og aseptisk overføre indholdet til kirurgen.
- Drapere tabellen instrument. Placer papir drapere og sterile håndklæder på draperet instrument bordet. Med 4 håndklæder, drapere kanin, forlader kun operationsstedet på halsen udsat. Lægge papir drapere over kanin. Et håndklæde skal bruges senere, og den sidste er en sikkerhedskopi.
- Har assistent åbne steriliseret instrument pakke og aseptisk pass instrument bakke til kirurgen. Arrangere instrumenter på instrument bordet.
- Har assistent åbne følgende udstyr og aseptisk videregive det til kirurgen eller placere den på instrument bordet: en 1 mL sprøjte, en 3-mL sprøjte, en 20-mL sprøjte, en 21 G kanyle, 3-0 polyglycolic syre (PGA) sutur, 5-0 PGA sutur , 7-0 polypropylen sutur, og en 24 G IV kateter.
- Sikre Elektrokauterisation kabel at drapere dækker kanin, ved hjælp af en 7.25" Kantrowitz pincet. Drop sæt den enden af kablet over kanten på operationsbordet til elektrokirurgiske enhed er tilsluttet og tændt af assistenten.
- Fylde en 20-mL sprøjte med sterilt saltvand fra en saltvand taske eller hætteglas afholdt af assistenten. Brug denne saltvand efter behov for at forhindre dehydrering af eksponeret væv under operationen.
- Forbered 5 mL af heparinized fysiologisk saltvand løsning ved at tilføje 0,1 mL af 5.000 IE/mL heparin til 5 mL af saltopløsning, dvs., 100 IE heparin/mL, i en lille kirurgisk skål. Brug denne løsning til at skylle carotis arterie og vene graften regelmæssigt under den podning procedure.
- Skær et hul i papiret drapere over operationsstedet på kanins hals. Brug håndklæde klemmer til at klemme i hjørnerne af hullet i sted til de underliggende håndklæder.
- Vaskulære dissektion
Bemærk: Brug 2 x kirurgisk loupes for at hjælpe med denne del af operationen.- Skære huden med Elektrokauterisation langs midterlinjen mellem brystbenet hakket og underkæben (ca 7-9 cm i længden) og klemme den kanin halsskind til håndklæder med håndklæde klemmer. Gøre en kort laterale skåret igennem fascia med Elektrokauterisation enden halefinne. Ligeud dissekere under fascia langs hele midterlinjen ved hjælp af store saks. Skære igennem det dissekerede fascial lag langs midterlinjen med Elektrokauterisation.
- Starte på højre side. Dissekere mellem sternohyoid muskler overliggende luftrøret og V-formet sternocephalic-musklen til at udsætte den fælles halspulsåren.
- Omhyggeligt dissekere en 4-5 cm segment af den fælles halspulsåren og dens større grene (typisk 1-2 per side) gratis fra omkringliggende væv. Udvide dissektion fra bunden af halsen proksimalt til passage af svælg nerve distalt. Brug kirurgisk silicium sløjfer til støtte i retraktion af halspulsåren under dissektion. Ligate de større grene af den fælles halspulsåren med 5-0 silke suturer før skære hver gren distalt.
Bemærk: Pas på ikke at forstyrre den vagus nerve, der løber parallelt med den fælles halspulsåren, eller mindre nerver, der krydser over arterien. - Gentag dissektion i venstre side (trin 2.2.3).
- Bruge væv-bedrift pincet midlertidigt lukke det subkutane væv lag. Dissekere den overfladiske fascie fra huden på højre side, indtil den eksterne halsfedt er eksponeret. Dissekere en 4-5 cm segment af eksterne halsfedt og gratis sine grene fra det omgivende væv, ligating små grene med 5-0 silke suturer før opskæring grenen.
- Gentag dissektion i venstre side (trin 2.2.5).
- Injicere heparin (150 IU/kg) i IV kateter og skyl med 10 mL saltvand.
- Måle en 3-cm segment af eksterne halsfedt på højre side og ligate den caudale ende af segmentet med 5-0 silke sutur. Tillad vene til at fylde med blod, så ligate kraniel slutningen af vene-segmentet. Opdele kraniel slutningen af eksterne halsfedt segment, omhyggeligt flush fartøj med heparinized normal saltvand (100 U/mL) ved hjælp af en 3-mL sprøjte knyttet til en 24-G IV-kateter. Opdele vene segment på sin caudale afslutning. Sted vene segment i en standardiseret position, hvor de caudale og kranie ender er utvetydigt identificerbare.
- Vene podning
- Lad assistent fjerne de kirurgiske loupes fra kirurgen og flytte den kirurgisk mikroskop (25 X) i position.
Bemærk: Kirurgen bør drapere en steril håndklæde over mikroskop. Dette gør det muligt for kirurgen at manipulere mikroskopet samtidig opretholde sterilitet. - Klemme den højre fælles halspulsåren på hver ende af den isoleret segment med mini-klemmer, placere den kranielle klemme først at tillade arterie påfyldning og derefter placere den caudale klemme.
- Klip en 1 × 2 cm stykke stiv papir (tilgængelig fra sterile sutur emballage), og Placer den under den fælles halspulsåren at forbedre eksponering.
- Udføre en arteriotomy bare kranie til den caudale clamp (den caudale arteriotomy). Arteriotomy længde skal være lig med diameter på kraniel slutningen af vene segment. Indsæt sprøjte med IV kateteret gennem den caudale arteriotomy og skyl halspulsåren lumen med heparinized normal saltvand.
- Sutur kraniel slutningen af vene til den caudale arteriotomy, ved hjælp af 7-0 polypropylen sutur med enkelt sting (figur 1).
- Placer den første søm for at sutur caudale slutningen af den caudale arteriotomy til kranie slutningen af vene-segmentet. Placer den anden stitch 180° fra den første søm, at sutur kraniel slutningen af den caudale arteriotomy til kranie slutningen af vene-segmentet.
- Sted den tredje søm i et punkt lige langt fra de første to sting på den laterale side af anastomose. Sted den fjerde søm på den mediale side af anastomose, lige langt fra de første to masker og overfor det tredje søm. Sted 4 ekstra masker (masker 5-8) mellem de enkelte sting 1-4.
- Udføre den craniale arteriotomy på den caudale side af kraniel klippet. Afstanden mellem kraniel slutningen af den craniale arteriotomy og de caudale slutningen af den caudale arteriotomy bør være det samme som længden af vene-segmentet. Længden af de craniale arteriotomy er lig med diameter af den caudale slutningen af vene-segmentet.
- Udvide venen cranially fra anastomose, lægge det på toppen af carotis, uden at indføre enhver drejninger. Skylle den carotis arterie og vene med heparinized normal saltvand via den craniale arteriotomy. Saltvand vil strømme gennem arterie, ind i venen via den caudale anastomose og afsluttes fra gratis og unsutured slutningen af venen. Flushing venen også forhindrer den i at vride.
- Sutur caudale slutningen af vene til den kranielle arteriotomy (figur 1).
- Placer en første søm for at sutur caudale slutningen af den craniale arteriotomy til caudale slutningen af vene-segmentet. Placer en anden søm for at sutur kraniel slutningen af den craniale arteriotomy til caudale slutningen af vene-segmentet. Komplet anastomose, som beskrevet i trin 2.3.5.2. Lige før den sidste knude er bundet på den kranielle anastomose, kort åbne klemme på den craniale ende af den dissekeret fælles halspulsåren segment, at back-blødning, der skyller ud i luften i halspulsåren og podede vene. Spænd den sidste knude.
- Frigive kraniel klemmen for at tillade vene graft fylder med blod og derefter slippe den caudale klemme. Livlig svingningerne bør ses i vene graft. Anvende blide tryk med tør gaze til at standse eventuelle blødninger ved anastomoser.
- Ligate begge ender af den fælles halspulsåren segment, der forbinder anastomoser med en 3-0 silke sutur og opdele carotis halvvejs mellem ligaturer (figur 1). Gælde den støder op til hver anastomose halspulsåren flere dråber af papaverin (3,5 mg/mL).
- Tilføre øre IV kateteret heparin (75 IU/kg) og skyl med 10 mL saltvand. På dette tidspunkt, skal du injicere buprenorphin (SQ, 0,02 mg/kg) for at give postoperative analgesi indtil fentanyl plaster har givet smertestillende plasmaniveauer af fentanyl.
Bemærk: En ekstra buprenorphin injektion (SQ, 0,02 mg/kg) kan være nødvendigt 6 h efter den første injektion til at opretholde analgesi indtil plasma fentanyl når en terapeutisk koncentration. - Gentag podning i venstre side (trin 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Luk det subkutane væv med 5-0 PGA sutur ved hjælp af en kontinuerlig mønster. Lukke huden med 3-0 PGA sutur ved hjælp af en intradermal mønster. Begrave knuder i begge ender.
- Lad assistent fjerne de kirurgiske loupes fra kirurgen og flytte den kirurgisk mikroskop (25 X) i position.
- Postoperativ nyttiggørelse, oprydning og pleje
Bemærk: Tillad kanin hen til genoprette fra anæstesi i en rolig, rolig miljø. Overvåge kanin uafbrudt i ordentlig iltning og krop temperatur, indtil det er fuldt tilbagebetalt.- Slukke for isofluran og ilt og afbryde anæstesi maskine fra kanin. Afbryde IV væske slangen fra kanin, men forlade IV havn i øret vene for emergent adgang.
- Transportere kanin til et opsving buret og placere den på sin side. Termisk støtte med et varmt vand tæppe (eller tvunget luft opvarmning). Give O2 af nosecone, indtil SpO2 er stabil.
- Indtil kaninen kan sidde op og gå i sit bur, flip kanin til sin anden side hver 15 min. Derefter fjerne øre IV kanyle og vende tilbage kaninen til sit bur. Vende tilbage kaninen til selskab med andre dyr, kun når det er fuldt tilbagebetalt af anæstesi.
- Bortskaffe enhver affald følgende relevante protokoller for biologisk og klid bortskaffelse af affald.
- Efter operationen, tjekke kaninen sundhed og kirurgiske sår hver dag. Administrere buprenorphin som har brug for smerte ikke administreres af fentanyl plaster. Fjerne fentanyl plaster på postoperative dag 3.
3. transkutan ultralyd
- For at vurdere graft passage, udføre ultralydsscanning eksamen på ikke-bedøvede kanin 5-7 dage efter vene-graft operation og genoverførsel kirurgi.
- Pak ikke bedøvede kanin sikkert i et tæppe og Placer kanin liggende i en veterinær V-trough med halsen udvidede. Barbere halsen, eller hvis det er nødvendigt, fjerne hår med en depilatory agent. Anvende ultralyd gel til halsen og udføre en ultralydsscanning eksamen.
Bemærk: En ultralydsscanning eksamen er også udført på bedøvede kaniner på tidspunktet for både gen overførsel kirurgi og terminal graft høst kirurgi at undersøge graft passage og måle graft lumen diameter. Eksamen foregår lige før hals skrubbe og udføres på samme måde som for de ikke-bedøvede kaniner.
- Pak ikke bedøvede kanin sikkert i et tæppe og Placer kanin liggende i en veterinær V-trough med halsen udvidede. Barbere halsen, eller hvis det er nødvendigt, fjerne hår med en depilatory agent. Anvende ultralyd gel til halsen og udføre en ultralydsscanning eksamen.
4. genoverførsel kirurgi udføres ~ 28 dage efter Graft placering (overlevelse kirurgi)
- Forberede instrumenterne og det sterile felt.
- Følg trin 2.1.1-2.1.3. i vene graft operation.
- Lad assistenten åbne følgende udstyr og enten aseptisk videregive det til kirurgen eller placere den på instrument bordet: seks 1 mL sprøjter (med nål), en 3-mL sprøjte, en 20-mL sprøjte, en 21 G kanyle, en 19-G kanyle, 3-0 PGA sutur , 5-0 PGA sutur, 7-0 polypropylen sutur, to 24 G IV katetre og en steril blod flow sonde.
- Følg trin 2.1.5-2.1.6. i vene graft operation.
- Forberede en 1-mL sprøjte med 1 mL DMEM til vask arterie og vene graften og forberede to 1-mL-sprøjter med virus løsning (~ 0,5-0,7 mL virus løsning/vene graft). Lad assistent tø virus og fortynde det i DMEM. Forberede en 3-mL sprøjte med 0,5 mL lidokain/bupivacaine (50/50 mix, trin 1.2.4).
- Følg trin 2.1.8 i vene graft operation.
- Isolering af vene grafts og tilstødende halspulsårer
Bemærk: 2 x kirurgisk loupes skal bruges til denne del.- Skære huden med Elektrokauterisation langs midterlinjen mellem brystbenet hakket og underkæben (ca 7-9 cm i længden) og klemme huden open med håndklæde klemmer. Anvende 0,5 mL lidokain/bupivacaine (50/50 mix, trin 1.2.4) til det subkutane væv.
- Gøre en kort laterale skåret igennem fascia med Elektrokauterisation enden halefinne. Ligeud dissekere under fascia langs hele midterlinjen. Med Elektrokauterisation, skære igennem den dissekeret fascia langs midterlinjen.
- Starte på højre side. Dissekere mellem sternohyoid muskler overliggende luftrøret og V-formet sternocephalic-musklen til at udsætte vene graft. Omhyggeligt isolere vene graft og 1,5-2,0 cm af arteria carotis støder op til graft på både kraniel og caudale side.
- Gentag dissektion i venstre side efter trin 4.2.3.
- Måling af strømmen af blod i venen podninger.
- Fylde den kirurgiske sår hulrum i højre side med normal saltvand hen til muliggøre overførslen af lydbølger. Fordybe en 2-mm perivascular flow sonde (tilsluttet en volumen-flow meter) i saltvand i såret hulrum og angive strømningshastigheden til nul.
- Placere flow sonden omkring halspulsåren caudale eller kranie til vene graft. Postdataene fra strømmen sonde med et elektronisk dataoptegningssystem.
- Gentag flowmåling på venstre side efter trin 4.3.2.
- Beregn Pulsatilitetsindeks baseret på peak systolisk strømningshastighed, minimum diastolisk strømningshastighed og gennemsnitlige strømningshastighed. Også beregne laminar shear stress, baseret på strømningshastigheden og lumen diameter (målt med transkutan ultralyd).
- Indgyde vektor løsning i vene grafts
Bemærk: En kirurgisk mikroskop (16 X) bruges som nødvendige for punktering, infusion og reparation af halspulsåren.- Har assistent fjerne kirurgens kirurgisk loupes og flytte den kirurgisk mikroskop i position. Har kirurgen drapere en steril håndklæde over mikroskop. Den sterile håndklæde tillader kirurgen at manipulere mikroskopet samtidig opretholde sterilitet.
- Har assistenten injicere heparin (150 IU/kg) i IV kateter og skylle med saltvand.
- Brug en stor nål driver til at bøje 21 G kanyle til ca 80° lige over facet (ikke bøje facet; Figur 2A).
- Klemme den fælles halspulsåren på hver ende af vene transplantat med mini-klemmer, placere den kranielle klemme først at tillade arterie påfyldning og derefter placere den caudale klip. Sted den caudale klip ca 10 mm caudale til anastomose, til at forlade nogle plads til arteriotomy.
- Sætte to silke bånd omkring arterie bare caudale til graften og binde en enkelt overhånd knude på hver - uden at stramme disse.
- Punktere carotis caudale til graften med bøjet 21 G nålen bare kranie af den caudale vaskulære klip. Pas på at ikke punktere de tilbage eller side vægge. Rykke nålen ind i lumen og tilbage to gange for at sikre, at lumen er klar, og derefter forsigtigt trække nålen.
Noter: Fælles carotis punktering kan blive hjulpet af grådige arteriel adventitia med fine pincet og forsigtigt løfte den forreste væg samtidigt med at indlagde spidsen af nålen kun caudale til lift punkt (figur 2A). Dette reducerer risikoen for at ramme bagvæggen med nålen. - Med flere udfoldet gaze puder, oprette en rede for at placere sprøjten bruges til infusioner. Sted gaze reden caudale til operationsstedet.
- Sæt en 24 G IV-kateter på sprøjten med DMEM-only og stram kateter på sprøjten lige nok til at forhindre udsivning (sprøjten vil fjernes senere i denne operation) og bøje kateteret ~ 4 mm fra spidsen, bøje holdes på omkring 75°, efter det er frigivet.
- Indsæt IV kateter i den fælles carotis arteriotomy indtil punktet, bøje og vaske vene graft lumen to gange med 0,5 mL af DMEM. For hver gentagelse, skal du udfylde vene transplantat med DMEM. Fjern derefter DMEM fra graften ved let at trykke med en behandsket finger i kraniel slutningen af graften. Skub forsigtigt finger mod den caudale del af transplantat at skylle de luminale indhold via arteriotomy.
- Fjerne DMEM sprøjte fra kateteret, forlader kateteret i fartøjet. Tilslut sprøjte indeholdende virus løsning, og sørg for, at ingen luft ind kateteret. Flytte den løst knyttede silke bånd ned arterie, indtil de er omkring kateteret tip, men ikke stramme dem.
- Indgyde 0,03 mL af virus løsning til at skubbe de resterende DMEM ud af kateteret. Fjerne alle væske fra vene graft lumen med en finger, at trykke forsigtigt fra kranie til caudale.
- Spænd de to bånd omkring den arterie og kateter tip til at forsegle lumen. Indgyde virus løsningen indtil venen er udspilet. Forsigtigt lægge sprøjten på reden gaze.
Bemærk: Det er afgørende at vene graft udvider til sin pre transduktion kaliber og forbliver oppustede under virus infusion. Hvis ikke, mængden af genoverførsel vil blive betydeligt formindsket. - Forlade den virus-holdige løsning i vene graft lumen i 20 min., og derefter erstatte virus-holdige sprøjten knyttet til kateteret med en tomme sprøjte. Forsigtigt Opsug den virus-holdige løsning fra graften indtil fartøjet kollapser. Fjern sprøjten, forlader kateteret på plads. Skære og løsne de silke suturer og trække kateteret fra fartøjet. Fjerne kateteret fra halspulsåren omhyggeligt for at undgå at beskadige endotelet.
- Med hjælp af kirurgisk mikroskop, skal du lukke arteriotomy med 7-0 polypropylen sutur ved hjælp af en X-mønster (figur 2B).
- Forstå sutur med en nål-indehaveren, opfoere fartoejet nederst til højre i arteriotomy og afslutte fartøj nederst til venstre. Cross åbningen uden for fartøjet og gøre det andet gennemløb fra øverste højre til øverste venstre.
- Før stramning sutur, frigive kort kranie vaskulære klippet for at skylle luft og resterende virus fra vene graft og arterie. Blodet vil flyde ud af arteriotomy når klemmen er frigivet.
- Tæt arteriotomy af forsigtigt trække sutur slutter og binde dem sammen med 2 pladsen knob.
Bemærk: Trække sutur for stram vil forårsage bunching af væv, som vil forstyrre strømmen, øge risikoen for blodpropper og potentielt indføre ukontrolleret variabler.
- Frigive kraniel vaskulære klippet, så den caudale klip. Standse eventuelle blødninger ved hjælp af gaze til at anvende let tryk.
- Omkring dette tidspunkt, injicere buprenorphin (SQ, 0,02 mg/kg) for at give postoperative analgesi indtil fentanyl plaster har givet smertestillende fentanyl plasmaniveauer.
Bemærk: En ekstra buprenorphin injektion (SQ, 0,02 mg/kg) kan være nødvendigt 6 h efter den første injektion til at opretholde analgesi indtil plasma fentanyl når en terapeutisk koncentration. - Gentag virus infusion protokol i venstre side, følgende trin 4.4.5-4.4.15.
- Såret lukning
- Luk det subkutane væv med 5-0 PGA sutur, ved hjælp af en kontinuerlig mønster. Lukke huden med 3-0 PGA sutur ved hjælp af en intradermal mønster. Begrave knuder i begge ender.
- Postoperativ nyttiggørelse, oprydning og pleje
- Følg trin 2.4.
5. høst kirurgi (Terminal)
- Forberede instrumenterne og operationsstedet.
- Følg trin 2.1.1-2.1.3 i vene graft operation.
- Lad assistent åbne og aseptisk sted på instrument bordet (eller videregive til kirurgen): en 20-mL sprøjte, en 21G kanyle, 3-0 silke sutur og en steril blod flow sonde.
- Følg trin 2.1.5-2.1.6 og 2.1.8 vene graft operation.
- Isolering af fælles halspulsårer og vene grafts
- Skære huden med Elektrokauterisation langs midterlinjen mellem brystbenet hakket og underkæben (ca 7-9 cm i længden) og klemme den kanin halsskind til håndklæder med håndklæde klemmer.
- Gøre en kort laterale skåret igennem fascia med Elektrokauterisation enden halefinne. Ligeud dissekere under fascia langs hele midterlinjen. Skære igennem den dissekeret fascia langs midterlinjen med Elektrokauterisation.
- Starte på højre side. Dissekere mellem sternohyoid muskler overliggende luftrøret og de V-formede sternocephalic muskler til at udsætte den fælles carotis og vene graft.
- Dissekere den rigtige vene graft og fælles halspulsåren gratis fra det omgivende væv. Bruge kirurgisk silicium sløjfer til retraktion af arterie og vene transplantat under dissektion.
- Gentag dissektion i venstre side efter trin 5.2.3-5.2.4.
- Gøre flow målinger efter trin 4.3.1-4.3.3 i gen overførsel kirurgi.
- Høst af vene grafts
- Med 3-0 silke sutur, ligate højre fælles halspulsåren kranie til transplantatet. Derefter ligate carotis caudale til transplantatet.
- Punktafgifter rigtige vene graft ved at dividere den tilstødende halspulsåren mellem hver af ligations og de tilstødende anastomose. Fjern vene graft fra kanin og skylle lumen med saltvand.
- Trim halspulsåren og anastomoser fra begge ender af vene graften. Trimme væk overskydende adventitial væv fra vene graften og skær graften i segmenter efter behov til forskellige slutpunkt analyser.
- Høste venstre vene graft ved at gentage trin 5.4.1-5.4.3.
- Indsprøjte 1 mL af phenytoin/pentobarbital IV at aflive kaninen.
- Bortskaffe enhver affald følgende relevante protokoller for biologisk og klid bortskaffelse af affald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tekniske beherskelse af en ny operatør skal valideres, inden driftslederen kan bruge denne metode til at generere eksperimentelle data. Den første milepæl, som en ny operatør skal opnå er konsekvent vene graft passage efter at både det oprindelige vene-podning kirurgi og den efterfølgende forsinket transduktion kirurgi. Over 90% passage efter hver af operationer er ønskeligt og opnåeligt. Passage kan vurderes ikke-invasivt ved hjælp af transkutan ultralyd, som vi udfører typisk på postoperative dag 5-7. I kaniner med patent vener, vil ultralyd eksamen afsløre en store blodkar med livlig caudale til kranie blod flyde på begge sider af den forreste nakken (fig. 3A). Hvis enten af vene grafts er tilstoppet, bliver der ingen påviselige caudale til kranie blodgennemstrømning på kørebanen med occluded graften. Kranie til caudale blodgennemstrømning vil dog stadig registreres i det indre halsfedt (fig. 3B).
Den anden milepæl, som en ny operatør skal opnå er effektiv transduktion af vene-graft endotelceller. Her, bruges en adenoviral vektor, der udtrykker β-galactosidase til at vurdere effektiviteten i endothelial genoverførsel. En ny operatør i vores lab transduced vene podninger med en adenovirus udtrykker β-galactosidase (AdnLacZ) ved hjælp af de beskrevne metoder. Graftene var fældet 3 dage efter transduktion og skæres i segmenter. Nogle segmenter var farves med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). Da ansigt imaging om de luminale overflader viste vene podninger med effektiv transduktion (figur 4A) og fattige transduktion (fig. 4B). Hvis du vil yderligere vurdere præstationsprøvninger af en ny operatør, måles β-galactosidase mRNA i ekstrakter af transduced vene graft også ved hjælp af kvantitative reverse transkriptase-medieret PCR og normalisere signal til niveauet af glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA måles i de samme vene podninger.
Niveauer af β-galactosidase mRNA i vene grafts transduced af den nye driftsherre var ikke signifikant forskellig fra niveauer af β-galactosidase mRNA i vene grafts transduced af en erfaren operatør (figur 5). Hvis mRNA prøver fra vene grafts transduced af en erfaren operatør ikke er tilgængelige for sammenligning, podninger negativ kontrol vene graft mRNA kan frembringes af transducing vene med en ikke-udtrykker kontrol vektor (AdNull). Vi har konstateret, at de gennemsnitlige niveauer af β-galactosidase mRNA i vene grafts transduced af en erfaren operatør er ca 1.000-fold højere end baggrunden PCR signal for β-galactosidase mRNA målt i AdNull-transduced grafts (figur 5) .
Figur 1 . Placeringen af en vendt lige eksterne halsfedt mod højre fælles halspulsåren transplantat med ende-til-side anastomoser. Vene transplantat (blå) er syet til den fælles halspulsåren (røde) på to anastomoser. På hver anastomose, Sting (hvid X'er) er nummereret i den rækkefølge, hvori de er anbragt. For begge anastomoser, sy 1 suturer caudale slutningen af arteriotomy til den eksterne halsfedt. Sy 2 suturer kraniel slutningen af arteriotomy til den eksterne halsfedt. Stitch 3 er placeret på den laterale side af anastomose på et tidspunkt lige langt fra de første to masker. Stitch 4 er placeret på den mediale side af anastomose, lige langt fra de første to masker og overfor stitch 3. Fire ekstra masker (masker 5-8) er placeret midt mellem de fire eksisterende Sting. Halspulsåren Linjestykke mellem anastomoser er forbundet i begge ender med 3-0 silke suturer (pile) og opdelt (stiplet linje) halvvejs mellem ligaturer. Venstre-sidet grafts udføres i en lignende måde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Oprettelse og lukning af en carotis arteriotomy. (A) den fælles halspulsåren adventitia er forstået nær vene transplantat med fine pincet og opadrettet trækkraft er anvendt på arterievæggen. Dette skaber en lodret overflade, så det bøjet 21 G nål indsættes omtrent parallelt til fartøj lumen, mindske risikoen for punktering bagvæggen af arterie. (B) arteriotomy er syet ved hjælp af 7-0 polypropylen i en X-mønster. Den første sutur pass træder arterie lumen på nederste højre hjørne af arteriotomy (side 1) og afslutter lumen nederst til venstre (side 2). Sutur derefter krydser arteriotomy. Den næste pass igen træder lumen øverst til højre (side 3), og udgange lumen øverst til venstre (side 4). Blide trækkraft på enderne af sutur (enderne exit fra side 1 og side 4) lukker arteriotomy. Sutur enderne er bundet med 2 pladsen knob. Solid blå cirkler angiver de steder, hvor suturen trænger arterievæggen. De blå streger viser hvor sutur passerer uden for arterievæggen; stiplede blå linjer angiver, at sutur er placeret inde i lumen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Transkutan ultralyd billeder af kanin halse, evaluere vene graft passage 5-7 dage efter podning. (A) Patent vene transplantat (rød) med blodgennemstrømningen i caudale til kraniel retning er angivet (pil). (B) Occluded vene graft. Ingen caudale til kranie blodgennemstrømning (som synes røde) er registreret. Den interne halsfedt (blå) med blodgennemstrømningen i kraniel til caudale retning er angivet (stjerne). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Beta-galactosidase transgen udtryk i vene grafts. 28 dage efter podning, blev kanin vene grafts transduced af en 20-min inkubation af adenoviral vektorer udtrykker β-galactosidase i lumen af kirurgisk isolerede vene grafts. Vene grafts var fældet 3 dage efter transduktion og farves med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) da ansigtet billedet af en vene segment viser effektiv transduktion luminale flade. (B) da ansigtet billedet af en vene segment viser dårlig transduktion luminale flade. Skalalinjen = 1,0 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Udtryk for beta-galactosidase (β-gal) transgen mRNA i vene graft segmenter. 28 dage efter placeringen af halsfedt interposition grafts i kanin carotiderne, var podninger transduced med en adenoviral vektor udtrykker beta-galactosidase (AdnLacZ) eller med en kontrol adenoviral vektor, der ikke udtrykker en transgen (AdNull ). Operationer blev udført af enten en erfaren operatør (kirurg 1) eller en ny operatør (kirurg 2). Vene grafter transduced med AdnLacZ blev alle høstede 3 dage efter transduktion. RNA ekstraheret fra grafter transduced med AdNull og høstet 14 dage efter transduktion blev også analyseret, som en negativ kontrol. Udtryk for beta-galactosidase mRNA blev kvantificeres ved kvantitative reverse transkriptase-medieret PCR, med værdier normaliseret til glyceraldehyd fosfat dehydrogenase mRNA måles i de samme ekstrakter, og udtrykt som arbitrære enheder (AU). Angiver middelværdier; p værdier er fra rang-summen tests. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i denne protokol omfatter forvaltningen af anæstesi, antikoagulation, kirurgisk manipulation af arterie/podet venen og hæmodynamiske målinger af de podede vene. Korrekt håndtering af anæstesi er kritisk i dette flere overlevelse kirurgi model, der indeholder to relativt lange operationer (typisk 3-3,5 h for bilaterale vene podning og 1,5-2,5 h for bilaterale graft transduktion). Vi har administreret anæstesi både via en nosecone og af endotracheal intubation og fandt, at intubation forbedret overlevelse efter graft transduktion kirurgi, muligvis fordi overtryk ventilation forhindrer atelektase og forbundet respirationssvigt. Kaniner udfordrende for at intubate, og intubation-relaterede luftvejene traumer kan forårsage postoperativ stridor. Udfordringer og komplikationer af intubation er dog en lille pris at betale for at fjerne de fleste af den perioperative sygelighed og dødelighed forbundet med vene podning kirurgi.
Antikoagulation er afgørende for at forhindre blodpropper podede vener, der kan opstå efter enten af overlevelse operationer. Trombose synes at være en tidlig postoperative begivenhed, fordi de vene grafts, der er patent på transkutan ultralydsundersøgelse 5-7 dage efter operationen er næsten altid patent på høst. At forhindre trombose efter den første operation (dvs., vene podning), IV heparin administreres inden høsten de første eksterne halsfedt. Baseret på plasma halveringstiden af heparin i kaniner (1-2 h), administreres en ekstra halv dosis af IV heparin inden høsten de kontralaterale eksterne halsfedt. Derudover indtil begge arteriovenøse anastomoser af en individuel vene graft er komplet, skylle vi lumen af carotis arterie og vene graft ca. hvert 8 min. med heparinized normal saltvand. For at undgå graft trombose, der bør udvises forsigtighed ikke at beskadige vene graft-især endotel-under høst og podning. Dette omfatter skånsom håndtering af venen med kirurgiske instrumenter og efterlader et tyndt lag af adventitial fedtvæv knyttet til vene. Vi administrerer også en enkelt dosis af aktuel papaverin podede halspulsåren, at forhindre eller omvendt vasospasme, hvilket kunne bidrage til trombose.
Omhyggelig opmærksomhed på kirurgisk teknik er nødvendig under venen podning kirurgi. For at undgå blødning af anastomoser, graft trombose og indførelsen af ukontrolleret hæmodynamiske variabler, skal de to arteriotomies af den rette længde. Hvis en arteriotomy er for kort, vil vene graft ostial væggen være overflødige i stedet for anastomose, skaber huller, der giver mulighed for blødning. Hvis arteriotomy er for lang, stretching vene for at dække arteriotomy vil bringe venen graft vægge i umiddelbar nærhed, hvilket gør det vanskeligt for kirurgen at undgå suturering den indsigende vene graft vægge sammen (hovedsagelig garantere postoperative trombose). Desuden, hvis vene graft lumen er indsnævret fordi venen var spændt for at dække et overdrevent lange arteriotomy, en stenose vil blive oprettet, som øger shear stress, disponerer til trombose33og potentielt ændrer resultatet variabler såsom neointimal vækst og vaskulære remodeling34,35. Derudover er det vigtigt at undgå at indføre drejninger i vene graft, hvilket kan resultere i lumen forsnævring eller abnorme flow. For at undgå vridning af graften, vi altid justere vene segment langs den ventrale overflade af den fælles halspulsåren og sørge for der er ingen drejninger i venen. På grund af potentialet for variable kirurgisk teknik til at ændre vene graft Hæmodynamik, og fordi ændrede Hæmodynamik kan påvirke resultatet variabler uafhængigt af behandlingen, måler vi rutinemæssigt blod flow og graft diameter før vektor infusion og på tidspunktet for høsten. Vi bruger disse værdier til at beregne shear stress og Pulsatilitetsindeks. Vene podninger med hæmodynamiske målinger uden for forudbestemt intervaller kan udelukkes objektivt fra yderligere analyse, faldende eksperimentel variation og øge statistiske effekt.
Som vi har udviklet denne metode, foretaget vi flere ændringer. I første omgang forsøgte vi vene graft genoverførsel i handlingen podning. Men under disse omstændigheder transgen udtryk var næsten helt tabte med 3 dage efter gen overførsel22. Transgenets udtryk blev hurtigt tabt om vene segment var transduced i situ og så podede eller om venen blev podet først, og derefter transduced. Kun ved at forsinke transduktion indtil efter vene graft havde tilpasset den arterielle omsætning (vi ventede indtil 28 dage efter podning for at udføre genoverførsel, selv om en kortere forsinkelse kan være muligt), var den hurtige tab af transgenet udtryk undgås22 . Vi har også konverteret fra nosecone-leveret anæstesi til endotracheal tube-leveret anæstesi til den anden (genoverførsel) kirurgi efter at have oplevet intraoperativ og postoperative dødsfald. Derudover efter støder tilsyneladende aspirationspneumoni i en postoperativ kanin, begyndte vi at placere en lille plast bord over den kanin maven (under de sterile forhæng). Tabellen var placeret for at forhindre, at kirurgen uforvarende hælder på den kanin maven, potentielt stimulere Gastroøsofageal refluks og aspiration. Vi havde ikke mere aspiration begivenheder efter placeringen af tabellen. Men, fordi denne placering faldt sammen med skiftet til endotracheal intubation, vi kan ikke være sikker på intervention er ansvarlig for at fjerne aspiration begivenheder.
Denne metode har også begrænsninger. I USA nødvendiggør brug af kaniner i stedet for gnavere overensstemmelse med kravene i laboratorium animalsk velfærd opføre i 1966. Derfor skal efterforskere ved hjælp af kaniner (eller andre dyr, der er omfattet af denne lov) har veludstyrede operationsstuer og ekspert narkoselæger og giver en høj grad af postoperativ overvågning og pleje. Den anden begrænsning er, at 2 operationer er nødvendige for at sikre vedvarende transgen udtryk22. Den anden kirurgi øger omkostningerne ved eksperimenter og udsætter hver kanin til et ekstra sæt af potentiale udløsende og perioperative komplikationer. Dog er vi ikke klar over enhver anden gen overførsel fremgangsmåde, der opnår holdbare transgen udtryk i vene podninger. Den tredje begrænsning af denne metode er, at det kræver ekspertise i konstruktion af HDAd vektorer og forberedelse af høj-titer HDAd bestande. Mange laboratorier har ekspertise med førstegenerations adenoviral, lentiviral og adeno-associeret virus (AAV) vektorer, men relativt få grupper har erfaring med HDAd og vil typisk være nødvendigt at etablere et samarbejde for at få denne ekspertise. Den kliniske anvendelighed af metoden kan også være begrænset. For mennesker, ville en anden operation øge både omkostninger og komplikation risiko. Desuden, har i forhold til menneskets saphenous vener (anvendes til koronar og perifer bypass operationer), rabbit eksterne jugularis vener meget tynde vægge. Det er muligt, at væggen fortykkelse og remodellering der opstår efter podning en rabbit eksterne halsfedt i det arterielle omsætning vil blive svækket hvis vene graft allerede har en tykkere mur. Endelig, i eksperimenter i denne model op til 6 måneder, ingen af de podede vener udviklet en stenose22. Derfor vises denne metode ikke model alle de biologiske processer, der bidrager til vene graft fiasko.
Til sidst, bruger metoden en robust dyremodel af human vaskulær sygdom (kaniner) til at generere podede vener, transgener er stabilt udtrykt i længere perioder af tid (mindst 6 måneder)22. Stabil udtryk af transgener i vene grafts vil afsløre deres roller i normale vene pode homøostase og vil afklare deres potentiale for vene graft genterapi. Metoden kunne være forbedret og gjort mere klinisk relevant ved udviklingen af teknikker, der tillader perkutan levering af vektorer til vene graft, således at man undgår den anden kirurgi. Disse teknikker kan være kateter-baserede36,37, eller de kunne indarbejde specielt forberedt vektorer, der er tilført en perifer vene og derefter målrettet til vene graft væg, for eksempel ved magnetfelter38. Metoden vil også give mulighed for afprøvning af vektorer end HDAd for genterapi vene graft, herunder lentiviral samt AAV vektorer og ikke-virale vektorer. 39 , 40 , 41 , 42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W.
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
